Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants

L'objectif général de cette procédure est d'identifier et de localiser les principaux sites de pause traductionnelle pour un ARNm traduit dans un système de traduction in vitro. Cela est réalisé en premier lieu en clonant le gène d'intérêt sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel T7. Ensuite, l'ARNm est transcrit et purifié.

Ensuite, une traduction in vitro est réalisée en présence d'ARNm et d'acides aminés radioactifs afin de marquer la protéine synthétisée ainsi que les polypeptides naissants. Enfin, les polysomes sont isolés par centrifugation selon la vitesse de sédimentation, et les chaînes naissantes isolées sont séparées par électrophorèse sur gel. En définitive, les résultats obtenus permettent de visualiser des polypeptides naissants de différentes longueurs par électrophorèse SDS-PAGE Tris-tamine et autoradiographie, indiquant ainsi la présence de sites de pause le long de l'ARNm d'intérêt.

Le principal avantage de cette technique par rapport à nos méthodes existantes, comme le test de protection du noyau micrococcal, est qu'elle est extrêmement simple, rapide et efficace, et permet la détermination et l'identification des principaux sites de traduction le long de tout ARNm dans un système cellulaire donné. Cette méthode peut aider à répondre à certaines des questions clés dans le domaine de la traduction et du repliement protéique traductionnel, telles que la manière dont des facteurs cellulaires comme l'utilisation des codons, l'abondance de l'ARNt ou la structure secondaire de l'ARNm peuvent influencer la cinétique de la traduction. Cette méthode pourrait en outre améliorer notre compréhension des relations entre la cinétique de la traduction et les étapes clés du chemin de repliement des protéines pendant la traduction.

L'implication de cette technique s'étend à la compréhension du processus de repliement des protéines in vivo, qui est largement considéré comme se produisant de manière co-traductionnelle pendant la traduction sur le ribosome, bien que la présente étude implique une traduction sans cellule de la gamma-bicristalline à l'aide d'un extrait cellulaire disponible commercialement. Cette technique peut également être appliquée pour identifier les éléments régulateurs de la traduction (IDE) dans potentiellement n'importe quelle protéine, en utilisant un extrait compétent pour la traduction préparé à partir de toute source cellulaire. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés à deux étapes clés du protocole.

Le premier point consiste à établir la durée totale nécessaire à la réalisation de la réaction de traduction, ce qui permettra de s'assurer que la majorité des polypeptides naissants restent liés au ribosome. Le second point est de trouver un système de migration approprié permettant de séparer la majorité des polypeptides naissants ; le choix du système de migration dépend de la taille de la protéine étudiée. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons décidé, au milieu des années quatre-vingt, d'étudier la cinétique de traduction des molécules de globine en lien avec le modèle proposé de repliement co-traductionnel (COT) de la globine.

L'irrégularité de la traduction des globines a été observée pour la première fois par PRO et Maurice en 1974, lors de l'utilisation d'une chromatographie par exclusion de taille CLO des ARN messagers et des chaînes de globine. Toutefois, leur analyse ne possédait pas la précision souhaitable ; Pro et d'autres ont observé quatre principaux sites d'activité traductionnelle au cours de la traduction de la globine. Par la suite, notre analyse a permis de révéler environ 10 sites d'activité supplémentaires et d'élaborer un modèle détaillé du repliement traductionnel de la globine. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la technique décrite ici implique l'isolement de polysomes et l'analyse du polypeptide naissant à l'aide d'un gel Tri S Ds page.

Ces deux étapes sont essentielles pour obtenir des résultats de haute qualité et reproductibles. La démonstration de la progel sera effectuée par un étudiant diplômé du laboratoire Myélo, Sujata For, pour la transcription in vitro d'ARN messager. Commencez par un gène d'intérêt qui a été cloné sous un promoteur T7 ou SP6 ; à l'aide d'une enzyme de restriction appropriée, linéarisez le modèle d'ADN en aval du codon d'arrêt et/ou de l'extrémité 3' de l'ARNm.

Un échantillon de la digestion par restriction est soumis à une électrophorèse sur gel afin de vérifier que l'ADN est complètement linéarisé. Après avoir déterminé la concentration optimale du modèle d'ADN, utilisez un kit de transcription pour transcrire in vitro l'ARN messager selon les instructions du fabricant. Ensuite, purifiez l'ARNm par précipitation au chlorure de lithium.

Ensuite, utilisez soit l'électrophorèse sur gel d'acrylamide soit l'électrophorèse sur gel aros pour vérifier sa pureté. Préparez une réaction de traduction in vitro de 100 microlitres dans de l'eau sans nucléase en ajoutant un mélange d'acides aminés à une concentration de un millimolaire, sans méthionine, 10 unités d'inhibiteur d'ARN, 20 microcuries de méthionine radioactive 35 s et un lysat de réticulocyte de lapin. Préincubez ensuite la réaction en l'incubant à 30 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ensuite, ajoutez deux microgrammes d'ARNm et incubez à 30 degrés Celsius pendant cinq minutes pour arrêter la réaction, puis placez sur de la glace afin d'isoler les polypeptides naissants liés aux ribosomes. Superposez la réaction de traduction sur 4,5 millilitres de glycérol 30 % dans une solution d'HCl à pH 7,6 contenant du chlorure de potassium et du chlorure de magnésium, et centrifugez à l'aide d'un rotor TLA 110 à 100 000 ×g pendant une heure à 4 degrés Celsius. Ensuite, retirez soigneusement le surnageant, puis remettez en suspension le culot de polysomes contenant les polypeptides naissants dans un petit volume de tampon tris 1 millimolaire, HCl, pH 7,6, contenant 0,5 milligramme par millilitre de ribonucléase A, et incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Pour améliorer l'hydrolyse de la liaison ester peptidique ARNt, ajoutez de l'hydroxyde de sodium à une concentration finale de 10 millimolaire dans la réaction et incubez pendant 30 minutes supplémentaires. Séparez les polypeptides néoformés sur un gel SDS-PAGE en tampon Tris-tri, puis fixez et séchez les gels. Soumettez les gels à l'autoradiographie, suivie d'une imagerie phosphorée pour la détection des polypeptides néoformés.

Des modifications du déplacement des ribosomes induites par des changements dans le pool d'ARNt devraient entraîner des modifications dans la distribution des tailles des polypeptides naissants s'accumulant pendant la traduction, ainsi que dans leurs intensités relatives, qui reflètent la durée de l'arrêt ici. Les polypeptides naissants de la protéine cristalline gamma B ont été isolés et séparés par électrophorèse SDS sur gel Tristine. Les longueurs et intensités non identiques des polypeptides dans les systèmes RRL et E. coli indiquent que le déplacement des ribosomes le long de l'ARNm dans ces deux systèmes suit des cinétiques de traduction différentes.

Par exemple, observez la bande marquée de 17,7 kilodaltons dans le lysat d’e coli, absente du système de lysat de réticulocytes de lapin. La cristalline Gamma B contient des codons d'arginine en tandem fréquents dans les systèmes mammaliens, mais connus pour être extrêmement rares et lentement traduits chez e coli, ce qui suggère que cette bande est causée par l'arrêt du ribosome. Un tel arrêt aux codons rares en tandem est illustré ici.

Aucune bande ne peut être observée en l'absence d'ARNm, et le traitement par la pur omycine élimine la majorité des chaînes naissantes des polysomes. De plus, un traitement prolongé par la pur omycine supprime toutes les chaînes naissantes, ce qui confirme que les produits polypeptidiques observés sont bien des chaînes naissantes associées aux ribosomes, et non des protéines ribosomales mitochondriales (MRPs) co-sédimentant avec les polysomes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en un à deux jours. La durée de la procédure dépend principalement du temps de centrifugation et de l'électrophorèse des peptides naissants sur gel.

Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est essentiel d'arrêter immédiatement la réaction de traduction après le temps d'incubation. Pour éviter le relargage du polypeptide naissant à partir du ribosome, il est évidemment crucial d'éviter toute présence d'ARN à n'importe quelle étape. Une contamination par des ARN peut affecter l'efficacité de traduction de l'extrait et entraîner le relargage du polypeptide naissant du ribosome après cette procédure.

D'autres objectifs, comme par exemple les effets des protéines liant l'ARNm sur l'efficacité du déplacement du ribosome le long d'un message donné, peuvent également être testés après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du repliement des protéines pour explorer le rôle de la traduction induit par la présence de codons rares dans le repliement protéique traductionnel. Cette technique a été précédemment utilisée pour évaluer le rôle des substitutions de kaons sur le déplacement du ribosome le long d'un message et sur le repliement protéique traductionnel.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'identifier les sites d'initiation de la traduction présentés par l'ARNm en isolant les polypeptides naissants liés au ribosome. N'oubliez pas que le travail avec des isotopes radioactifs et des acides aminés marqués, tels que, par exemple, la méthionine A 35, exige des précautions particulières et doit toujours être pris en compte lors de la réalisation de cette procédure.