Name: Caractérisation des mécanismes moléculaires de la In vivo UV induit la cataracte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: Découvrez l'induction de cataractes par rayonnement ultraviolet chez le rat et l'analyse des mécanismes moléculaires par PCR quantitative et immunohistochimie. Cette méthode permet d'étudier l'apoptose dans le cristallin.

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Ce travail a été soutenu par le Karolinska Institutet KID-financement, Autorité suédoise de protection contre les radiations, Karolinska Institutet Eye Research Foundation, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, Saint-Erik Eye Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.

1. L&#39;exposition au rayonnement ultraviolet <ol><li> 15 min avant l&#39;exposition, anesthésier une femelle rat Sprague-Dawley avec un mélange de 90 mg / kg Ketalar (kétamine) et 10 mg / kg Rompun (xylazine) par injection intrapéritonéale. </li><li> Placez l&#39;animal dans un dispositif de contention rat et serrer les courroies jusqu&#39;à l&#39;immobilisation du rat sans provoquer un resserrement du tronc 13. </li><li> Instiller Mydriacyl (tropicamide), 10 mg / ml, dans les deux yeux du rat pour induire une mydriase. </li><li> Placez l&#39;animal de sorte que l&#39;œil on est placé contre un faisceau étroit de rayons UV à 300 nm 14 avec une largeur de 10 nm à mi-hauteur et protéger l&#39;oeil controlatéral avec un ruban noir. </li><li> Exposer le rat unilatéralement de sous-seuil de dose 1 kJ / m 2 rayons UV-B à 300 nm pour 15 min 15. </li></ol> 2. Dissection <ol><li> Après prédéterminé intervalle post-exposition (1, 5, 24 et 120 h), sacrifiez le rat âgé de six semaines (poids &lt;200 g) par carboasphyxie au dioxyde de n et la dislocation des vertèbres cervicales. </li><li> Énucléer les yeux. Par la suite, mettre la cornée de l&#39;oeil vers le bas, jusqu&#39;à la face postérieure. Ensuite, faites un trou minimum en appliquant une canule de calibre 27 et pousser tangentiellement à la sclérotique pour éviter d&#39;endommager la lentille qui est très proche de la sclérotique. Ensuite, utilisez une paire de ciseaux pour couper la chirurgie ophtalmique circonférence juste derrière le limbe jusqu&#39;à ce que la partie postérieure de la sclérotique peut être enlevé. Ensuite, soulevez la lentille avec un forceps émoussé courbes. </li><li> Enlever les restes du corps ciliaire de l&#39;équateur au microscope optique, en maintenant la lentille dans une solution saline équilibrée de pas plus de 5-10 min. </li></ol> 3. RT-PCR quantitative <ol><li> Placez une lentille dans un mélange de 350 pi de tampon de lyse RA1 (NucleoSpin RNA II ARN total kit d&#39;isolement) et 3,5 ul β-mercaptoéthanol dans un tube Eppendorf de 2 ml. </li><li> Maintenir l&#39;objectif dans ce mélange pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Homogénéiser l&#39;objectif avecune aiguille jusqu&#39;à ce que le noyau dur de la lentille est à gauche de la lentille (cortex et la capsule de la lentille sont lysées dans le tampon de lyse). Retirer le noyau du mixage. </li><li> Conserver les échantillons immédiatement à -70 ° C. </li><li> Décongeler les échantillons et de suivre le protocole de &quot;purification d&#39;ARN total à partir de cellules cultivées et des tissus&quot; (NucleoSpin RNA II ARN total kit d&#39;isolement). </li><li> Boutique échantillons d&#39;ARN à -70 ° C. </li><li> Pour vérifier élimination suffisante de l&#39;ADN de chaque échantillon, exécutez une PCR dans les conditions suivantes (étape 1: 95 ° C pendant 2 min; étape 2 pour 40 cycles: 95 ° C pendant 20 sec, 55 ° C pendant 20 sec, 72 ° C pendant 20 s; étape 3: 72 ° C pendant 7 min) avec des amorces d&#39;ADN spécifiques de p53, de l&#39;avant-5&#39;ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 &#39;et 5&#39;-inverse TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3&#39; et la Taq ADN polymérase (dNTPack), en fonction de la fabrication protocole. Le produit attendu PCR est de 243 paires de bases. </li><li> Exécuter une électrophorèse sur gel d&#39;agarose 1,5% pour détecter l&#39;ADN produit de PCR spécifique de 243 paires de bases. Pour préparer1,5% gel d&#39;agarose dans du tampon TBE prendre 3,75 g d&#39;agarose et de le résoudre dans 250 ml de tampon TBE. Ajouter au bromure d&#39;éthidium (0,5 mg / ml) 500 pl dans 500 ml de solution de gel d&#39;agarose 1,5%. Chauffer le mélange dans un four à micro-ondes et remuer pour résoudre le agarose. </li></ol> Aucun des échantillons n&#39;a révélé aucun d&#39;ADN spécifiques des produits de PCR par électrophorèse sur gel d&#39;agarose 1,5%. <ol start="9"><li> Mesurer la concentration des échantillons d&#39;ARN (1 pi) et le rapport de l&#39;absorbance à 260 nm échantillon (ARN) et 280 nm (protéines) dans un NanoDrop ND-1000 spectrophotomètre. Si l&#39;ARN rapport aux protéines du absorbance de l&#39;échantillon d&#39;ARN est de 2,0 ou plus, l&#39;échantillon d&#39;ARN est pur. Si le rapport d&#39;absorbance de l&#39;échantillon d&#39;ARN est inférieur à 2,0, 3,5 refaire ARN étape de purification. </li><li> Prenez un volume d&#39;échantillon d&#39;ARN correspondant à 1 ug et de synthétiser l&#39;ADNc suivant le protocole 1 Kit Strand er synthèse de l&#39;ADNc (1 er volet de synthèse d&#39;ADNc pour kit RT-PCR). </li><li> Conserver les échantillons d&#39;ADNc à -20 ° C(Pour une période de 1 ans voire plus, conserver à -70 ° C). </li><li> Exécuter quantitative PCR en temps réel sur iCycler MyiQ Real Color système unique de détection par PCR en temps. Charge en triple sur une plaque de 96 puits avec 1 échantillon d&#39;ADNc ul, TaqMan Gene Expression Master Mix, essai TaqMan Gene Expression de la caspase 3, selon les instructions pour la fabrication. Charge en triple sur une autre plaque de 96 puits avec 1 échantillon d&#39;ADNc ul, TaqMan Gene Expression Master Mix, essai TaqMan Gene Expression de 18 ans, selon les instructions pour fabriquer TaqMan Gene (Protocole de dosage Expression). Diluer en série d&#39;une fraction d&#39;ADNc à partir de trois choisis au hasard non exposés lentilles. Exécuter des dilutions en série avec l&#39;ADNc à partir d&#39;échantillons dans une plaque de 96 puits. </li><li> Utilisez la méthode de la courbe standard pour la quantification des résultats. Le nombre de cycles de fluorescence de seuil est utilisé en tant que mesure de logiciel MyiQ. Une courbe d&#39;étalonnage exprimant le nombre de cycles au seuil comme fonction de la concentration relative de calibreur est esétabli aux dilutions en série dans chaque plaque. ADNc à partir de trois échantillons non traités lentille a été utilisé pour l&#39;étalonnage. Rapporter le nombre de cycles de seuil pour chaque échantillon à la courbe standard pour obtenir la concentration relative de l&#39;échantillon d&#39;ADNc mesurée. Enfin, obtenir le niveau d&#39;expression des gènes cibles en rapportant la concentration relative de la cible d&#39;ADNc pour les 18 ADNc de contrôle interne. </li></ol> 4. Coloration immunohistochimique <ol><li> Fixation <ol><li> Disséquer l&#39;œil dans du PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7,4). </li><li> Mettez l&#39;oeil dans un tube rempli avec du paraformaldéhyde 4% (PFA) dans le froid de la glace pendant 20 min. Préparer PFA 4% la veille. Stocker à +4 ° C jusqu&#39;à utilisation. PFA est frais pendant environ une semaine. </li><li> Retirer PFA avec une micropipette. Ensuite, laver avec du PBS glacé pendant 20 min. </li><li> Mettez l&#39;œil de saccharose à 30% à +4 ° C pendant la nuit. </li><li> Mettez l&#39;oeil dans une tasse remplie avec la température de coupe optimale (PTOM) à moyenne (Tissue-Tek). Mettez l&#39;œil dans une position appropriée pour la coupe. </li><li> Congeler dans OCT-support de la glace sèche. </li><li> Conserver à -70 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Sectionnement <ol><li> Positionnez l&#39;œil pour cryo-coupe dans un plan approprié. </li><li> Couper trois 5 um d&#39;épaisseur à mi-sagittal articles à partir d&#39;une partie centrale de chaque lentille. Rejeter au moins 6 sections entre les sections successives pour éviter de tacher les mêmes noyaux dans des sections différentes. </li><li> Une fois qu&#39;un article a été coupé, placez délicatement une lame sur le dessus de celui-ci. La section devrait alors s&#39;en tenir à la diapositive. </li><li> Laisser les lames sécher à l&#39;air avant de l&#39;utiliser. Les diapositives peuvent être conservés à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Fluorescence immunohistochimie <ol><li> Laissez échantillons atteindre la température ambiante (5-10 min). </li><li> Dessinez bords autour des spécimens avec un PAP-stylo (Invitrogen). </li><li> Laissez la frontière sec pendant un certain temps (10 min). </li><li> Étiqueter les lames de microscope. </li><li> Réhydrater dans 1 x PBS pendant 15 min. </li><li> Perméabiliser en solution standard de bloc de 30 min. </li><li> Ajouter l&#39;anticorps primaire (anticorps polyclonal de lapin, la caspase-3 clivée anticorps Asp175 9661; Technologie Signalisation cellulaire, Inc) dilué dans une solution de 1:3,000 bloc standard. </li><li> Conserver dans une chambre humidifiée à +4 ° C pendant la nuit. </li><li> Laver dans du PBS par pipetage (3 x 5 min) ou par trempage dans un bain de grande taille (&gt; 15 min, 1-2 changements). </li><li> Ajouter anticorps secondaire (anticorps de lapin anti secondaire avec un spécifique d&#39;absorption / émission de spectre) dilué 1:300 dans la solution de bloc standard. </li><li> Laver dans du PBS par pipetage (3 x 5 min) ou par trempage dans un bain de grande taille (&gt; 15 min, 1-2 changements). </li><li> Essuyez PAP-stylo frottis. </li><li> Stocker dans une chambre humide à température ambiante pendant 3 heures. Éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Ajouter une goutte de Vectashield et placer une lamelle sur la lame. Évitez de faire des bulles. </li><li> Laisser durcir Vectashield (~ 20 min). </li><li> Gardez sections in l&#39;obscurité jusqu&#39;à l&#39;analyse. </li><li> Toutes les sections de commande sont traités en l&#39;absence de l&#39;anticorps primaire. </li><li> Recherchez les résultats dans quelques heures sous un microscope à fluorescence. </li><li> Compter les noyaux des cellules épithéliales chez un arceau latéral nucléaire à arc autre côté de chaque lentille nucléaire. Appliquer le filtre bleu standard pour voir tous les noyaux épithéliales du cristallin en bleu et un filtre standard qui correspond à l&#39;émission de l&#39;anticorps secondaire pour voir la caspase-3 noyaux positifs en vert. </li><li> Notez le nombre de tous les noyaux lentille épithéliale et le nombre de noyaux positifs. Compter les cellules trois fois pour chaque section. </li></ol></li></ol>

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<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cataract+after+repeated+exposure+to+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation.</a> Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).</li>
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<li>Michael, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+repair+of+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation.</a> Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).</li>
<li>Löfgren, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cataract+from+ultraviolet+radiation%22">Cataract from ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).</li>
<li>Ayala, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Influence+of+exposure+patterns+and+oxidation+in+UVR+induced+Cataract%22">Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
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<li>Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+age+and+sex+in+ultraviolet+radiation+cataract+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+exposure+time+for+UV+radiation-induced+cataract%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

<html> Cet article décrit les méthodes qui permettent à étudier les événements moléculaires qui se produisent au cours de rayons UV-B induite par la cataracte. Considérant que la plupart des informations disponibles pour in vivo induite par les rayons UV de la cataracte a été dérivée à partir d&#39;expériences sur les albinos Sprague-Dawley 7, 16, 17, 18, ​​19, nous avons décidé d&#39;utiliser l&#39;albinos Sprague-Dawley rats dans l&#39;étude actuelle. Âge des rats était ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Ketalar </td><td> Pfizer </td><td> 150086 </td><td> 50 mg / ml </td></tr><tr><td> Rompun </td><td> Bayer </td><td> 022545 </td><td> 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Simplex Oculentum </td><td> Apoteket, Suède </td><td> 336164 </td><td> 5 g </td></tr><tr><td> Mydriacyl </td><td> Alcon </td><td> 00352 </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Une solution saline équilibrée </td><td> Alcon </td><td> 0007950055 </td><td></td></tr><tr><td> 3,5 ul β-mercaptoéthanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II ARN total kit d&#39;isolement </td><td> Macherey-Nagel GmbH &amp; Co, Düren, Allemagne </td><td> 740.955,50 </td><td></td></tr><tr><td> des amorces d&#39;ADN spécifiques de p53 </td><td> biomers.net GmbH </td><td> Sur mesure </td><td></td></tr><tr><td> ADN-polymérase Taq, dNTPack </td><td> Roche </td><td> 04 728 866 001 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> Le bromure d&#39;éthidium solution à 0,5 mg / ml </td><td> Sigma </td><td> E1385 </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop ND-1000 spectrophotomètre </td><td> Produits NANODROP </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Volet 1 er synthèse d&#39;ADNc pour kit RT-PCR (AMV) </td><td> Roche Diagnostics GmbH </td><td> 11 483 188 001 </td><td></td></tr><tr><td> iCycler MyiQ Couleur unique réel système de détection par PCR en temps </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td></td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Plaque de 96 puits </td><td> Sarstedt </td><td> 72.1979.202 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Gene Expression Mix Master </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4369016 </td><td></td></tr><tr><td> Essai TaqMan Gene Expression de la caspase 3 </td><td> Applied Biosystems </td><td> Rn00563902_m1 </td><td></td></tr><tr><td> Essai TaqMan Gene Expression pour plus de 18 </td><td> Applied Biosystems </td><td> Hs99999901_s1 </td><td></td></tr><tr><td> MyiQ logiciel </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Caspase-3 clivée (Asp175) </td><td> La technologie de signalisation cellulaire </td><td> 9661 </td><td></td></tr><tr><td> Anti IgG de lapin </td><td> Abcam </td><td> Ab6798 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 84097 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Universal Microscope Axioplan 2 Imaging </td><td> Carl Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 441244 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon TBE 10x </td><td> Promega </td><td> V4251 </td><td></td></tr></tbody></table>

caractérisation des mécanismes moléculaires de la<em&gt; in vivo</em&gt; uv induit la cataracte

Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract

La cataracte est la principale cause de cécité dans le monde 1. L&#39;Organisation mondiale de la santé définit la cataracte comme une opacification du cristallin de l&#39;œil qui empêche le transfert de la lumière. La cataracte est une maladie multifactorielle associée au diabète, le tabagisme, le rayonnement ultraviolet (UV), l&#39;alcool, les radiations ionisantes, les stéroïdes et l&#39;hypertension. Il existe des preuves expérimentales 2-4 et épidémiologique 5,6 que le rayonnement UV provoque la cataracte. Nous avons développé un modèle animal pour les rayons UV B de la cataracte induite dans les deux 7 anesthésiés et non anesthésiés animaux 8. Le seul remède est la chirurgie de la cataracte, mais ce traitement n&#39;est pas accessible à tous. Il a été estimé qu&#39;un délai d&#39;apparition de la cataracte pendant 10 ans pourrait réduire le besoin de chirurgie de la cataracte de 50% 9. Pour retarder l&#39;incidence de la cataracte, il est nécessaire de comprendre les mécanismes de formation de la cataracte et de trouver stratégie de prévention efficacegies. Parmi les mécanismes de développement de la cataracte, l&#39;apoptose joue un rôle crucial dans l&#39;initiation de la cataracte chez les humains et les animaux 10. Notre objectif a récemment été l&#39;apoptose dans l&#39;objectif comme le mécanisme de développement de la cataracte 8,11,12. Il est prévu qu&#39;une meilleure compréhension de l&#39;effet des rayons UV sur la voie de l&#39;apoptose offrira des possibilités pour la découverte de nouveaux médicaments pour prévenir la cataracte. Dans cet article, nous décrivons comment la cataracte peut être induite expérimentalement par l&#39;exposition in vivo au rayonnement UV-B. En outre RT-PCR et immunohistochimie sont présentés comme des outils pour étudier les mécanismes moléculaires des rayons UV-B induite par la cataracte.

Les différentes sources de variation dans les mesures ont été estimés par une analyse de variance et il a été constaté que, compte tenu trois mesures par animal pour les mesures de la variance était de l&#39;ordre de 15% de celui des animaux. Ainsi, compte tenu de l&#39;analyse lentille entière, il n&#39;est pas possible d&#39;augmenter la précision. Test orthogonal élucidé un contraste statistiquement significative de la caspase-3 messages entre 120 intervalle de latence par rapport h des intervalles de latence netteme...

La cataracte est la principale cause de cécité dans le monde. Rayonnement solaire ultraviolet (UV) est le principal facteur de risque pour le développement de la cataracte. Un modèle animal de loin la cataracte rayons UV-B induite a été développé. Dans cet article, nous décrivons les méthodes d&#39;enquête de la formation de la cataracte: l&#39;exposition aux rayons UV, RT-PCR quantitative et immunohistochimie.

Caractérisation des mécanismes moléculaires de la<em&gt; In vivo</em&gt; UV induit la cataracte

La cataracte est la principale cause de cécité dans le monde 1. L'Organisation mondiale de la santé définit la cataracte comme une opacification du cristallin de l'œil qui...

Ce vidéo montre une méthode permettant d'induire des cataractes à l'aide de rayonnement ultraviolet chez le rat. Les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de la cataracte sont ensuite étudiés par PCR quantitative en temps réel et par immunocytochimie. Tout d'abord, l'œil d'un rat est exposé à un rayonnement ultraviolet afin d'induire la formation d'une cataracte.L'autre œil sert de témoin. Ensuite, les lentilles sont disséquées et traitées pour extraire l'ARN afin d'évaluer les niveaux d'expression de CAS B par PCR quantitative en temps réel ou sont colorées à l'aide d'un anticorps dirigé contre la caspase clivée. Trois pour évaluer l'expression et la localisation de la protéine active.En définitive, les résultats de ces tests confirment une augmentation de l'ARNm de la caspase 3 et de l'expression de la protéine active dans le noyau des cellules du cristallin après exposition aux rayons UV. Le principal avantage de ce protocole par rapport aux méthodes existantes réside dans l'utilisation d'une source de rayonnement UV à bande étroite unique et d'un dispositif de contention universel pour rats, ce qui nous permet d'exposer de manière sûre et précise les animaux à un spectre UV et à une dose bien définis. De plus, nous avons appliqué des techniques biologiques modernes, la RT-PCR quantitative et l'immunohistochimie, afin d'étudier l'apoptose dans le cristallin. Cette méthode peut fournir des informations sur les mécanismes moléculaires de la cataracte induite par les rayons ultraviolets.Il peut également être appliqué à d'autres modèles expérimentaux tels que les cancers cutanés induits par les rayons ultraviolets ou les radiations, les neurosciences comportementales chez le rat, et la recherche expérimentale sur l'œil axée sur l'apoptose. Commencez ce protocole en plaçant un rat femelle Sprague dawley anesthésié dans un dispositif de contention pour rat et, sans comprimer le tronc, serrez les sangles jusqu'à immobilisation complète de l'animal. Pour induire une mydriase ou une dilatation de la pupille, instillez une à deux gouttes d'une solution de chlorhydrate de tropicamide à 10 milligrammes par millilitre dans chaque œil.Appliquez ensuite une pommade sur l'œil non exposé et protégez-le avec du ruban adhésif noir afin de bloquer les UV. Placez ensuite l'animal dans le dispositif de contention de manière à ce que l'œil découvert soit positionné pour recevoir un faisceau étroit de rayonnement ultraviolet à 300 nanomètres avec une largeur à mi-hauteur de 10 nanomètres, généré par une lampe à mercure à haute pression. Exposez le rat de façon unilatérale à une dose subseuil de un kilojoule par mètre carré de UVRB pendant 15 minutes après l'exposition.Retirer le ruban de l’œil non exposé et appliquer une pommade sur les deux yeux. Remettre l’animal dans sa cage et le couvrir avec du papier doux pour le maintenir au chaud. Surveiller l’animal jusqu’à ce qu’il ait retrouvé une conscience suffisante pour maintenir une position sterno-abdominale.Ensuite, remettez le rat récupéré dans sa cage avec les autres, à 1, 5, 24 et 120 heures après l'exposition.Placer l’œil énucléé du rat euthanasié, avec la cornée vers le bas et la face postérieure vers le haut, sur un tissu en papier doux. Ensuite, travailler sous un microscope stéréoscopique. Utiliser une canule de calibre 27 pour percer un trou minimal en poussant tangentiellement à la sclérotique afin d’éviter d’endommager le cristallin, qui est très proche de la sclérotique.Ensuite, à l’aide d’une paire de ciseaux destinés à la chirurgie ophtalmique, effectuez une incision circulaire juste en arrière du limbe jusqu’à ce que la portion postérieure de la sclère puisse être soulevée. Puis, à l’aide d’une pince courbe à extrémités émoussées, soulevez le cristallin, placez-le dans une solution saline équilibrée et retirez les vestiges du corps ciliaire adhérents au cristallin. Le cristallin ne doit pas rester dans la solution saline équilibrée plus de 10 minutes.Après la dissection, placer un cristallin dans un tube microcentrifuge de deux millilitres contenant 350 microlitres de tampon de lyse RA du kit d'isolement d'ARN total Nucleo Spin RNA II et 3,5 microlitres d'éthanol de béta-mercaptoéthanol. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Après l'incubation, utiliser une aiguille pour homogénéiser mécaniquement le cristallin jusqu'à ce qu'il ne reste que le noyau dur. Le cortex et la capsule du cristallin seront lysés par le tampon de lyse.Retirez le noyau du mélange et jetez-le. Conservez immédiatement les échantillons à moins 70 degrés Celsius. Les échantillons peuvent être conservés jusqu'à un an avant de poursuivre.Prélevez les échantillons et purifiez l'ARN selon le protocole d'extraction de l'ARN total à partir de cellules cultivées et de tissus fourni avec le kit. Conservez les échantillons d'ARN à moins 70 degrés Celsius. Pour vérifier une élimination suffisante de l'ADN dans chaque échantillon, amplifiez l'ADN à l'aide d'amorces spécifiques de l'ADN P 53 dans les conditions suivantes.Étape 1 : 95 degrés Celsius pendant deux minutes. Étape deux : 40 cycles à 95 degrés Celsius pendant 20 secondes. 55 degrés Celsius pendant 20 secondes.72 degrés Celsius pendant 20 secondes. Étape 3 : 72 degrés Celsius pendant sept minutes. Une fois l'exécution terminée, séparez les produits sur un gel d'agarose à 1,5 %.Pour détecter le produit spécifique d'ADN de 243 paires de bases par PCR, veillez à inclure un échantillon témoin positif et un échantillon témoin négatif. Si l'ADN a été correctement éliminé, aucun produit de PCR ne sera visible. Une bande ne devrait apparaître que dans la piste du témoin positif en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop pour mesurer la concentration des échantillons d'ARN et déterminer le rapport entre l'ARN et les protéines.Si le rapport ARN sur protéine, déterminé par l'absorbance de l'échantillon d'ARN ou le rapport 2 62 80, est égal ou supérieur à 2,0, l'échantillon d'ARN est pur. Ensuite, à l'aide d'un microgramme d'ARN, synthétisez l'ADNc en utilisant un kit de synthèse du premier brin d'ADNc destiné à la RT-PCR, puis conservez les échantillons d'ADNc à −20 degrés Celsius. Ensuite, pour réaliser une PCR quantitative en temps réel, appliquez les échantillons en triple exemplaire sur une plaque de 96 puits.Chaque puits doit contenir un microlitre d'échantillon d'ADNc combiné à l'analyse d'expression génique TAC man pour la caspase-3 sur une plaque distincte. Appliquez les mêmes échantillons, mais en utilisant l'analyse d'expression génique TAC man pour l'ARN 18S. Ensuite, pour générer une courbe standard destinée à l'analyse, effectuez une dilution en série d'un microlitre d'ADNc provenant de trois lentilles non exposées choisies aléatoirement.Effectuez des dilutions sérielles conjointement avec l'ADNc des échantillons. Dans une plaque de 96 puits, sur chaque plaque. Faites centrifuger la plaque, puis exécutez-la sur un système de détection en temps réel I cycler my iq à une couleur.Après l'exécution, à l'aide du logiciel IQ. Établir une courbe standard exprimant le nombre de cycles au seuil en fonction de la concentration relative du calibrateur pour les dilutions sérielles de chaque plaque. Utiliser la courbe standard pour déterminer la concentration relative de l'échantillon d'ADNc mesurée à l'aide du nombre de cycles seuil pour chaque échantillon.Enfin, déterminez le niveau d'expression des gènes cibles en rapportant la concentration relative de l'ADNc cible à celle de l'ADNc du témoin interne 18 s. Pour réaliser une coloration immunohistochimique, disséquez l'œil et placez-le dans du PBS après la dissection. Transférez l'œil dans un tube rempli de paraformaldéhyde à 4 % et incubez sur glace pendant 20 minutes.À l’aide d’une micropipette, retirez le paraformaldéhyde. Ensuite, transférez l’œil dans un tube Eppendorf de deux millilitres contenant un millilitre de PBS glacé et incubez pendant 20 minutes sur de la glace. Puis, transférez l’œil dans un tube Eppendorf contenant du saccharose à 30 %.Incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, utiliser une pince pour transférer l'œil dans un moule rempli de milieu optimal pour la coupe ou de milieu OCT. Placer l'œil en position droite pour la sectionnement.Ensuite, placer le cup sur de la glace sèche pour le congeler à moins 70 degrés Celsius jusqu'à son utilisation afin de couper l'œil pour analyse par microscopie de fluorescence. Commencer par positionner l'œil inclus dans l'OCT sur un porte-échantillon du cryostat pour la cryocoupe. Tenter d'aligner le côté le plus plat du cristallin de l'œil parallèlement au bord du couteau.Découpez trois sections midsagittales de cinq micromètres d'épaisseur à partir d'une portion centrale de chaque cristallin. Jetez au moins six sections entre les sections consécutives afin d'éviter de colorer les mêmes noyaux dans différentes sections. Une fois qu'une section a été coupée, placez délicatement une lame par-dessus.La section doit alors adhérer à la lame. Laisser sécher les lames à l'air avant utilisation. Les lames peuvent être conservées à moins 70 degrés Celsius jusqu'au moment de la coloration.Laisser les lames revenir à température ambiante. Ensuite, réaliser la coloration par anticorps pour identifier la phase trois du CAS clivé, comme décrit dans le document accompagnant, quelques heures plus tard, examiner les lames au microscope à fluorescence. Compter tous les noyaux des cellules épithéliales du cristallin.Enregistrez le nombre de tous les noyaux épithéliaux du cristallin en comptant les cellules marquées au DAPI et le nombre de noyaux positifs pour la caspase-3 en comptant la caspase active. Trois cellules marquées. Comptez les cellules trois fois pour chaque section.La caspase 3 est une protéase majeure impliquée dans la phase d'exécution de l'apoptose. Microscopie électronique en transmission. Des études montrent que le rayonnement ultraviolet induit l'apoptose dans le cristallin.Les études expérimentales sur l'apoptose confirment que la caspase 3 est un marqueur fiable de l'apoptose. Afin de déterminer si l'exposition in vivo aux rayons ultraviolets (UVR) induit l'expression de la caspase 3, l'expression de l'ARNm a été mesurée par QPCR à 1, 5, 24 et 120 heures suivant une exposition in vivo à un kilojoule par mètre carré d'UVR à 300 nanomètres. Le rapport moyen de CASP3, ARNm, par rapport à l'ARN 18S entre le cristallin exposé et le cristallin controlatéral non exposé a ensuite été tracé pour chaque point temporel.Cette figure illustre l'expression de l'ARNm de la caspase trois au fil du temps et démontre la transcription de l'apoptose. Le marqueur caspase trois dans le cristallin in vivo après exposition à un test orthogonal aux rayons U à onde lointaine a révélé une différence statistiquement significative du signal de l'ARNm de la caspase trois entre un intervalle de latence de 120 heures et des intervalles de latence plus courts. L'expression de la caspase trois dans un cristallin exposé et non exposé a également été comparée par microscopie en immunofluorescence, comme le montrent ces images prises 24 heures après l'exposition, les noyaux étant marqués, indiquant la présence de caspase trois active.Cette méthode d'immunomarquage fournit des informations précieuses sur la répartition spatiale des cellules épithéliales marquées par le marqueur d'apoptose caspase trois dans le cristallin. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment induire expérimentalement une cataracte par V-V-U-V-R et étudier le mécanisme moléculaire de la cataracte induite par cinq UVR à l'aide de la RT-PCR quantitative et de l'immunohistochimie.

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