Génération d'une ligne Immortalisé microvasculaire murin des cellules endothéliales du cerveau comme un

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir une culture homogénéisée de cellules endothéliales cérébrales immortalisées. Cela est réalisé en premier lieu par l'isolement des cerveaux de souris néonatales et l'obtention d'une suspension cellulaire unique. La deuxième étape consiste à immortaliser les cellules à l'aide de l'antigène T intermédiaire du polyomavirus.

Ensuite, les cellules croissent pendant environ quatre semaines jusqu'à la formation d'une monocouche endothéliale homogène. La dernière étape consiste à caractériser la nouvelle lignée cellulaire à l'aide de techniques telles que la coloration immunohistochimique, le Western blot et la Q-Q-P-C-R. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des troubles cérébraux neuroinflammatoires ou ischémiques, car des évaluations précliniques des traitements et des éclairages sur la physiopathologie peuvent être obtenus.

Le Dr. Elaine Salvador, postdoctorante de mon laboratoire, démontrera la procédure. Après avoir retiré le cerveau d'une souris néonatale âgée de trois à cinq jours et transféré dans une boîte de Pétri contenant le tampon A, les cerveaux de cinq à dix souris sont nécessaires pour chaque préparation, en travaillant sous une hotte à flux laminaire. Retirer le cervelet, le tronc cérébral, les méninges et les fragments capillaires de chaque cerveau.

Transférez ensuite les cerveaux dans une deuxième boîte de Pétri contenant le tampon A. À l’aide d’un scalpel stérile, découpez les cerveaux en petits morceaux, puis utilisez une pipette de 10 millilitres pour aspirer et expulser le tissu et le tampon jusqu’à ce qu’aucun agrégat ne soit visible. À ce stade, transférez la suspension dans un tube à centrifuger de 50 millilitres après avoir centrifugé le tissu cérébral à 250 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Jetez le surnageant et dissolvez le culot dans 4,5 millilitres de tampon A contenant 1,5 millilitres de 0,75 % poids par volume.

Le collagénase disperse. Incuber le tissu et la solution de collagénase pendant 45 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius avec une agitation occasionnelle. Pendant ce temps, préparer les plaques de culture cellulaire en recouvrant quatre puits d'une plaque de 12 puits avec une solution stérile de 0,1 milligramme par millilitre.

Le collagène quatre et l'acide acétique à 50 millimolaires permettent au collagène d'adhérer aux puits à température ambiante pendant une heure. Une fois le temps d'incubation de 45 minutes écoulé, arrêter la digestion du tissu cérébral en ajoutant 15 millilitres de tampon A, puis resuspendre complètement le culot dans cette solution. Ensuite, centrifuger à 250 fois G pendant 10 minutes et jeter le surnageant.

Ensuite, pour éliminer la myéline de la préparation, ajouter 10 millilitres de BSA stérile à 25 % poids par volume dans du PBS au tissu et centrifuger à 1000 ×g pendant 20 minutes à 4 °C. Après la centrifugation, jeter soigneusement le surnageant, puis dissoudre le culot dans 15 millilitres de tampon A et transférer dans un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres. Recentrifuger à 250 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Pendant ce temps, laver la plaque revêtue de collagène IV deux fois avec du PBS.

Après le deuxième lavage, laissez deux des puits vides et ajoutez deux millilitres de milieu de croissance dans les deux autres puits. Après avoir éliminé le surnageant, resuspendez le culot cellulaire, composé principalement de cellules endothéliales, dans quatre millilitres de milieu de croissance contenant quatre microgrammes par millilitre de puromycine, puis répartissez deux millilitres de la suspension cellulaire dans chacun des deux puits vides revêtus de collagène. Incubez à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes afin d'éliminer les cellules non endothéliales adhérentes rapidement. Ensuite, aspirez le milieu de croissance des deux puits ne contenant pas de cellules et jetez-le.

Ensuite, transférez le milieu contenant les cellules non adhérentes, y compris la fraction de cellules endothéliales, dans ces deux puits. Remplissez à nouveau les puits précédents avec deux millilitres de milieu frais. Ces puits contiennent d'autres types cellulaires tels que les fibroblastes et les astrocytes, et peuvent être cultivés en parallèle pour des comparaisons de la morphologie.

Incuber les cellules toute la nuit dans l’incubateur de culture tissulaire le lendemain. Remplacer par du milieu frais et cultiver les fibroblastes GPE neo, qui sécrètent un virus déficient pour la réplication portant l’oncogène T intermédiaire de polyoma, dans des flacons revêtus de gélatine contenant GPE neomed. La transfection par l’oncogène T intermédiaire de polyoma confère un avantage de croissance aux cellules endothéliales par rapport aux cellules non endothéliales, conduisant à une monocouche homogène de cellules présentant une morphologie endothéliale. Après quatre à six semaines de culture, les cellules GPE neo ne sont pas disponibles commercialement et peuvent être obtenues comme matériel public partagé.

Après avoir cultivé les GPE Neo Fiberblast pendant 24 heures, retirez 10 millilitres du milieu et ajoutez une solution stérile de poly brain à une concentration finale de huit microgrammes par millilitre. Faites passer le mélange de surnageant à travers un filtre de 0,45 micron afin d'éliminer tous les fragments cellulaires. Aspirez maintenant le milieu des cultures de cellules endothéliales et ajoutez deux millilitres du mélange de surnageant enrichi en poly brain dans les puits après une incubation nocturne.

Répétez cette procédure le lendemain avec un nouvel aliquot du mélange poly cérébral de surnageant. Éliminez le mélange poly cérébral de surnageant. Lavez les cellules deux fois avec du PBS, puis ajoutez du milieu de croissance frais.

Continuer à changer le milieu de croissance tous les trois jours lorsque les cellules deviennent confluentes. Passager les cellules à un ou deux sur des plaques revêtues de collagène. Des lignées cellulaires endothéliales cérébrales stables sont généralement obtenues après quatre à cinq semaines de culture ultérieure.

Lorsqu'une monocouche endothéliale homogène recouvre entièrement le puits. Une fois les lignées cellulaires stables obtenues, transférez les cellules dans des flacons de culture tissulaire revêtus de collagène IV et passez-les au maximum une fois par semaine à l'aide de trois millilitres de trypsine-EDTA, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq à 15 minutes, jusqu'à dispersion de la couche cellulaire. Après l'ajout de cinq millilitres de milieu, ensemencez les nouveaux flacons et évitez de diviser à un ratio supérieur à 1:4.

Une fois qu'il y a suffisamment de cellules pour obtenir un flacon T 75 confluant, des cryo-ampoules de cellules peuvent être préparées pour une utilisation ultérieure. Pour ce faire, récoltez les cellules avec la trypsine comme précédemment, puis centrifugez la suspension cellulaire à 250 ×g pendant cinq minutes. À température ambiante, resuspendez le culot cellulaire dans six millilitres de milieu de congélation, puis pipetez 1,5 millilitre de la suspension cellulaire dans quatre cryotubes.

Placer les cryotubes dans un contenant de congélation Nalgene rempli d'isopropanol et les conserver pendant un jour à moins 80 degrés Celsius. Enfin, stocker les cryotubes sous azote liquide. Faire fondre la cryo-ampoule de cellules dans un bain-marie, puis les transférer dans un tube de centrifugation de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu de croissance.

Préchauffer le milieu à 37 degrés Celsius et centrifuger le tube à 250 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir aspiré le milieu, resuspendre le culot dans un volume approprié de milieu de croissance. Transférer la suspension cellulaire dans un flacon de culture de 25 cm² revêtu de collagène IV contenant du milieu de croissance préchauffé.

La densité cellulaire pour la mise en culture doit être d'au moins un fois dix puissance quatre cellules par millilitre. Changez le milieu le lendemain et continuez à repiquer les cellules comme précédemment lorsque les cellules atteignent la confluence, environ cinq jours plus tard ; lorsque les cellules sont prêtes, mettez-les en culture à la densité souhaitée pour vos expériences ultérieures. Les cellules de type C ont été caractérisées par immunomarquage des marqueurs endothéliaux et de la barrière hémato-encéphalique.

Cette image montre la morphologie des cellules C et la coloration immunohistochimique pour la claine cinq. Les cellules C présentent une morphologie similaire à celle des cultures primaires de cellules endothéliales cérébrales, avec des monocouches de cellules allongées étroitement jointives qui exhibent une inhibition de la croissance. En dessous de la confluence, les cellules expriment des niveaux détectables de claine.

Ici, les cellules C CN ont été immunomarquées avec un anticorps dirigé contre l'occludine. Nous observons l'expression des protéines VE-cadhérine, localisées au niveau des jonctions entre cellules, comme illustré par coloration en immunofluorescence. La résistanceélectrique transendothéliale a été mesurée à l'aide d'un dispositif comprenant des électrodes de passage de courant et de mesure de tension.

On peut observer sur cette figure que la résistance électrique transendothéliale des cellules C augmente avec le temps en culture après leur développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer les troubles cérébrovasculaires dans un modèle murin.