En électroporation in ovo dans Mésencéphale Poussin pour étudier la fonction des gènes dans le développement neurone dopaminergique

Cet essai démontre l'électroporation in ovo du mésencéphale de poulet pour étudier l'effet de l'expression de gènes exogènes sur le développement du mésencéphale et la différenciation des neurones dopaminergiques. Premièrement, injecter le mésencéphale d'embryons de poulet au stade 11 selon la chronologie de Hamburger-Hamilton avec le plasmide ou l'ADN souhaité, afin de cibler spécifiquement l'ADN exogène vers la vésicule mésencéphalique en développement. Ensuite, à l'aide d'électrodes petites et sur mesure, électroporer la vésicule mésencéphalique pour délivrer l'ADN exogène spécifiquement aux progéniteurs neuronaux du mésencéphale.

Ensuite, récolter les embryons au stade 23 présentant une bonne expression de M cherry dans le mésencéphale et générer des sections transversales optimales du mésencéphale. En fin de compte, une analyse par immunomarquage pour des marqueurs de neurones dopaminergiques, tels que la tyrosine hydroxylase, peut révéler la différenciation de progéniteurs neuronaux en neurones dopaminergiques matures induite par l'expression de gènes d'intérêt. Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes existantes d'électroporation in ovo réside dans la capacité de ce protocole à réaliser une électroporation spécifique de la membrane afin d'étudier la différenciation des neurones dopaminergiques.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le développement du cerveau moyen, elle peut également être appliquée à d'autres parties du système nerveux afin d'effectuer des analyses de cartographie du destin cellulaire et d'étudier la régulation de l'expression des gènes. Pour obtenir des embryons au stade 11 de Hamburger et Hamilton, placer chaque œuf fécondé sur le côté et marquer le sommet d'un trait de crayon. Puis placer les plateaux sur un berceau oscillant dans un incubateur préchauffé et humidifié.

Vérifiez l'humidité et le niveau d'eau toutes les 24 heures, 41 heures après la fécondation. Retirez les œufs de l'incubateur et conservez-les à température ambiante. Nettoyez la surface de chaque œuf avec de l'éthanol à 70 % et essuyez.

Placez maintenant deux morceaux de ruban adhésif de quatre centimètres de long côte à côte sur un œuf afin de former un grand rectangle au-dessus du trait de crayon. Lissez le ruban contre l’œuf pour encadrer la fenêtre avec une seringue de 10 millilitres munie d'une aiguille de 18 gauge. Percez la coquille d’œuf en inclinant l’aiguille vers l’extérieur par rapport au jaune afin de ne pas perturber ni endommager l’embryon.

Prélève cinq millilitres d'albumine à partir de l'œuf. Nettoie l'aiguille avec de l'éthanol à 70 %. Sèche l'aiguille avant de percer le prochain œuf.

Entrez les paramètres pour le tireur de micropipettes brun flamboyant. Ensuite, tirez des tubes capillaires à paroi fine pour former des aiguilles d'injection à l'aide d'une pipette P 10. Aspirez cinq à dix microlitres de solution de plasmide dans une microcapillaire à embout long.

Ensuite, chargez lentement l'aiguille en verre en formant une colonne continue sans bulles d'air. Placez l'aiguille chargée dans le porte-aiguille fixé au micromanipulateur et au micro-injecteur. Puis, sous un microscope stéréo, en utilisant un fond sombre pour mieux visualiser l'aiguille, taillez l'aiguille à l'endroit où le liquide vert s'arrête, à l'aide de ciseaux à ressort.

Découpez une fenêtre de deux à deux centimètres et demi de diamètre à partir du trou d'aiguille précédent. Pour extraire l'albumen. Faites tourner l'œuf dans une main tout en découpant.

Pensez à nettoyer les ciseaux avec un essuie-tout imprégné d'éthanol à 70 % entre chaque œuf. Procédez ensuite à l'observation de l'embryon de poulet au microscope stéréoscopique. Si nécessaire, visualisez l'embryon en injectant sous l'embryon de poulet une solution d'encre de Chine à 20 %, filtrée sur un filtre de 0,22 micromètre, dans du PBS. Positionnez l'embryon parallèlement au trajet de l'aiguille, la tête éloignée de l'aiguille.

Percez lentement le tube neural avec un angle de 45 degrés au niveau de la jonction mésencéphale-méthencéphale. Commencez l'injection à l'aide des micro-injecteurs Pico Spritzer avec une durée réglée sur 25 millisecondes. Ajustez le temps en fonction de l'affûtage de l'aiguille, et remplissez uniquement la vésicule neurale représentant le mésencéphale avec l'ADN plasmidique contenant le colorant vert rapide.

Après avoir récupéré l'aiguille d'injection, déposez trois gouttes de solution de pénicilline-streptomycine sur l'embryon. Vérifiez les paramètres du B-T-X-E-M-C eight 30 électroporateur pour une électroporation efficace. À la position du mésencéphale ventral, placez les petites électrodes en platine sur mesure en forme de L au même niveau horizontal que la partie inférieure du tube neural, de sorte que le mésencéphale embryonnaire soit centré entre les deux électrodes.

Appuyez une fois sur l’interrupteur au pied BTX et observez les bulles d’air générées autour des électrodes. Après chaque électroporation réussie, retirez soigneusement les électrodes de l’œuf et essuyez-les. À l’aide d’un chiffon imprégné d’éthanol à 70 %, déposez trois nouvelles gouttes de solution pénicilline-streptomycine sur l’embryon.

Recouvrez maintenant la fenêtre avec un morceau de ruban adhésif transparent de cinq centimètres sur cinq centimètres. Sans toucher le contenu de l'œuf, refermez soigneusement l'œuf, puis replacez les œufs dans l'incubateur avec les tourne-disques éteints. Lorsque le stade souhaité est atteint, récoltez les embryons vivants dans une boîte de Pétri commune remplie de PBS pour chaque condition.

Ensuite, utilisez un microscope de dissection fluorescent. Examinez les embryons récoltés pour détecter l'expression de m-cherry et transférez les embryons positifs dans des puits individuels d'une plaque de 24 puits. Remplissez chaque puits avec un millilitre de paraformaldéhyde 2 % fraîchement préparé et incubez pendant trois heures à quatre degrés Celsius.

Laver les embryons fixés dans du PBS 3 fois, puis placer les embryons dans du saccharose à 15 % jusqu'à ce qu'ils s'immergent après équilibration. Répéter l'équilibration dans du saccharose à 30 %, puis inclure chaque embryon dans du OCT en orientant correctement les embryons afin d'obtenir des coupes transversales optimales du mésencéphale pour les analyses ultérieures.

Préparez des sections de 18 micromètres d'épaisseur au cryostat du mésencéphale épais pour l'analyse en aval dans le cadre du test d'électroporation in ovo du mésencéphale de poulet embryonnaire hh. Des embryons de poulet au stade 11 sont injectés avec un cocktail de plasmides composé du marqueur fluorescent m-cherry, des gènes d'intérêt et d'un traceur coloré au vert rapide permettant de suivre le processus d'injection. Après l'électroporation du mésencéphale, les embryons sont incubés davantage, puis les embryons positifs pour m-cherry sont récoltés, fixés et inclus.

Ensuite, des coupes cryogéniques de mésencéphale sont préparées. Les échantillons sont analysés par immunomarquage à l'aide de marqueurs du mésencéphale, tels que la tyrosine hydroxylase, chez des embryons de poulet correctement injectés et électroporés. L'expression de mCherry est généralement visible dans la région du mésencéphale après un développement ultérieur, en utilisant l'expression de mCherry comme marqueur d'injection.

Les embryons présentant une expression correcte de la protéine m-cherry sont ensuite fixés, inclus et orientés afin de préparer des coupes cryogéniques du mésencéphale. Ici, la spécification du destin dopaminergique des progéniteurs neuronaux électroporés est examinée par la colocalisation de la protéine m-cherry et du gène marqué par un fragment flag avec le marqueur des neurones dopaminergiques, la tyrosine hydroxylase. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment restreindre de manière régionale l'expression génique aux progéniteurs de neurones dopaminergiques du mésencéphale embryonnaire, y compris la manière d'injecter spécifiquement des constructions d'ADN dans la région du mésencéphale, et comment cibler précisément l'électroporation à l'aide d'électrodes petites et sur mesure suivant cette procédure.

D'autres méthodes, telles que le blocage médié par le RNI ou l'expression d'amplificateurs associés à des gènes rapporteurs, peuvent être utilisées pour étudier la fonction génique et la régulation des gènes dans des régions spécifiques et des types cellulaires du système nerveux.