Name: Génération dune ligne Immortalisé microvasculaire murin des cellules endothéliales du cerveau comme un In Vitro Modèle barrière hémato-encéphalique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Découvrez l'isolement et l'immortalisation de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales murines. Cette méthode fournit un modèle in vitro fiable de la barrière hémato-encéphalique pour l'étude des troubles neuro-inflammatoires.

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Cette recherche a été soutenue par la DFG Deutsche Forschungsgemeinschaft sous numéro de subvention FO 315/4-1 et la DFG SFB 688.

1. Isolement des microvaisseaux du cerveau <ol><li> Pour chaque préparation utiliser cinq à dix souriceaux nouveau-nés des deux sexes (3-5 jours). </li><li> Euthanasier une souris selon locaux IACUC / vétérinaire recommandations, retirez immédiatement le cerveau, et le transfert dans une boîte de Petri contenant la solution suivante: 15 mM de HEPES (pH 7,4), 153 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,3 mM de CaCl 2, 2H 2 x O, 2,6 mM de MgCl 2 x 6 H 2 O, 1% (p / v) de BSA (ci-après dénommé tampon A). </li><li> Sauf indication contraire, toutes les procédures d&#39;isolement doit être effectuée à la température ambiante (RT) (22-24 ° C) sous la hotte à flux laminaire. Couper le cerveau (cerveau sans cervelet et le tronc cérébral), après élimination des méninges et des fragments capillaires, dans le tampon A l&#39;aide d&#39;un scalpel stérile. Pipeter le tissu fragmente de haut en bas à l&#39;aide d&#39;une pipette 10 ml jusqu&#39;à ce sans grumeaux apparaissent. Transférer la suspension dans un tube Falcon de 50 ml et centrifuger à 250 xg pendant 5 min à température ambiante. </li></ol> Remarque: Méninges peut être identifié en tant que minces membranes transparentes, à la surface du tissu cérébral. Ils peuvent être soigneusement retiré avec une pince stérile. <ol start="4"><li> Jeter le surnageant. </li><li> Dissoudre le culot dans 4,5 ml de tampon A avec 1,5 ml de 0,75% (p / v) de la collagénase / dispase (Roche) et incuber pendant 45 min à 37 ° C dans un bain d&#39;eau (parfois secouer). </li><li> Pendant ce temps, préparer les plaques à 12 puits par enduction quatre puits avec du collagène IV (0,1 mg / ml dans 50 mM d&#39;acide acétique). Permettre de se conformer pendant 1 heure. </li><li> Arrêtez la digestion par addition de 15 ml de tampon glacé A. Remettre en suspension le culot à fond. </li><li> Centrifuger la suspension à 250 xg pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Pour supprimer la myéline, ajouter 10 ml de 25% (p / v) de BSA (Sigma, pureté&gt; 98%) et centrifuger à 1000 xg pendant 20 min à 4 ° C. 25% de BSA doit être dissoute dans du PBS 1x (PAA Laboratories) et filtré sur 0,2 f umiltre). </li><li> Eliminer délicatement le surnageant, dissoudre le culot dans 10 ml de tampon A et transférer dans un nouveau tube Falcon. </li><li> Centrifuger la suspension à 250 xg pendant 5 min à température ambiante. Le culot résultant contient les cellules endothéliales. </li><li> Laver deux fois le collagène IV-12-enduit et plaque avec du PBS. </li><li> Reprendre le culot dans 4 ml de milieu de culture (DMEM contenant 10% de SVF, 50U/ml pénicilline / streptomycine, 1% de L-glutamine) et la plaque de la suspension cellulaire dans deux puits de 2 ml dans chaque puits. Ajouter la puromycine à une concentration finale de 4 ng / ml et incuber pendant 45 min à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire. Cette étape permet d&#39;éliminer rapidement les cellules adhérentes. Remarque: La puromycine est ajouté pendant 24 heures. Seul le cerveau ECs peuvent le métaboliser, pour d&#39;autres types cellulaires puromycine est toxique 14. </li><li> Transférer le support 2 ml contenant des cellules non adhéré à l&#39;étape 1.14 dans deux puits frais (ces puits contiennent la fraction CE). Remplir les puits avec les cellules collées de step 1,14 avec 2 ml de milieu frais (ces puits contiennent d&#39;autres types cellulaires, par exemple, les fibroblastes, les astrocytes et peut être cultivé en parallèle et utilisés pour les comparaisons de la morphologie). </li><li> Changer le support le jour suivant. </li></ol> 2. Immortalisant les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau <ol><li> Cultiver le GP + E-86 Neo (GPENeo) 15 fibroblastes, sécrétant un virus déficient pour la réplication avec polyome moyen T oncogène dans du milieu DMEM contenant 10% de SVF inactivé par la chaleur, 50U/ml pénicilline / streptomycine et 2 mg / ml de G418 ( . PAA Laboratories) dans des flacons revêtus de gélatine Remarque: polyome milieu de transfection oncogène T provoque avantage de croissance des EC sur les non-ECS conduisant à une monocouche homogène de cellules avec une morphologie endothéliale 4 à 6 semaines de culture. GPENeo ne sont pas disponibles dans le commerce et peuvent être obtenues en tant que matériau public partagé (s&#39;il vous plaît se référer à des publications originales 4,16). </li><li> Pour utiliser le support contenant le virus de<html> immortalisation, cultiver les cellules GPENeo dans un milieu sans G418 pendant 24 h. </li><li> Prélever 10 ml du surnageant et ajouter GPEneo Polybrene (hexadiméthrine bromure) (Sigma) à une concentration finale de 8 pg / ml, stériliser par filtre de 0,45 um pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> Retirez le milieu de croissance des cultures communautaires établis dans la partie 1 et ajouter 2 ml de surnageant GPEneo / Polybrene mélange dans les puits. Répétez cette opération le lendemain avec une nouvelle GPEneo surnageant / Polybrene mélange. Remarque: Polybrene est utilisé pour fabriquer des pores dans la paroi cellulaire afin de faciliter l&#39;infection avec les particules virales). </li><li> Retirer le surnageant GPEneo / Polybrene mélange le lendemain, laver les cellules deux fois avec du PBS et maintenir les cellules dans le milieu de croissance changeantes tous les 3 jours. À la confluence, diviser les cellules de collagène IV 1:2 sur des plaques revêtues. </li><li> En règle générale, stables endothéliales cérébrales lignées cellulaires (cend) doit être obtenu 4-5 semaines plus tard. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Cultiver les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau <ol><li> Décongeler les cellules de cryoaliquot au bain-marie et le transfert dans 15 ml Falcon-avec 10 ml préchauffé à moyen terme. </li><li> Centrifuger la suspension à 250 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Retirer moyen de transférer la pastille dans le collagène IV enduit T flacon de 25 cm2 de culture cellulaire avec un milieu de croissance préchauffé (densité cellulaire pour le placage doit être au moins 1x 10 4 cellules / ml). </li><li> Changer le milieu le lendemain, et après que les cellules ont atteint la confluence (généralement après 5 jours) diviser les cellules. </li></ol> 4. Fractionnement des cellules Cend (Note: Le fractionnement devrait être fait seulement une fois par semaine, éviter l&#39;éclatement supérieur à 1:4). <ol><li> Éliminer le milieu, laver les cellules avec du PBS. </li><li> Ajouter 3 ml d&#39;eau tiède trypsine-EDTA (PAA Laboratories) (T flacon de 75 cm2), incuber à 37 ° C et attendre que la couche des cellules est dispersée (habituellement dans les 5 à 15 minutes). </li><li> Ajouter 5 ml omilieu de croissance f, pipeter de haut en bas, et le transfert à un nouveau collagène IV enduit de ballon. </li></ol> 5. La congélation des cellules cend- <ol><li> Obtenir la suspension cellulaire tel que décrit à l&#39;étape 4 </li><li> Centrifuger la suspension à 250 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension les cellules (obtenu à partir de 1 T 75 cm 2 flacon) culot dans 6 ml milieu de congélation (95% milieu de croissance, 5% DMSO). </li><li> Diviser la suspension cellulaire en quatre 1,5 ml cryo-aliquotes. Remarque: Un cryo-aliquote peut être ensemencées sur T flacon de 25 cm2. </li><li> Conserver les aliquotes cryo-sous azote la température du liquide vapeur. </li></ol> cend milieu de croissance: 450 ml de DMEM, 10% SVF, 10 ml de L-glutamine, 2% MEM-Kit, 2% NEAA, 10 pyruvate natrium ml, 50 U / ml de pénicilline / streptomycine 6. Les résultats représentatifs Les cellules Cend et cerebEND ont été caractérisées par immunomarquages ​​de endothéliale une BBB marqueurs ainsi que par la mesure de la résistance électrique transendothéliale (TEER) et la perméabilité. Le Cend et cerebEND présentaient une morphologie similaire à des cultures primaires de cerveau EC, avec des monocouches de cellules allongées serrées qui présentaient une inhibition de croissance à confluence. Les cellules ont exprimé des niveaux détectables de bien claudine-5, occludine et VE-cadhérine protéines qui ont été localisées au niveau des jonctions cellule-cellule, comme indiqué par immunofluorescence (figure 3) 4,5. CEND cellules en culture en milieu sans sérum réduite conduit à une augmentation de la TEER (à partir de 150 Qcm 2 en présence de 10% de sérum de 500 Qcm 2 en présence de 2% de sérum), qui a été potentialisée par l&#39;ajout d&#39;hydrocortisone (800 Qcm 2) ou de l&#39;insuline (1.000 Qcm 2) 4. Des monocouches de Cend cultivées dans le sérum réduit moyenne pendant 21 jours a TEER de 900 Qcm 2 (figure 4). TEER a été mesurée à l&#39;aide d&#39;un ensemblecontenant des électrodes de passage du courant et de la tension de mesure (World Precision Instruments). A titre de comparaison, le premier micro-vasculaire cérébral EC a été signalé à avoir des valeurs TEER de 200-600 Qcm 2 et une lignée de souris disponible dans le commerce cellule bEnd.3 eu TEER valeurs de 100-140 Qcm 2 (pour revue récente, voir Abbé 2005 et Toth et al., 2011 17,18). En outre, le passage des macromolécules, telles que la non-chargé FITC-dextran des masses moléculaires 4, 10, 70 et 500 kDa, ou la fluorescéine (300 Da) à travers la monocouche de cend en milieu de différenciation 2% de SVF plus de 4 heures a diminué par rapport à des cellules témoins maintenues dans un milieu de croissance contenant 10% de FCS: flux paracellulaire a été réduite à 30% de cellules de contrôle de la fluorescéine, de 26% pour FITC-dextran 10 et 70 kDa, et le flux a été réduit à 4,5% des cellules de contrôle de FITC -dextrtan 500 kDa. Semblable à Teer valeurs, la perméabilité était au plus bas niveau dans les cellules cultivées en présence de glucocorticoids (GC) 4. Dans d&#39;autres études, nous avons identifié les gènes cibles des glucocorticoïdes, occludine, la claudine-5 et VE-cadhérine dans l&#39;endothélium vasculaire cérébral 4,7,9. GC traitement conduit à une augmentation de l&#39;expression de ces protéines et à la transposition de la VE-cadhérine au cytosquelette. La médiation directe GC-régulation des protéines des jonctions serrées occludine et la claudine-5 apparaît à travers des éléments de réponse GC dans leurs régions promotrices 4,7,19. En outre, la claudine-5 a été identifié comme une cible oestrogène roman vasculaire 10 endothélium. Sous-tend la dysfonction endothéliale nombreuses maladies différentes. Nous avons cultivé la cend sous oxygène / glucose privation (AMG) conditions. AMG a conduit à la perturbation de la fonction BBB, ce qui pourrait être reconstitué après un traitement combiné avec GC et inhibiteur du protéasome bortezomib 12. Conditions des autres ministères a conduit à une forte augmentation de la captation du glucose et de l&#39;expression des transpor glucosetres dans cerebEND, qui pourrait être atténué par l&#39;ajout de MK801, un inhibiteur non compétitif de l&#39;récepteur NMDA 13. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> Figure 1. Morphologie des cellules endothéliales microvasculaires du cerveau (CEND) une semaine après l&#39;isolement. Images de microscopie optique ont été prises dans le cadre du 6x (A) et 15x (B) agrandissement. Les colonies île formés de cellules endothéliales sont visibles. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> Figure 2. Morphologie des cellules endothéliales microvasculaires du cerveau (CEND) un mois après l&#39;isolement et l&#39;immortalisation. Images de microscopie optique ont été prises dans le cadre du grossissement 15x. A confluence, monocouche homogène de cellules endothéliales peuvent être observés. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> Figure 3. Microvascul cerveau immortaliséar les cellules endothéliales expriment la claudine-5, occludine et VE-cadhérine. cellules ont été cultivées sur Cend collagène IV recouvertes de lamelles et colorées avec des anticorps contre la claudine-5 (A), occludine (B) et VE-cadhérine (C). Les images ont été prises avec un microscope Zeiss Axioscop2 sous le grossissement de 40x. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> Figure 4. Mesure de la résistance électrique trans-endothéliale (TEER) de Cend monocouche. CEND ont été cultivées sur des filtres de collagène IV transwell-enduits (taille des pores 0,4 um). Après avoir atteint la confluence, les cellules ont été maintenues dans un milieu contenant 2% de FCS. TEER a été mesurée après 7, 14 et 21 à l&#39;aide d&#39;un ensemble contenant des électrodes de passage du courant et de la tension de mesure.

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<li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin%2C+an+endothelial+anticoagulant+protein%2C+is+absent+from+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362(1986).</li>
<li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult.+Scler%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540(2003).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La procédure décrite peut être utilisée pour l&#39;isolement de complications microvasculaires ECs à partir de souches de souris différentes, ainsi que de différentes souches de souris knock-out pour étudier les changements spécifiques dans la fonction endothéliale vasculaire. En tant que méthode d&#39;immortalisation, nous avons utilisé la transformation avec des polyomavirus murin oncoprotéine, Polyome moyen T antigène. Il se transforme rapidement immatures cellules endothéliales in vivo et in vitro 20,21,22. D&#39;autres méthodes d&#39;immortalisation des contraceptifs d&#39;urgence décrites dans la littérature comprennent par exemple l&#39;immortalisation avec antigène T de SV40 grand nombre de virus simien vacuolisante 40 23, produit du gène E1A d&#39;adénovirus 24 ou la surexpression de la sous-unité catalytique de la télomérase humaine 3. L&#39;immortalisation avec PyMT est spécifique pour le murin EC immatures, ce qui permet d&#39;obtenir une culture homogène CE de souriceaux nouveau-nés dans un court laps de temps. Modifie les propriétés immortalisation des cellules et eles résultats obtenus avec e lignées cellulaires immortalisées devraient être comparés soit avec des cellules primaires ou à des expériences in vivo sur des souris. PyMT immortalisé CE a été décrit pour exprimer des niveaux élevés d&#39;activité fibrinolytique accrue résultant de la production de l&#39;urokinase-type plasminogen activator et une diminution de la production d&#39;inhibiteurs de l&#39;activateur du plasminogène 25. La comparaison directe des PyMT immortalisé bEND5 lignée cellulaire avec primaire ECs a révélé que dans les modèles in vitro BBB sont bien adaptés pour les études d&#39;adhérence cellulaire T 26. Les lignées cellulaires établies conformément à la procédure décrite peut être utilisée au nombre de passages bas afin de maintenir les propriétés de barrière par une expression élevée de protéines BBB et CE de jonction, comme les cellules perdent ces propriétés au cours du vieillissement. Ainsi, après la perte de propriétés de barrière, la préparation d&#39;une nouvelle lignée cellulaire doit être envisagé. Densité de placage cellule doit être élevée pour EC, car cela est essentiel pour la prolifération cellulaire. Ceci doit être pris en compte lors de la procédure d&#39;isolement ainsi que la maintenance de la immortalisé EC. Chaque nouvelle lignée cellulaire doit être testé pour ses propriétés de barrière et de contaminants possibles avec d&#39;autres types cellulaires. Monocouches CE peut être teinté avec l&#39;antigène du muscle anti-galactocérébroside, anti-protéine acide fibrillaire gliale et anti-lisse comme anticorps primaires pour exclure la contamination par les oligodendrocytes, les astrocytes et les péricytes 4,27. Afin d&#39;éliminer la contamination par les vaisseaux meningal, l&#39;expression de la thrombomoduline peut être testée, qui est exprimée dans tous les lits vasculaires, à l&#39;exception du cerveau 28. Fait intéressant, les lignées immortalisées de cellules endothéliales microvasculaires isolées à partir de différentes régions du cerveau diffèrent dans leurs propriétés de barrière et la sensibilité aux stimuli pro-inflammatoires. A titre d&#39;exemple, les cérébraux et cérébelleux Cend lignées cellulaires cerebEND peut citer 4,5. CerebEND a montré, en comparaisonà Cend, baisse des niveaux d&#39;expression des principaux composants des jonctions serrées claudine-1 et occludine. Cependant, les niveaux de claudine-3 et -12 ont été plus élevés dans cerebEND. La fonction de barrière de cellules cerebEND beaucoup plus souffert sous un traitement avec le médiateur inflammatoire, le TNF que les propriétés de barrière de cellules Cend fait 5. Vulnérabilité supérieur du cervelet à des stimuli inflammatoires, peuvent être observés in vivo chez les patients de sclérose en plaques et dans son modèle animal expérimental encéphalomyélite auto-immune 29. Ces résultats intéressants montrent la nécessité de produire et de caractérisation individuelle des modèles in vitro pour les différentes régions du cerveau, afin d&#39;améliorer le ciblage futur médicament dans le cerveau.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Pureté&gt; 98% </td></tr><tr><td> collagène IV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5533 </td><td> 50 pg / ml dans 50 mM d&#39;acide acétique </td></tr><tr><td> Collagénase / dispase </td><td> Roche </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modifié Eagle (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal (FCS) </td><td> Laboratoires AAP </td><td> A15110-1333 </td><td> concentration finale 10%, inactivé à la chaleur (30 min à 56 ° C) </td></tr&gt; <tr><td> L-glutamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> Stockage: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> MEM Vitamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> Stockage: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Na-pyruvate </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> Néomycine (G418) </td><td> Laboratoires AAP </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> Acides aminés non essentiels (AEN) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> Stockage à 4 ° C </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> Stockage: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrène (hexadiméthrine bromure) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 107689 </td><td> 0,8 mg / ml dans du PBS, un stockage à -20 ° C </td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0,05%, 0,02% d&#39;EDTA dans du PBS </td></tr></tbody></table>

génération d&#39;une ligne immortalisé microvasculaire murin des cellules endothéliales du cerveau comme un<em&gt; in vitro</em&gt; modèle barrière hémato-encéphalique

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Les cellules épithéliales et endothéliales (CE) sont la construction de barrières paracellulaires qui protègent le tissu de l&#39;environnement externe et interne. La barrière hémato-encéphalique (BHE) constituée des CE, astrocytes finaux pieds, péricytes et la membrane basale est responsable de la protection et de l&#39;homéostasie du parenchyme cérébral. Dans les modèles in vitro BBB sont des outils communs pour étudier la structure et la fonction de la BHE au niveau cellulaire. Un nombre considérable de différents modèles in vitro BBB ont été établis pour la recherche dans différents laboratoires à ce jour. Habituellement, les cellules sont obtenues à partir de bovins, porcins, les tissus du cerveau de rat ou de la souris (examinée en détail dans la revue de Wilhelm et al. 1). Échantillons de tissus humains ne sont disponibles que dans un nombre restreint de laboratoires ou d&#39;entreprises 2,3. Alors que les préparatifs de cellules primaires prennent du temps et les cultures communautaires peuvent varier d&#39;un lot à l&#39;autre, la mise en place d&#39;immortalisé CE lines est le centre d&#39;intérêt scientifique. Ici, nous présentons une méthode pour établir un cerveau immortalisé endothéliales des microvaisseaux du cerveau de souris en ligne néonatale. Nous décrivons la procédure étape par étape, la liste des réactifs et des solutions utilisées. La méthode établie par notre laboratoire permet l&#39;isolement d&#39;une ligne homogène de cellules immortalisées endothéliales dans les quatre à cinq semaines. Les lignes de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau appelée Cend 4 (à partir de cortex cérébral) et cerebEND 5 (à partir de cortex cérébelleux), ont été isolées selon cette procédure dans le laboratoire Förster et ont été effectivement utilisés pour l&#39;explication des différents processus physiologiques et pathologiques au Bureau. Utilisation Cend et cerebEND nous avons démontré que ces cellules répondent aux glucocorticoïdes et d&#39;oestrogènes 4,6-9-traitement 10 ainsi que de pro-infammatory médiateurs, comme le TNFalpha 5,8. En outre, nous avons étudié la pathologie de multiples sclerosis 11 et 12,13 hypoxie sur l&#39;échelon communautaire. Le Cend et lignes cerebEND peut être considéré comme un bon outil pour étudier la structure et la fonction de la BHE, les réponses cellulaires d&#39;ECS à différents stimuli ou de l&#39;interaction de la CE avec des lymphocytes ou des cellules cancéreuses.

Cette méthode décrit comment isoler et d&#39;immortaliser les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de souris. Nous décrivons un protocole étape par étape à partir de l&#39;homogénéisation du tissu cérébral, phases de digestion, l&#39;ensemencement et l&#39;immortalisation des cellules. Habituellement, cela prend environ cinq semaines pour obtenir un ensemble homogène, immortalisé ligne de cellules endothéliales microvasculaires.

Génération d&#39;une ligne Immortalisé microvasculaire murin des cellules endothéliales du cerveau comme un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle barrière hémato-encéphalique

Les cellules épithéliales et endothéliales (CE) constituent des barrières paracellulaires qui protègent les tissus de l'environnement externe et interne. Le...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir une culture homogénéisée de cellules endothéliales cérébrales immortalisées. Cela est réalisé en premier lieu par l'isolement des cerveaux de souris néonatales et l'obtention d'une suspension cellulaire unique. La deuxième étape consiste à immortaliser les cellules à l'aide de l'antigène T intermédiaire du polyomavirus.Ensuite, les cellules croissent pendant environ quatre semaines jusqu'à la formation d'une monocouche endothéliale homogène. La dernière étape consiste à caractériser la nouvelle lignée cellulaire à l'aide de techniques telles que la coloration immunohistochimique, le Western blot et la Q-Q-P-C-R. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des troubles cérébraux neuroinflammatoires ou ischémiques, car des évaluations précliniques des traitements et des éclairages sur la physiopathologie peuvent être obtenus.Le Dr. Elaine Salvador, postdoctorante de mon laboratoire, démontrera la procédure. Après avoir retiré le cerveau d'une souris néonatale âgée de trois à cinq jours et transféré dans une boîte de Pétri contenant le tampon A, les cerveaux de cinq à dix souris sont nécessaires pour chaque préparation, en travaillant sous une hotte à flux laminaire. Retirer le cervelet, le tronc cérébral, les méninges et les fragments capillaires de chaque cerveau.Transférez ensuite les cerveaux dans une deuxième boîte de Pétri contenant le tampon A. À l’aide d’un scalpel stérile, découpez les cerveaux en petits morceaux, puis utilisez une pipette de 10 millilitres pour aspirer et expulser le tissu et le tampon jusqu’à ce qu’aucun agrégat ne soit visible. À ce stade, transférez la suspension dans un tube à centrifuger de 50 millilitres après avoir centrifugé le tissu cérébral à 250 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Jetez le surnageant et dissolvez le culot dans 4,5 millilitres de tampon A contenant 1,5 millilitres de 0,75 % poids par volume.Le collagénase disperse. Incuber le tissu et la solution de collagénase pendant 45 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius avec une agitation occasionnelle. Pendant ce temps, préparer les plaques de culture cellulaire en recouvrant quatre puits d'une plaque de 12 puits avec une solution stérile de 0,1 milligramme par millilitre.Le collagène quatre et l'acide acétique à 50 millimolaires permettent au collagène d'adhérer aux puits à température ambiante pendant une heure. Une fois le temps d'incubation de 45 minutes écoulé, arrêter la digestion du tissu cérébral en ajoutant 15 millilitres de tampon A, puis resuspendre complètement le culot dans cette solution. Ensuite, centrifuger à 250 fois G pendant 10 minutes et jeter le surnageant.Ensuite, pour éliminer la myéline de la préparation, ajouter 10 millilitres de BSA stérile à 25 % poids par volume dans du PBS au tissu et centrifuger à 1000 ×g pendant 20 minutes à 4 °C. Après la centrifugation, jeter soigneusement le surnageant, puis dissoudre le culot dans 15 millilitres de tampon A et transférer dans un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres. Recentrifuger à 250 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Pendant ce temps, laver la plaque revêtue de collagène IV deux fois avec du PBS.Après le deuxième lavage, laissez deux des puits vides et ajoutez deux millilitres de milieu de croissance dans les deux autres puits. Après avoir éliminé le surnageant, resuspendez le culot cellulaire, composé principalement de cellules endothéliales, dans quatre millilitres de milieu de croissance contenant quatre microgrammes par millilitre de puromycine, puis répartissez deux millilitres de la suspension cellulaire dans chacun des deux puits vides revêtus de collagène. Incubez à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes afin d'éliminer les cellules non endothéliales adhérentes rapidement. Ensuite, aspirez le milieu de croissance des deux puits ne contenant pas de cellules et jetez-le.Ensuite, transférez le milieu contenant les cellules non adhérentes, y compris la fraction de cellules endothéliales, dans ces deux puits. Remplissez à nouveau les puits précédents avec deux millilitres de milieu frais. Ces puits contiennent d'autres types cellulaires tels que les fibroblastes et les astrocytes, et peuvent être cultivés en parallèle pour des comparaisons de la morphologie.Incuber les cellules toute la nuit dans l’incubateur de culture tissulaire le lendemain. Remplacer par du milieu frais et cultiver les fibroblastes GPE neo, qui sécrètent un virus déficient pour la réplication portant l’oncogène T intermédiaire de polyoma, dans des flacons revêtus de gélatine contenant GPE neomed. La transfection par l’oncogène T intermédiaire de polyoma confère un avantage de croissance aux cellules endothéliales par rapport aux cellules non endothéliales, conduisant à une monocouche homogène de cellules présentant une morphologie endothéliale. Après quatre à six semaines de culture, les cellules GPE neo ne sont pas disponibles commercialement et peuvent être obtenues comme matériel public partagé.Après avoir cultivé les GPE Neo Fiberblast pendant 24 heures, retirez 10 millilitres du milieu et ajoutez une solution stérile de poly brain à une concentration finale de huit microgrammes par millilitre. Faites passer le mélange de surnageant à travers un filtre de 0,45 micron afin d'éliminer tous les fragments cellulaires. Aspirez maintenant le milieu des cultures de cellules endothéliales et ajoutez deux millilitres du mélange de surnageant enrichi en poly brain dans les puits après une incubation nocturne.Répétez cette procédure le lendemain avec un nouvel aliquot du mélange poly cérébral de surnageant. Éliminez le mélange poly cérébral de surnageant. Lavez les cellules deux fois avec du PBS, puis ajoutez du milieu de croissance frais.Continuer à changer le milieu de croissance tous les trois jours lorsque les cellules deviennent confluentes. Passager les cellules à un ou deux sur des plaques revêtues de collagène. Des lignées cellulaires endothéliales cérébrales stables sont généralement obtenues après quatre à cinq semaines de culture ultérieure.Lorsqu'une monocouche endothéliale homogène recouvre entièrement le puits. Une fois les lignées cellulaires stables obtenues, transférez les cellules dans des flacons de culture tissulaire revêtus de collagène IV et passez-les au maximum une fois par semaine à l'aide de trois millilitres de trypsine-EDTA, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq à 15 minutes, jusqu'à dispersion de la couche cellulaire. Après l'ajout de cinq millilitres de milieu, ensemencez les nouveaux flacons et évitez de diviser à un ratio supérieur à 1:4.Une fois qu'il y a suffisamment de cellules pour obtenir un flacon T 75 confluant, des cryo-ampoules de cellules peuvent être préparées pour une utilisation ultérieure. Pour ce faire, récoltez les cellules avec la trypsine comme précédemment, puis centrifugez la suspension cellulaire à 250 ×g pendant cinq minutes. À température ambiante, resuspendez le culot cellulaire dans six millilitres de milieu de congélation, puis pipetez 1,5 millilitre de la suspension cellulaire dans quatre cryotubes.Placer les cryotubes dans un contenant de congélation Nalgene rempli d'isopropanol et les conserver pendant un jour à moins 80 degrés Celsius. Enfin, stocker les cryotubes sous azote liquide. Faire fondre la cryo-ampoule de cellules dans un bain-marie, puis les transférer dans un tube de centrifugation de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu de croissance.Préchauffer le milieu à 37 degrés Celsius et centrifuger le tube à 250 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir aspiré le milieu, resuspendre le culot dans un volume approprié de milieu de croissance. Transférer la suspension cellulaire dans un flacon de culture de 25 cm² revêtu de collagène IV contenant du milieu de croissance préchauffé.La densité cellulaire pour la mise en culture doit être d'au moins un fois dix puissance quatre cellules par millilitre. Changez le milieu le lendemain et continuez à repiquer les cellules comme précédemment lorsque les cellules atteignent la confluence, environ cinq jours plus tard ; lorsque les cellules sont prêtes, mettez-les en culture à la densité souhaitée pour vos expériences ultérieures. Les cellules de type C ont été caractérisées par immunomarquage des marqueurs endothéliaux et de la barrière hémato-encéphalique.Cette image montre la morphologie des cellules C et la coloration immunohistochimique pour la claine cinq. Les cellules C présentent une morphologie similaire à celle des cultures primaires de cellules endothéliales cérébrales, avec des monocouches de cellules allongées étroitement jointives qui exhibent une inhibition de la croissance. En dessous de la confluence, les cellules expriment des niveaux détectables de claine.Ici, les cellules C CN ont été immunomarquées avec un anticorps dirigé contre l'occludine. Nous observons l'expression des protéines VE-cadhérine, localisées au niveau des jonctions entre cellules, comme illustré par coloration en immunofluorescence. La résistanceélectrique transendothéliale a été mesurée à l'aide d'un dispositif comprenant des électrodes de passage de courant et de mesure de tension.On peut observer sur cette figure que la résistance électrique transendothéliale des cellules C augmente avec le temps en culture après leur développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer les troubles cérébrovasculaires dans un modèle murin.

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Création de modèles humains de la barrière hémato-encéphalique (BHE) peut bénéficier des recherches sur les conditions du cerveau associées à l'échec du Bureau. Nous décrivons ici une technique améliorée pour la préparation d'un modèle de BBB de contact, ce qui permet de co-culture d'astrocytes humains et les cellules endothéliales du cerveau sur les côtés opposés d'une membrane poreuse.

Amélioration de la méthode pour la préparation d&#39;une base de cellules humaines, Contactez modèle de la barrière hémato-encéphalique

Le but de la présente étude était de valider la reproductibilité d'un modèle in vitro du Bureau impliquant un rat syngénique de co-culture de cellules endotheliales et les astrocytes. La monocouche de cellules endothéliales présenté TEER haute et basse perméabilité LY. L'expression de protéines spécifiques TJ, les réponses fonctionnelles de l'inflammation et de la fonctionnalité des transporteurs et récepteurs ont été évalués.

Mise en place d&#39;un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle de Rat barrière hémato-encéphalique (BHE): un regard sur le Bureau imperméabilité et de transport médié par le récepteur

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Isolement de cellules primaires murins cerveau endothéliales microvasculaires

Ici, nous décrivons un modèle murin in vitro de la barrière hémato-encéphalique qui utilise la spectroscopie cellulaire d’impédance, en mettant l’accent sur les conséquences sur l’intégrité et la perméabilité des cellules endothéliales lors de l’interaction avec les cellules T activées.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hémato-encéphalique utilisant la spectroscopie d&#39;impédance: un regard sur T Cell-endothélial cellulaire Interaction

Le maintien de la couverture de la barrière hémato-encéphalique est la clé de l'homéostasie du système nerveux central. Ce protocole décrit des techniques in vitro pour délimiter les processus fondamentaux et pathologiques qui modulent la couverture de la barrière hémato-encéphalique.

Essais in vitro pour évaluer la formation et la perturbation du vaisseau en forme de barrière de sang-cerveau

L’objectif du protocole est de présenter une procédure optimisée pour la création d’un modèle barrière hémato - encéphalique (BHE) in vitro basé sur les cellules endothéliales cérébrales porcines primaires (pBECs). Le modèle montre reproductibilité élevée, grande étanchéité et est adapté pour des études de transport et trafic intracellulaire en découverte de médicaments.

Procédé amélioré pour la création d’un In Vitro barrière hémato - encéphalique modèle basé sur les cellules endothéliales du cerveau porcin

La barrière hémato-encéphalique humaine empêche sélectivement la pénétration des molécules hydrophiles et des agents pathogènes dans le cerveau. Plusieurs pathologies, y compris la méningite et le délire postopératoire, sont associées à une perméabilité accrue de la barrière hémato-encéphalique. Ici, nous décrivons un modèle de culture cellulaire endothéliale pour tester la perméabilité de barrière par traversal microbien.

Analyse de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique par traversale microbienne à travers les cellules endothéliales microvasculaires

La barrière hémato-encéphalique (BBB) est une unité neurovasculaire multicellulaire régulant étroitement l’homéostasie cérébrale. En combinant les iPSC humains et les technologies d’organes sur puce, nous avons généré une puce BBB personnalisée, adaptée à la modélisation des maladies et aux prédictions de pénétrabilité des médicaments du SNC. Un protocole détaillé est décrit pour la génération et l’exploitation de la puce BBB.

Génération d’une puce de barrière de sang-brain basée sur iPSC

Ce protocole détaille une méthode adaptée pour dériver, étendre, et cryopréserver des cellules endothéliales microvasculaires de cerveau obtenues en différeciant les cellules souches pluripotentes induites par l’homme, et pour étudier des propriétés de barrière de cerveau de sang dans un modèle ex vivo.

Dérivation, expansion, cryopréservation et caractérisation des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Un protocole est présenté pour l’isolement et la culture primaire de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMEC) à partir de tissu cérébral murin néonatal, afin de générer un modèle in vitro robuste pour étudier la fonction de la barrière hémato-encéphalique dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Isolement et culture des cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de souris

Découvrez l'isolement et l'immortalisation de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales murines. Cette méthode fournit un modèle in vitro fiable de la barrière hémato-encéphalique pour l'étude des troubles neuro-inflammatoires.

Génération dune ligne Immortalisé microvasculaire murin des cellules endothéliales du cerveau comme un In Vitro Modèle barrière hémato-encéphalique (Vidéo) | JoVE Journal

Génération d'une ligne Immortalisé microvasculaire murin des cellules endothéliales du cerveau comme un

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