Immobilisation planaire, l'irradiation partielle, et la transplantation de tissus

L’objectif global de l’expérience suivante est de positionner une population de cellules souches saines à côté de tissu ablateur de cellules souches au sein d’un parian afin d’analyser les comportements des cellules souches et de la descendance in vivo pendant la régénération. Ceci est réalisé en anesthésant et en immobilisant soit un parian irradié non irradié, soit un parian irradié Leafly pour une manipulation ultérieure. Ensuite, le parian non irradié immobilisé est partiellement protégé par du plomb, puis irradié aux rayons X, ce qui produit un parien non blessé avec un tissu ablé par cellules souches juxtaposé au tissu protégé qui reste chargé de cellules souches.

Alternativement, une greffe de tissu prélevée sur un donneur non irradié peut être transplantée dans un hôte précédemment irradié afin de produire un parian avec une population isolée de cellules souches. Fally présent dans une cellule autrement souche. Des résultats d’hôte ablaté sont obtenus qui montrent des populations de cellules souches isolées adjacentes aux tissus ablatés de cellules souches par l’ARN de montage entier in situ deux hybridation pour les gènes marqueurs de cellules souches.

Ainsi, les méthodes décrites ici visent à mieux comprendre les planaires de régénération en étudiant le comportement des cellules souches à la fois dans le paradigme de la transplantation et dans un paradigme d’irradiation partielle, ce qui nous permet de tester si les tissus environnants et les environnements locaux dans lesquels résident ces cellules souches, affectent ou affectent le comportement de ces néoblastes ou cellules souches. Au cours du processus de régénération, un à deux mois avant l’expérience, nourrissez le plin selon le manuscrit ci-joint. Afin d’obtenir la taille souhaitée dans cette démonstration, des pinces d’une longueur d’un à deux centimètres et d’une largeur supérieure à deux millimètres sont sélectionnées.

Ensuite, ils sont affamés trois à sept jours avant d’être utilisés. Ensuite, préparez la solution de Chlorotone un anesthésique local doux en dissolvant 0,1 à 0,2 % en poids par volume de cléone dans l’eau parienne. Ensuite, refroidissez la solution sur de la glace pour la transplantation de tissus avec un bec Bunsen, pliez un tube capillaire de 0,75 millimètre de diamètre intérieur à un à deux centimètres de l’extrémité à un angle de 90 degrés pour couper le tissu greffé.

Ensuite, pliez un autre tube capillaire de 0,7 millimètre de diamètre extérieur à un à deux centimètres de l’extrémité à un angle de 90 degrés pour créer un trou dans l’hôte pour recevoir le greffon. Ensuite, coupez le papier filtre noir watman. Numéro trois, le papier filtre Kim wipe et le papier à rouler pour cigarettes selon les formats indiqués dans le manuscrit ci-joint.

Après cela, préparez la solution Holt Fers modifiée et la solution Holt Fretter saturée de Caine. Réfrigérez-les tous les deux à quatre degrés Celsius. Fixez ensuite une lingette Kim pliée à un carré de Paraform.

Placez-le sur la plaque de refroidissement Peltier ou un autre appareil de refroidissement sous un microscope à dissection. Imprégnez ensuite la lingette Kim d’une solution Holt Fretter réfrigérée. Placez ensuite deux rectangles de papier filtre noir sur la lingette Kim.

Placez maintenant un morceau de papier filtre Watman numéro deux dans une boîte de Pétri. Humidifiez le papier filtre avec la solution Holt Fretter. Ensuite, refroidissez le plat sur de la glace pour une irradiation partielle.

Placez une doublure en papier plus grande dans un plat plus grand, comme pour la transplantation de tissus. Humidifiez le papier filtre avec la solution Holt Fretter. Ensuite, refroidissez le plat sur de la glace.

Dans cette procédure, remplissez une boîte de Pétri avec une solution de cléone réfrigérée. Pipetez les Planaria dans la boîte pour la transplantation. N’anesthésie qu’un seul hôte et un seul donneur à la fois.

Pour l’irradiation partielle, de nombreux animaux peuvent être anesthésiés à la fois. Laissez ensuite le paria tremper dans la solution de cléone pendant cinq à 10 minutes jusqu’à ce qu’il devienne immobile. Rincez les paria en les pipetant dans un plat rempli de solution Holt Fretter réfrigérée.

Après cela, immobilisez la zone de plin en les pipetant sur les papiers filtres noirs saturés de solution Holt fretter réfrigérée. Ensuite, orientez-les face ventrale vers le bas à l’aide d’une paire de pinces. Placez maintenant une boîte de Pétri réfrigérée préparée plus tôt dans un seau à glace qui s’adaptera à l’intérieur d’un irradiateur à rayons X de source supérieure.

Disposez la zone de la plin anesthésiée dans une boîte de Pétri en déplaçant les papiers filtres noirs. Ensuite, transférez-les vers l’irradiateur à rayons X de la source supérieure, placez le seau à glace de manière à minimiser la distance entre le tube cathodique et le paria. Maximisant ainsi le débit de dose efficace.

Positionnez ensuite les écrans de plomb entre le paria et le tube cathodique pour la dose de rayons X. Si l’ablation complète des cellules souches à partir de régions non protégées est souhaitée, administrez 30 gris ou plus. Immédiatement après l’émission de rayons X, transférez le parian dans de l’eau parian réfrigérée.

Après cela, laissez l’eau du parian se réchauffer à température ambiante et les animaux se déloger du papier filtre noir. La procédure d’irradiation partielle est maintenant terminée. Pour commencer cette procédure sous le microscope de dissection, disposez la zone de la plin de l’hôte et du donneur anesthésiée sur des filtres noirs rectangulaires séparés sur la lingette de Kim, qui a déjà été refroidie sur la plaque Peltier ou plus froide.

Utilisez un tube capillaire de 0,75 millimètre de diamètre intérieur pour découper le bouchon de greffe du donneur. Ensuite, utilisez une paire de pinces pour le placer sur une partie à l’écart de l’hôte. Ensuite, utilisez un tube capillaire de 0,7 millimètre de diamètre extérieur pour retirer un bouchon de l’hôte.

Positionnez ensuite le greffon dans le trou. Transférez l’hostie transplantée sur le papier filtre noir rectangulaire dans la boîte de Pétri préparée précédemment. Mouillez un morceau de papier à rouler avec une solution Holt Fretter saturée de Caine.

Placez-le ensuite sur l’hôte transplanté. Ensuite, trempez quatre morceaux de papier filtre enveloppant une solution Holter saturée, et au cas où le sous-marin hôte transplanté tremperait par la suite quatre liasses de solution Holt Fretter saturée. Posez-les sur les papiers filtres.

Après cela, fermez le couvercle. Placez la boîte de Pétri sur de la glace. Transférez ensuite le parian donneur dans l’eau pariienne pour la récupération et la régénération.

Lorsque toutes les greffes sont terminées, placez le parian transplanté dans un incubateur à 10 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, transférez-le dans une boîte de Pétri remplie d’eau de Paris. Laissez le parian se déloger du papier filtre ou retirez-le doucement avec une pince et changez l’eau du parian une fois tous les deux à trois jours par la suite.

L’hybridation in situ par trou chez le parian témoin irradié, mais entièrement blindé, fixée trois jours après l’irradiation, montre une distribution de cellules souches qui est indiscernable de celle du paran de type sauvage. D’autre part, pour le parien qui n’était que partiellement protégé, laissant les parties antérieures et postérieures exposées, les cellules souches semblent être ablées des régions non protégées. Voici les vues dorsale et ventrale d’une parose transplantée avec succès.

Trois jours après la transplantation, le greffon est clairement visible sur les surfaces dorsale et ventrale, et est entouré de tissu non pigmenté caractéristique à l’interface hôte. Cependant, la transplantation infructueuse ne présente aucun tissu greffé visible sur le site de transplantation. L’hybridation in situ de l’ensemble du support a révélé la présence de cellules souches uniquement dans ou autour de l’emplacement de la greffe, ce qui indique le succès de la transplantation une fois maîtrisée.

Les transplantations peuvent être effectuées en aussi peu que cinq minutes chacune. Avec des taux de réussite approchant les 90 à 100 %, l’irradiation partielle peut être considérablement augmentée. En supposant que la taille du champ de votre irradiateur est suffisamment grande.