L'induction de signaux d'adhésion dépendant de l'aide ultrasons à faible intensité

L’objectif général de cette procédure est de comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels les ultrasons pulsés de faible intensité ou lipo influencent la migration cellulaire et accélèrent ainsi la réparation des tissus. Ceci est accompli en traitant d’abord les cellules avec de la cyclo-heide pendant deux heures pour empêcher l’expression de novo de la protéine et donc l’autostimulation des cellules. La deuxième étape de la procédure consiste à étaler les cellules détachées pendant deux heures sur des surfaces qui ont été recouvertes d’un ligand matriciel soigneusement défini.

La troisième étape consiste à stimuler les cellules avec des ultrasons par gel en couplant les plaques de culture cellulaire aux émetteurs d’ultrasons. Les résultats peuvent montrer des changements dans la formation de l’adhésion focale en raison de la stimulation par ultrasons via des cellules de coloration pour la culline et l’actine et des changements temporels dans l’activation du rack un par le biais du RAC actif un, du test de traction vers le bas et de la floraison occidentale ultérieure. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation d’adhésion, telles que la manipulation physique des cellules peut-elle se substituer à des stimuli chimiques tels que les facteurs de croissance ou l’actine de fibrine ?

Et comment cette manipulation physique initie-t-elle la migration cellulaire ? Les implications de cette technique s’étendent au traitement des plaies chroniques, car en comprenant comment les ultrasons peuvent affecter le comportement cellulaire, nous pourrions être en mesure d’affiner les traitements pour accélérer la fermeture des plaies chez les personnes présentant des défauts de cicatrisation des plaies, telles que les personnes âgées ou les patients diabétiques. Pour les tests biochimiques, enduire directement les puits de plaques de plastique de 3,5 centimètres avec un ligand d’intégrine.

Pour l’immunofluorescence, le couvercle en verre bouilli se glisse trois fois dans de l’eau milli Q. Ensuite, placez quatre lamelles de recouvrement dans chaque plaque de 3,5 centimètres, dérivatisez les lamelles de recouvrement en verre pour assurer un revêtement efficace du ligand en ajoutant deux millilitres A un millimolaire de sulfamide MBS à chacun, laissez bien la réaction se poursuivre pendant 30 minutes à température ambiante, puis lavez les surfaces dérivées trois fois avec du PBS. Enduisez maintenant le verre dérivé de deux millilitres de ligand d’intégrine.

Ajoutez le ligand dans chaque puits et incubez les plaques pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain, préparez du BSA monoparticulaire en chauffant 1 % BSA, dissous dans du PBS à 85 degrés Celsius pendant 13 minutes. Laisser refroidir puis passer à travers un filtre de 0,45 micron. Tout d’abord, lavez les surfaces recouvertes de ligand trois fois avec du PBS et bloquez ensuite les surfaces avec le BSA monoparticulaire préparé pendant 30 minutes.

Pour contrôler l’environnement matriciel tout au long de l’expérience, la synthèse des protéines doit être bloquée par un ajout de 25 microgrammes par millilitre de cyclo-heide à 80 % de fibroblastes confluents pendant deux heures. Rincez les cellules traitées à la cyclo-heide avec du PBS, trissez les cellules et granulez les cellules. Mettre à nouveau en suspension les cellules dans une solution A-D-M-E-M à une concentration finale de 10 000 cellules par millilitre à l’aide d’un hémocytomètre.

Incuber maintenant les cellules remises en suspension à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, rincez les plaques trois fois avec du PBS avant de semer deux millilitres de suspension cellulaire dans chacune. Eh bien, laissez les cellules s’étendre pendant deux heures à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone commencent par réchauffer le réseau d’émetteurs à ultrasons et couplant le gel.

Une fois réchauffé, appliquez une goutte de gel de couplage de la taille d’un pois sur chaque émetteur pour vérifier si chaque émetteur est fonctionnel. À l’aide d’un détecteur à diodes indicateurs à ultrasons, laissez le gel coupler l’émetteur au détecteur. Si l’émetteur est fonctionnel, le DDE s’allumera.

L’appareil a des paramètres fixes et délivrera des ultrasons à 1,5 mégahertz pulsés à un kilohertz, délivrant une intensité de 30 milliwatts par centimètre carré. L’appareil se désactivera automatiquement au bout de 20 minutes. Placez les puits sur le réseau d’émetteurs, retournez le réseau dans un incubateur et laissez la température s’équilibrer pendant 10 minutes, allumez le signal ultrasonore au niveau de l’alimentation.

Le signal des ultrasons se désactivera au bout de 20 minutes. Imiter le régime thérapeutique si des temps de stimulation plus courts sont nécessaires. Les plaques peuvent être retirées du réseau au moment opportun.

Des points pour des temps de stimulation plus longs, des plaques doivent être laissées sur le réseau et laissées se développer. L’émetteur pourrait être redémarré, mais nous n’avons vu aucun avantage supplémentaire lorsque nous l’avons fait. Dans tous les cas, des plaques non stimulées doivent être utilisées comme contrôle négatif.

Pour l’analyse de la formation de l’adhérence focale, appliquez un signal ultrasonore de 20 minutes sur des lamelles revêtues de S, puis incubez-les pendant 40 minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius. Cela permet aux adhérences focales de se développer. Ensuite, aspirez les médias.

Appliquez deux millilitres de fixateur et attendez 14 minutes. Retirez le fixateur par aspiration et rincez soigneusement les cellules trois fois avec du PBS. Appliquez le PBS le long du bord du puits et gonflez doucement la solution.

Une fois rincé, transférez chaque lamelle du puits de 3,5 centimètres sur une plaque de 24 puits pour une coloration immunofluorescente ultérieure. Après la période de stimulation souhaitée, aspirez le milieu et rincez les cellules avec du PBS sur des cellules de glace lysa dans le tampon de lyse approprié pour votre test biochimique préféré. Nous analysons généralement une activation par un test de traction effecteur.

En particulier, cette méthode pourrait être utilisée pour l’analyse biochimique de n’importe quelle voie de signalisation. Dans ce protocole, nous décrivons l’induction des adhérences focales vinky et colorées et de l’activité RAC one par ultrasons pour les expériences d’adhésion focale. La position de base est que les fibroblastes répartis sur un ligand d’intégrine alpha cinq bêta un ne forment pas finkel et ne contiennent pas d’adhérences à moins qu’un deuxième récepteur de connexion de fibroïne du syndicat quatre ne soit engagé par l’ajout d’un ligand soluble.

Cependant, la stimulation par ultrasons induit la formation d’une adhésion focale dans la même mesure que l’engagement de syncom quatre, ce qui indique que la stimulation par ultrasons peut se substituer à certains composants de la voie de signalisation de l’indépendance du col de la fibrine. En tant que développement du test de base, nous montrons la même expérience répétée avec des fibroblastes dépourvus d’INDICUM quatre. Ces fibroblastes répondent toujours à l’échographie, mais ne répondent pas au ligand quatre d’INDICUM.

Cela démontre que les ultrasons peuvent en effet contourner le besoin de certains récepteurs de fibres et de fibres. Pour l’expérience biochimique, nous démontrons que les ultrasons peuvent induire l’activation de RAC one à l’aide d’un test de traction : la précipitation de RAC actif 1, 0, 10, 30 et 60 minutes après le début de la stimulation par ultrasons révèle que l’activité de RAC one atteint un pic à 10 à 30 minutes avant de revenir à la ligne de base. Les lysats de pétrole brut pour cullin assurent une charge équivalente entre les points temporels.

Le résultat ressemble à l’activation de RAC un par l’engagement du syndicat quatre, mais est légèrement plus prolongé que l’activation par la fibronectine. Par conséquent, huit à 10 répétitions sont généralement nécessaires pour obtenir des données significatives. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’éliminer les stimuli stu supplémentaires en bloquant complètement la synthèse des protéines avec la cyclo-heide, en évitant de contaminer les milieux de culture dans l’expérience et en évitant le surpeuplement des cellules qui entraîne des contacts cellulaires Suite à cette procédure.

D’autres méthodes, comme les tests de blessure par égratignure, peuvent être utilisées pour poser des questions supplémentaires telles que : comment les ultrasons déclenchent-ils la migration cellulaire ?