Name: Linduction de signaux dadhésion dépendant de laide ultrasons à faible intensité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Découvrez comment l'ultrason pulsé de faible intensité induit la formation d'adhésions focales et l'activation de Rac1 dans les fibroblastes. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la réparation tissulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été soutenu par le Wellcome Trust 088419 subvention pour MDB et le parrainage par Smith &amp; Nephew UK Ltd

1. Surfaces de revêtement avec un ligand Matrice <ol><li> L&#39;échographie sera appliquée à des cellules dans 3,5 cm de puits, soit que des plats individuels ou en tant que plaque à 6 puits. Pour les dosages biochimiques, manteau ligand directement sur le plastique. Pour immunofluorescence, le verre ébullition Lamelles trois fois dans de l&#39;eau MilliQ et le lieu 4 lamelles dans le fond de chaque puits. </li><li> Les surfaces vitrées doivent être transformés en dérivés pour assurer revêtement ligand efficace. Dissoudre sulfo-m-maléimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester dans du PBS à 1 mM. Ajouter 2 ml à chaque puits et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Laver les surfaces dérivés 3 fois avec du PBS. </li><li> Manteau soit verre ou en plastique non traité dérivé avec un ligand d&#39;intégrine. Appliquer 2 ml de 10 ug / ml intégrine ligand9, dissous dans du PBS contenant du Ca 2 + et Mg 2 + dans chaque puits et incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Préparer monoparticulate BSA par chauffage BSA 1%, dissous dans du PBS, à 85 ° C pendant 13 minutes. Permettrepour refroidir, puis passer à travers un filtre de 0,45 um. </li><li> Laver ligand surfaces revêtues de 3 fois avec du PBS et le bloc avec le BSA monoparticulate pendant 30 minutes. </li></ol> 2. Préparation des cellules <ol><li> Pour contrôler l&#39;environnement matriciel tout au long de l&#39;expérience, la synthèse des protéines doit être bloquée par addition de 25 pg / ml de cycloheximide à 80% des fibroblastes confluentes pendant 2 heures. </li><li> Rincer cycloheximide cellules traitées avec du PBS et se détacher de la fiole de culture en utilisant 0,5 mg / ml de trypsine / EDTA. </li><li> Cellules individuelles de récolte par centrifugation à 500 xg pendant 5 minutes. </li><li> Resuspendre les cellules dans DMEM/25 HEPES, 25 pg / ml de cycloheximide. </li><li> Compter densité de cellules de la suspension en utilisant un hémocytomètre et diluer à 105 ml-1. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant 20 minutes pour récupérer l&#39;intégrine surface. </li><li> Rincer les ligand-couché, BSA-bloqués puits 3 fois avec du PBS. </li><li> Graine 2 ml de la suspension cellulaire dans chaque puits. </li><li> Allow cellules de se propager pendant 2 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 3. Stimulation ultrasons <ol><li> Réchauffez le tableau émetteur d&#39;ultrasons et de gel de couplage à 37 ° C. </li><li> Appliquer une goutte taille d&#39;un pois de gel de couplage à chaque émetteur. </li><li> Tester ce que chaque émetteur est fonctionnel en utilisant un détecteur à diode ultrasons indicateur. </li><li> Placez les puits sur le réseau d&#39;émetteurs. Retourne un tableau à 37 ° C, température de 5% de CO 2 et laisser s&#39;équilibrer pendant 10 minutes. </li><li> Allumez le signal ultrasonore. </li><li> Le signal ultrasonore se désactive après 20 minutes, imitant le régime thérapeutique. Si les temps de stimulation plus courts sont nécessaires, les plaques doivent être supprimés du tableau à l&#39;endroit approprié en temps des points. Dans tous les cas utiliser des plaques non stimulées comme contrôle négatif. </li></ol> 4. Analyse Focal Adhesion par immunofluorescence <ol><li> Pour une analyse de la formation d&#39;adhésion focale, appliquer le signal ultrasonore de 20 minuteset puis permettre aux structures de développer pendant 40 minutes supplémentaires par le maintien des cellules à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Aspirer des médias et réparer les cellules en appliquant 2 ml de paraformaldéhyde 4% dans du PBS. Incuber pendant 14 minutes à température ambiante. </li><li> Aspirer le paraformaldéhyde et rincer trois fois avec du PBS, l&#39;application de la PBS doucement vers le bas le bord du puits pour éviter la production de forces de cisaillement. </li><li> Transférer chaque lamelle de 3,5 cm des puits dans une plaque à 24 puits pour immunofluorescence ultérieure. </li><li> Étancher paraformaldéhyde résiduelle par application de 0,5 ml à 0,1 M de glycine dans du PBS à chacun des 24 puits. Incuber pendant 20 minutes à température ambiante. </li><li> Aspirer la glycine et rincer trois fois avec du PBS. </li><li> Perméabiliser les cellules par application de 0,5 ml à 0,5% de Triton X-100 (p / v) dans du PBS. Incuber pendant 4 minutes à température ambiante. </li><li> Aspirer Triton X-100 et rincer trois fois avec du PBS. </li><li> Bloquer par application de 0,5 ml 3% (p / v) de BSA dans du PBS. Incuber une nuit à 4 &amp; dpar exemple; C. </li><li> Colorer vinculine contenant adhésion focale avec hVIN-1 anticorps dilué 1:400 dans le bloc de BSA. Incuber pendant une heure à température ambiante. </li><li> Rincer trois fois avec du PBS. </li><li> Appliquer fluorophore (DyLight 488) conjugué anticorps secondaire (dilué 1:200) et l&#39;actine tache avec TRITC-conjugué phalloïdine (dilué 1:200) dans le bloc de BSA. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Rincer trois fois avec du PBS, et une fois avec de l&#39;eau. </li><li> Monter sur une lame de verre dans une position inversée à l&#39;aide Prolongez milieu de montage d&#39;or. </li></ol> 5. Quantification de Rac1 Activation par pull-down test <ol><li> Pour l&#39;analyse de Rac1 activation, appliquez le signal ultrasonore de 20 minutes pour les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2. Lors de l&#39;évaluation des temps de réponse de plus de 20 minutes, appliquer le signal à ultrasons pour 20 minutes et maintenir les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 pour le temps restant pour permettre à la réponse à se développer. </li><li> Aspirer les médias et le lieu ainsis sur la glace. Rincer les puits avec 2 ml de PBS froid et d&#39;aspiration. Assurez-vous tout résidu PBS est éliminé en laissant les puits inclinés pendant 1 minute puis par aspiration approfondie. </li><li> Lyse des cellules sur la glace avec 35 ul de tampon de lyse (10% de glycérol, 20 mM HEPES pH 7,4, 140 mM NaCl, 1% NP40, désoxycholate de sodium 0,5%, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 × inhibiteur de la protéase complète) par puits. Dans cet exemple, 6 puits sont utilisés par point de temps pour générer ul 210 du lysat cellulaire. Puits plus ou moins peut être utilisé mais le volume total de lysat devraient totaliser ~ 200 pi. </li><li> Gratter les cellules à fond avec grattoir à cellules pour assurer la lyse cellulaire complète et laisser les puits incliné pendant 1 minute pour permettre lysat à la piscine. </li><li> Transfert à un lysat glacée de 1,5 ml microtube (mise en commun de lysats régime de traitement même) et de spin au 21000 × g pendant 2 minutes à 4 ° C pour obtenir un culot cellulaire de débris. </li><li> Transfert 180 ul de lysat pour glacée de 1,5 ml microtubes contenant 130 ul de tampon de lyse et 25 pi PAK-glutathione billes d&#39;agarose 10. Gardez en restant lysat brut à -20 ° C pour la séparation de gel ultérieur. </li><li> Capturez Rac1 actif sur les billes d&#39;agarose PAK-glutathion par la rotation des tubes pendant 40 minutes à 4 ° C. </li><li> Récolte d&#39;agarose cordon conjugue par centrifugation à 2000 xg pendant 1 minute à 4 ° C. </li><li> Lavage bourrelet conjugués trois fois avec un tampon de lyse 500 pi, la récolte des perles par centrifugation à 2000 x g et rejeter le surnageant, après chaque lavage. Retirez soigneusement le tampon de lyse restante de lavage avec une pipette 200 pi. </li><li> Éluer chaque échantillon en ajoutant 35 pi de tampon de chargement SDS-PAGE et incuber à 85 ° C sur un bloc de chauffage sous agitation pendant 5 minutes. Retirer billes par centrifugation à 21000 xg pendant 1 minute. </li><li> Résoudre éluat talon par SDS-PAGE, transfert à la nitrocellulose et de la sonde pour Rac1. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Dans ce protocole, nous décrivons l&#39;induction de la vinculine-tacheed adhésions focales et Rac1 activité par l&#39;échographie. Pour l&#39;expérience d&#39;adhésion focale, la position de référence est que les fibroblastes, réparties sur un ligand de α 5 β 1-intégrine ne forment pas vinculine contenant adhérences (fig. 3A) à moins qu&#39;une seconde récepteur de fibronectine, syndécane-4, est engagé par addition d&#39; ligand soluble (Fig. 3B) 3,4. Toutefois, la stimulation avec des ultrasons induit la formation d&#39;adhésion focale dans la même mesure que l&#39;engagement de syndécane-4 (Fig. 3C), indiquant que la stimulation par ultrasons peut se substituer à certains composants de la voie de signalisation dépendante de la fibronectine 5. Le principal obstacle à ce protocole est d&#39;éliminer la formation d&#39;adhésion focale, en l&#39;absence de stimulant. L&#39;inhibition incomplète de la synthèse protéique par la cycloheximide permettra dépôt de matrice qui est suffisant pour les cellules à l&#39;auto-stimulation. Le surpeuplement des cellules peut aussi conduire à de bas niveau d&#39;adhésion focale formation et une mauvaise réponse à l&#39;échographie que la diaphonie entre la cellule-cellule et cellule-matrice contacts va compliquer une expérience qui est conçu pour isoler un seul stimulus. En tant que développement de l&#39;analyse de base, nous montrons la même expérience, répétée avec des fibroblastes dépourvus de syndécane-4 (Fig. 4). Ces fibroblastes continuent de répondre aux ultrasons (figure 4C), mais ne parviennent pas à répondre à syndécane-4 ligand (Fig. 4B). L&#39;expérience à l&#39;aide SDC4 - / - fibroblastes montre que les ultrasons peuvent en effet contourner la nécessité pour les récepteurs de fibronectine certains, et illustre comment le protocole simple peut être mis au point pour obtenir des informations supplémentaires sur la voie de signalisation. Pour l&#39;expérience biochimique, nous démontrons que les ultrasons peuvent induire l&#39;activation de Rac1, en ​​utilisant un dosage déroulant qui est une adaptation de la méthode décrite par Del Pozo et al. 10. La précipitation des actifs Rac1 0, 10, 30 et 60 minutes après iniciation de la stimulation par ultrasons révèle que les pics d&#39;activité à Rac1 10-30 minutes, avant de revenir à la ligne de base (Fig. 5). Buvard lysats pour vinculine assure un chargement équivalent temps entre les points. Le résultat ressemble à l&#39;activation de Rac1 par l&#39;engagement de syndécane-4 3, mais est légèrement plus longue que l&#39;activation par la fibronectine. Par conséquent 8-10 répétitions sont généralement nécessaires pour obtenir des données significatives. L&#39;activation de Rac1 est responsable de l&#39;engagement des cellules à la formation d&#39;adhésion focale, et naissantes adhésions focales commencent à se former à 10-30 minutes, coïncidant avec Rac1 activation. Une fois lancé, ces adhérences qui continuent à mûrir dans les plaques d&#39;adhérence grandes figures 3 et 4. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig1.jpg" /> Figure 1. La forme d&#39;onde ultrasonore. Ultrasons comprend une intermittente 1,5 MHz signal de qu&#39;en raison de faible amplitude (30 mW / cm &lt;sup&gt; 2, la moyenne spatiale, temporelle moyenne) n&#39;a pas d&#39;effet de chauffage. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig2.jpg" /> Figure 2. Représentation schématique du flux de travail pour la préparation et la stimulation des cellules avec des ultrasons. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig3.jpg" /> Figure 3. Induction échographie de la formation d&#39;adhésion focale dans les fibroblastes. Fibroblastes sont réparties sur le fragment d&#39;intégrine de liaison de la fibronectine (A) avant la stimulation par le fragment syndécane-4-liaison de la fibronectine (B) ou d&#39;ultrasons (C). Après 60 minutes de stimulation, les cellules ont été fixées, colorées pour vinculine et de l&#39;actine, et imagées par épifluorescence. Bar = 10 um. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig4.jpg" /> Figure 4. Induction échographie de la formation d&#39;adhésion focale dans les fibroblastes dépourvus de syndécane-4. <em&gt; SDC4 - / - fibroblastes sont réparties sur le fragment d&#39;intégrine de liaison de la fibronectine (A) avant la stimulation par le fragment syndécane-4-liaison de la fibronectine (B) ou d&#39;ultrasons (C). Après 60 minutes de stimulation, les cellules ont été fixées, colorées pour vinculine et de l&#39;actine, et imagées par épifluorescence. Bien que SDC4 - / - fibroblastes étaient fibronectine insensible à la casse, l&#39;échographie reste induit la formation d&#39;adhésion focale, ce qui indique que l&#39;échographie contourne l&#39;engagement du récepteur de la matrice. Bar = 10 um. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig5.jpg" /> Figure 5. L&#39;activation de Rac1 par ultrasons. Les cellules ont été stimulées pendant quelques minutes de 0, 10, 30 et 60 avec 6 puits utilisés par point dans le temps. Le montant de GTP-Rac1 présents dans les échantillons à partir d&#39;un Rac1 déroulant bien sûr le temps de dosage a été visualisée par incubation avec des anticorps anti-Rac1 anticorps sur un western blot (image du haut). La quantification de l&#39;intensité de la bande (moyenne de 8-10 répétitions) révèle une augmentation de Rac1ctivité résultant de signal ultrasonore à 10 et 30 minutes, avant de revenir aux niveaux de référence à 60 minutes (graphique). Les barres d&#39;erreur représentent sem

<ol><li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+syndecan-4+hair+trigger+initiates+wound+healing+through+caveolin-+and+RhoG-regulated+integrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis.</a> Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).</li>
<li>Echtermeyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+wound+repair+and+impaired+angiogenesis+in+mice+lacking+syndecan-4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4.</a> J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).</li>
<li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-4-dependent+Rac1+regulation+determines+directional+migration+in+response+to+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix.</a> J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).</li>
<li>Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+and+cytoskeletal+organisation+of+fibroblasts+in+response+to+fibronectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments.</a> Embo. J. 5, 665-670 (1986).</li>
<li>Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+ultrasound+bypasses+canonical+syndecan-4+signaling+to+activate+rac1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1.</a> J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).</li>
<li>Claes, L., Willie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enhancement+of+bone+regeneration+by+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Biophys.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The enhancement of bone regeneration by ultrasound.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).</li>
<li>Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+tibial+fracture-healing+by+non-invasive%2C+low-intensity+pulsed+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).</li>
<li>Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+healing+of+distal+radial+fractures+with+the+use+of+specific%2C+low-intensity+ultrasound.+A+multicenter%2C+prospective%2C+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).</li>
<li>Danen, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+the+synergy+site+for+cell+adhesion+to+fibronectin+depends+on+the+activation+state+of+integrin+alpha+5+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).</li>
<li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).</li>
<li>Makarem, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+binding+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+and+the+HepII%2FIIICS+domain+of+fibronectin+to+the+integrin+alpha+4+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).</li>
</ol>

Andrew Harrison est un employé de Smith &amp; Nephew UK Limited.

Dans ce protocole, nous décrivons la méthode par laquelle un traitement qui est normalement appliqué à des patients humains peut être utilisé dans la cellule à base d&#39;expériences. Le but ultime est de comprendre le mécanisme moléculaire d&#39;action des ultrasons afin que la thérapie peut être affinée. Dans ce protocole, nous utilisons fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) comme un système cellulaire modèle, mais l&#39;échographie a été également été trouvé pour être efficace dans des fibroblastes primaires de prépuce humain 5, les cellules souches mésenchymateuses, les ostéoblastes et les chondrocytes 6. Nous utilisons Rac1 activation comme un test biochimique par exemple, mais la méthode pourrait être utilisée aussi pour tester la réglementation de la phosphorylation de protéines ou la formation de complexes protéiques par immunoprécipitation. Pour l&#39;exemple par immunofluorescence, nous démontrons une échographie effet sur la formation d&#39;adhésion focale, mais la redistribution de toute molécule pourrait être examinée. Par exemple, on peut tester le recrutement de facteurs cytosoliques à la membrane plasmique, colocalisation de proteins dans des vésicules de trafic ou d&#39;examiner l&#39;effet des ultrasons sur l&#39;organisation du fuseau mitotique. Jusqu&#39;à présent, nous avons limité nous de tester la fibronectine voies dépendantes, par l&#39;effet des ultrasons sur les cellules de collagène, ou en présence de facteurs de croissance pourrait être testé afin de dresser un tableau de la façon dont l&#39;échographie affecte le comportement des cellules dans un environnement complexe que plus ressemble à une situation in vivo. Un plus grand défi consistera à tester l&#39;effet des ultrasons à l&#39;aide imagerie time-lapse, où la présence de l&#39;émetteur qui bloque le chemin de lumière et les vibrations des ultrasons supplémentaires présents obstacles techniques. Cependant, le fait que l&#39;application thérapeutique nécessite seulement 20 minutes de stimulation par jour suggère que l&#39;analyse du comportement des cellules après une salve de stimulation pourrait bien être productif.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> sulfo-m-maléimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester </td><td> FisherPerbio </td><td> PN22312 </td><td> 25 titres mM dissous dans l&#39;eau peuvent être stockés à -20 ° C </td></tr><tr><td> 6-même plaque de culture tissulaire </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td> Plastique à partir d&#39;autres sociétés peuvent recouvrir mal </td></tr><tr><td> Lamelle de verre de 13 mm </td><td> Distributeur de fournitures scientifiques de laboratoire Ltd.SLS </td><td> MIC3336 </td><td> En verre à partir d&#39;autres sociétés peuvent recouvrir mal </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, Ca 2 + Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> 50K intégrine ligand (fragment de fibronectine) </td><td> Construire la description et préparation en 9, 11 </td><td></td><td> Alternative ligands de la matrice peut être utilisé pour interroger d&#39;autres voies </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3059 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> Sigma </td><td> C7698 </td><td> Peut être stockées sous forme de stock de 10mg/ml dans l&#39;eau </td></tr><tr><td> DMEM/25 HEPES </td><td> Sigma </td><td> D6171 </td><td></td></tr><tr><td> Exogen 4000 + </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel de couplage échographie </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SAFHS indicateur </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hVIN-1 </td><td> Sigma </td><td> V9264 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488-conjugué anti-souris </td><td> Stratech scientifique </td><td> 715-485-150 </td><td></td></tr><tr><td> TRITC marqué phalloïdine &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P1951 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongez réactif antifading Or </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> inhibiteur de protéase intégral (EDTA) </td><td> Roche </td><td> 056 489 001 </td><td> 100 × boursier composé de comprimé stocké à -20 ° C </td></tr><tr><td> PAK-glutathion billes d&#39;agarose </td><td> Construire la description et la préparation en 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Pêcheur </td><td> G/0650/17 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Apollo scientifique </td><td> BI8181 </td><td> Faire de stock 1M et le pH à 7,4 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pêcheur </td><td> S/0160/65 </td><td></td></tr><tr><td> NP40 </td><td> Sigma </td><td> I3021 </td><td></td></tr><tr><td> Désoxycholate de sodium </td><td> Sigma </td><td> D6750 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;induction de signaux d&#39;adhésion dépendant de l&#39;aide ultrasons à faible intensité

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

Dans les organismes multicellulaires, le comportement des cellules est dictée par des interactions avec la matrice extracellulaire. Conséquences de la matrice de l&#39;engagement du large de la réglementation de la migration et la prolifération cellulaire, la sécrétion d&#39;une différenciation et même. Les signaux sous-tendant chacun de ces processus complexes proviennent des interactions moléculaires de la matrice extracellulaire des récepteurs sur la surface de la cellule. Les intégrines sont des récepteurs prototypes et de fournir un lien mécanique entre la matrice extracellulaire et le cytosquelette, ainsi que de lancer certaines de les cascades de signalisation dépendantes de l&#39;adhérence. Cependant, il est de plus en plus évident que d&#39;autres récepteurs transmembranaires fonctionner en parallèle avec les intégrines de réglementer tant l&#39;intégrine elle-même et des signaux en aval. Le plus élégant de ces exemples est le protéoglycane transmembranaire, le syndécane-4, qui coopère avec α β 1-5 au cours de l&#39;intégrine adhérence à la fibronectine. Dans les modèles in vivo demonstrmangé l&#39;importance de syndécan-4 de signalisation, comme syndécane-4-souris déficientes en protéine présentent un retard de guérison due à la migration des fibroblastes 1,2 inefficace. En animaux de type sauvage, la migration des fibroblastes vers une plaie est déclenchée par l&#39;apparition de la fibronectine que les fuites de capillaires endommagés et est déposé par les macrophages dans le tissu lésé. Par conséquent, il ya un grand intérêt à découvrir des stratégies qui améliorent la fibronectine-dépendantes de signalisation et pourrait accélérer le processus de réparation. Les composants de l&#39;intégrine-médiées et syndécane-4-médiée de fibronectine-dépendantes de signalisation peuvent être séparés par des cellules de stimulation avec des fragments de fibronectine recombinant. Bien que l&#39;engagement de l&#39;intégrine est essentielle pour l&#39;adhésion cellulaire, la fibronectine certains signaux dépendants sont réglementés par le syndécane-4. Syndecan-4 active le signal de Rac1 propulsion 3, provoque une redistribution des intégrines 1, déclencheurs de recrutement de molécules du cytosquelette, tels que la vinculine, à focaleadhérences 4, et induit de ce fait 3 la migration directionnelle. Nous avons examiné des stratégies alternatives pour l&#39;activation de ces signaux et a constaté que de faible intensité ultrasons pulsés (LIPUS) peuvent mimer les effets de syndécane-4 l&#39;engagement 5. Dans ce protocole, nous décrivons la méthode par laquelle 30 mW / cm 2, 1,5 échographie MHz, pulsé à 1 kHz (Fig. 1) peut être appliquée à des fibroblastes en culture (Fig. 2) pour induire l&#39;activation de Rac1 et la formation d&#39;adhésion focale. La stimulation ultrasons est appliquée pour une durée maximale de 20 minutes, comme cette combinaison de paramètres a été jugée la plus efficace pour l&#39;accélération de la réparation d&#39;une fracture clinique 6. La méthode utilise des fragments de fibronectine recombinantes à s&#39;engager α 5 β 1-intégrine, sans engagement de syndécane-4, et requiert l&#39;inhibition de la synthèse protéique par la cycloheximide à bloquer le dépôt de matrice supplémentaire par les fibroblastes., L&#39;effet positif oéchographie f sur les mécanismes de réparation est bien documenté 7,8, et par la compréhension de l&#39;effet moléculaire de l&#39;échographie dans la culture que nous devrions être en mesure d&#39;affiner la technique thérapeutique pour améliorer les résultats cliniques.

Ce protocole décrit la stimulation des fibroblastes cultivés avec de faible intensité ultrasons pulsés, qui entraîne la formation d&#39;adhésion focale et Rac1 activation en imitant l&#39;engagement du récepteur transmembranaire matrice, le syndécane-4. Cette approche permet d&#39;étudier une technique clinique réussie au niveau cellulaire, offrant ainsi des possibilités de raffinement de la thérapie.

L&#39;induction de signaux d&#39;adhésion dépendant de l&#39;aide ultrasons à faible intensité

Chez les organismes multicellulaires, le comportement cellulaire est dicté par les interactions avec la matrice extracellulaire. Les conséquences de l'engagement de la matrice vont de...

L'objectif général de cette procédure est de comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels les ultrasons pulsés de faible intensité ou le lipo influencent la migration cellulaire et accélèrent ainsi la réparation tissulaire. Cela est réalisé en traitant d'abord les cellules avec du cyclo heide pendant deux heures afin d'empêcher l'expression de novo de protéines et donc la stimulation autocrine des cellules. La deuxième étape de la procédure consiste à étaler les cellules détachées pendant deux heures sur des surfaces qui ont été revêtues d'un ligand matriciel soigneusement défini.La troisième étape consiste à stimuler les cellules par ultrasons en couplant par gel les plaques de culture cellulaire aux émetteurs d'ultrasons. Les résultats peuvent montrer des modifications dans la formation des adhérences focales dues à la stimulation par ultrasons, observées par coloration des cellules pour la culine et l'actine, ainsi que des changements temporels dans l'activation de RACK1 via RAC1 actif, grâce à un dosage d'immunoprécipitation et à un immunoblotting subséquent. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation des adhérences, telles que : la manipulation physique des cellules peut-elle remplacer des stimuli chimiques comme les facteurs de croissance ou l'actine fibrillaire ?Et comment cette manipulation physique initie-t-elle la migration cellulaire ? Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des plaies chroniques, car en comprenant comment les ultrasons peuvent affecter le comportement cellulaire, nous pourrions être en mesure d'affiner les traitements afin d'accélérer la fermeture des plaies chez les individus présentant des défauts de cicatrisation, comme les patients âgés ou diabétiques. Pour les dosages biochimiques, recouvrir directement les puits de plaques plastiques de 3,5 centimètres avec un ligand d'intégrine.Pour l'immunofluorescence, faire bouillir des lamelles en verre trois fois dans de l'eau milli Q. Ensuite, placer quatre lamelles dans chaque plaque de 3,5 centimètres et fonctionnaliser les lamelles en verre afin d'assurer un revêtement efficace du ligand en ajoutant deux millilitres d'une solution de sulfa MBS à une concentration de un millimolaire dans chaque puits. Laisser la réaction se dérouler pendant 30 minutes à température ambiante, puis rincer les surfaces fonctionnalisées trois fois avec du PBS. Enduire maintenant les lamelles en verre fonctionnalisées avec deux millilitres de ligand d'intégrine.Ajoutez le ligand dans chaque puits et incubez les plaques toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, préparez de l'albumine sérique bovine (BSA) monoparticulaire en chauffant de la BSA à 1 %, dissoute dans du PBS, à 85 degrés Celsius pendant 13 minutes. Laissez refroidir, puis filtrez à travers un filtre de 0,45 micron. Lavez d'abord les surfaces recouvertes de ligand trois fois avec du PBS, puis bloquez les surfaces avec la BSA monoparticulaire préparée pendant 30 minutes.Pour contrôler l'environnement matriciel tout au long de l'expérience, la synthèse protéique doit être bloquée par l'ajout de 25 microgrammes par millilitre de cycloheximide sur des fibroblastes à 80 % de confluence pendant deux heures. Rincer les cellules traitées au cycloheximide avec du PBS, trypsiner les cellules et les centrifuger. Resuspendre les cellules dans une solution A-D-M-E-M à une concentration finale de 10 000 cellules par millilitre à l’aide d’un hémocytomètre.Incubez maintenant les cellules resuspendues à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Rincez ensuite les plaques trois fois avec du PBS avant de semer deux millilitres de la suspension cellulaire dans chacune. Laissez les cellules s’étaler pendant deux heures à 37 degrés Celsius, sous 5 % de dioxyde de carbone. Commencez par préchauffer le réseau d’émetteurs ultrasonores et le gel de couplage.Une fois réchauffé, appliquez une petite quantité de gel de couplage, de la taille d'un pois, sur chaque émetteur pour tester son bon fonctionnement. À l'aide d'un détecteur de diode indicateur d'ultrasons, laissez le gel assurer le couplage entre l'émetteur et le détecteur. Si l'émetteur fonctionne correctement, la DDE s'allumera.L'appareil dispose de paramètres fixes et délivrera des ultrasons à 1,5 mégahertz pulsés à un kilohertz, avec une intensité de 30 milliwatts par centimètre carré. L'appareil s'éteindra automatiquement après 20 minutes. Placer les puits sur le réseau d'émetteurs, remettre le réseau dans un incubateur et laisser la température s'équilibrer pendant 10 minutes, puis activer le signal ultrasonore à l'alimentation électrique.Le signal d'ultrasons sera désactivé après 20 minutes. Imiter le régime thérapeutique si des durées de stimulation plus courtes sont nécessaires. Les plaques peuvent être retirées du réseau au moment approprié.Les plaques soumises à des durées de stimulation plus longues doivent rester sur le réseau et être laissées en développement. L'émetteur pourrait être redémarré, mais nous n'avons observé aucun bénéfice supplémentaire lorsque nous l'avons fait. Dans tous les cas, les plaques non stimulées doivent être utilisées comme témoin négatif.Pour l'analyse de la formation des adhésions focales, appliquez un signal d'ultrasons de 20 minutes sur des lamelles revêtues de S, puis incubez-les pendant 40 minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius. Cela permet le développement des adhésions focales. Ensuite, aspirez le milieu.Appliquez deux millilitres de fixateur et attendez 14 minutes. Éliminez le fixateur par aspiration et rincez soigneusement les cellules trois fois avec du PBS. Appliquez le PBS le long du bord du puits et faites doucement pénétrer la solution.Une fois rincées, transférez chaque lame à partir du puits de 3,5 centimètres vers une plaque de 24 puits pour une coloration immunofluorescente ultérieure. Après la période de stimulation souhaitée, aspirez le milieu et rincez les cellules avec du PBS sur de la glace, puis lysez les cellules dans le tampon de lyse approprié pour votre essai biochimique préféré. Nous analysons généralement une activation par un essai de précipitation de l'effecteur.Particulièrement, cette méthode pourrait être utilisée pour l'analyse biochimique de n'importe quelle voie de signalisation. Dans ce protocole, nous décrivons l'induction de vinky et des adhésions focales colorées, ainsi que de l'activité de RAC one par ultrasons dans le cadre des expériences sur les adhésions focales. La situation de base est que les fibroblastes étalés sur un ligand de l'intégrine alpha five beta one ne forment pas d'adhésions contenant du finkel, sauf si un second récepteur d'adhérence aux fibroïnes, syndicate four, est activé par l'ajout d'un ligand soluble.Cependant, la stimulation par ultrasons induit une formation d'adhérences focales à la même ampleur que l'activation de syncom quatre, ce qui indique que la stimulation par ultrasons peut remplacer certains composants de la voie de signalisation indépendante de la fibrine. Dans le cadre d'un développement du test de base, nous présentons la même expérience répétée avec des fibroblastes dépourvus d'INDICUM quatre. Ces fibroblastes réagissent toujours aux ultrasons, mais ne parviennent pas à répondre au ligand d'INDICUM quatre.Ceci démontre que les ultrasons peuvent effectivement contourner le besoin de certains récepteurs de fibres andum. Pour l'expérience biochimique, nous montrons que les ultrasons peuvent induire l'activation de RAC1 en utilisant un dosage par précipitation par capture. L'analyse des lysats bruts après stimulation par ultrasons à 0, 10, 30 et 60 minutes révèle que l'activité de RAC1 atteint un maximum entre 10 et 30 minutes avant de revenir à la ligne de base. Le chargement équivalent entre les différents points temporels est assuré par la normalisation sur les lysats bruts à l'aide d'anticorps dirigés contre la culine.Le résultat ressemble à l'activation de RAC1 par l'engagement de syndecane-4, mais est légèrement plus prolongé que l'activation par la fibronectine. Par conséquent, huit à 10 répétitions sont généralement nécessaires pour obtenir des données significatives. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'éliminer les stimuli supplémentaires en bloquant complètement la synthèse des protéines avec la cycloheximide, en évitant toute contamination du milieu de culture pendant l'expérience et en prévenant la surpopulation cellulaire entraînant des contacts cellule-cellule après cette procédure.D'autres méthodes, comme les tests de cicatrisation de blessure par rayure, peuvent être utilisées pour poser des questions supplémentaires, par exemple : comment les ultrasons déclenchent-ils la migration cellulaire ?

induction-of-adhesion-dependent-signals-using-low-intensity-ultrasound

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Insonation de microbulles est une stratégie prometteuse pour l'ablation de tumeurs à réduire les délais de moyenne puissances acoustiques, ainsi que pour l'administration ciblée de médicaments. Le but de la présente étude est de développer des stratégies à faible rapport cyclique échographie pulsation et de maximiser l'ablation nanovecteurs microvasculaires non-thermique et la livraison de charge utile au-cutanée C6 gliomes.

L&#39;échographie de contraste ciblées traitement des gliomes chez la souris via la livraison de drogue nanoparticules-Bearing et l&#39;ablation microvasculaire

Échographie destruction ciblée des microbulles (UTMD) peut être utilisé pour diriger spécifique au site de livraison de molécules bioactives, notamment des gènes thérapeutiques, pour cibler les organes accessibles à l'échographie, comme le cœur et le...

Introduction à l&#39;échographie destruction des microbulles ciblées Technique

Un test de fréquence pour mesurer la cinétique de l'adhérence d'interaction récepteur-ligand, lorsque les deux molécules sont ancrées sur les surfaces des cellules en interaction est décrite. Ce test mécanique à base est illustrée à l'aide d'une micropipette pressurisés cellules rouges du sang humain en tant que capteur d'adhérence et de l'intégrine αLβ2 et de la molécule d'adhésion intercellulaire-1 que l'interaction des récepteurs et des ligands.

Essai Fréquence d&#39;adhérence pour In Situ Analyse cinétique de la Croix-jonctionnelle interactions moléculaires à l&#39;interface cellule-cellule

Des dommages sélectifs des cellules leucémiques humaines peuvent être obtenus grâce à une nouvelle approche d’application d’ultrasons à basse fréquence avec et sans prétraitement chimiothérapeutique des cellules leucémiques et hématopoïétiques normales.

Génération et analyse quantitative des pulsé basse fréquence échographie pour déterminer la sensibilité de Sonic traité et non traité cellules néoplasiques

Ce protocole montre la nucléation contrôlable de la cavitation dans les fantômes de gel, par le biais de l’exposition simultanée à la fois proche infrarouge lumière pulsée laser et ultrasons de haute intensité concentrée (HIFU). L’activité de la cavitation peut alors servir pour améliorer les utilisations d’imagerie et/ou thérapeutiques de HIFU.

Nucléation contrôlable de Cavitation de nanoparticules d’or plasmoniques pour renforcer la haute intensité porté Applications ultrasons

Dynamique adhérence de cellules immunitaires vers la paroi du vaisseau est une condition préalable pour la domiciliation de l’intestin. Nous présentons ici un protocole pour une analyse fonctionnelle in vitro pour l’analyse de l’impact des anticorps anti-intégrine, chimiokines ou d’autres facteurs sur l’adhérence cellulaire dynamique de cellules humaines à l’aide d’enduit de loopbackDans capillaires.

Dosage d’adhérence dynamiques pour l’analyse fonctionnelle des thérapies contre les adhérences dans la maladie intestinale inflammatoire

Stimulation d’ultrasons pulsés faible intensité (LIPUS) est une modalité pour une stimulation mécanique non invasif des cellules endogènes ou machinés avec une haute résolution spatiale et temporelle. Cet article explique comment implémenter LIPUS à un microscope épifluorescente et comment minimiser les différences d’impédance acoustique sur le chemin de l’échographie pour empêcher des objets mécaniques non désirés.

Multiplexage axé Stimulation ultrason avec la microscopie en Fluorescence

Le protocole expérimental présenté peut être utilisé pour effectuer des mesures en temps réel de l’activité de cavitation dans un dispositif de culture cellulaire dans le but de permettre l’étude des conditions requises pour une administration réussie de médicaments et / ou d’autres bioeffets.

Étude de la thérapie améliorée par cavitation

Une technique rapide et fiable est proposée pour contrôler les oscillations de forme d’une seule bulle acoustique piégée basée sur la technique de coalescence entre deux bulles. Les oscillations de forme de bulle à l’état stationnaire, contrôlées par symétrie, permettent d’analyser l’écoulement du fluide généré au voisinage de l’interface de bulle.

Induction de microflux par des oscillations de bulles non sphériques dans un système de lévitation acoustique

La lithographie quasi UV et la microscopie à force de traction sont combinées pour mesurer les forces cellulaires sur des hydrogels à micromotifs. La libération ciblée de cellules individuelles induite par la lumière permet un grand nombre de mesures sur le même échantillon.

Contrôle de l’adhérence des cellules à l’aide de techniques de modelage d’hydrogel pour des applications en microscopie à force de traction

La perturbation de la barrière hémato-épinière (BSCB) peut être obtenue avec succès grâce à l’administration intraveineuse de microbulles et à l’application d’ultrasons focalisés de faible intensité (LIFU). Ce protocole détaille l’ouverture de la BSCB à l’aide de LIFU dans un modèle de rongeur, y compris la configuration de l’équipement, l’injection de microbulles, la localisation de la cible et la visualisation de la perturbation de la BSCB.

Perturbation de la barrière hémato-épinière à l’aide d’ultrasons focalisés de faible intensité dans un modèle de rat

Découvrez comment l'ultrason pulsé de faible intensité induit la formation d'adhésions focales et l'activation de Rac1 dans les fibroblastes. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la réparation tissulaire.

L'induction de signaux d'adhésion dépendant de l'aide ultrasons à faible intensité

Explorer plus de vidéos