Deux méthodes de formation hétérocaryons à découvrir les facteurs de restriction du VHC

L'objectif de cette procédure est d'étudier l'impact des facteurs de restriction sur l'achèvement du cycle de réplication du virus de l'hépatite C dans une lignée cellulaire donnée, en utilisant deux méthodes reposant sur la formation de Heca. Pour la première méthode, commencez par cultiver des cellules hépatiques humaines ainsi que des cellules d'emballage HeLa A et Hep 56 1D. Transfectez ensuite l'ARN du virus de l'hépatite C ou HCV-ARN dans les cellules hépatiques par électroporation. Ensuite, fusionnez la lignée cellulaire où se produit la réplication du VHC avec la lignée cellulaire d'emballage respective à l'aide de polyéthylène glycol. Pour la deuxième méthode de fusion, la première étape consiste à produire un stock de VHC à haut titre.

Des lignées cellulaires différentes sont ensuite mises en co-culture et la fusion cellulaire est induite par transfection de la glycoprotéine du virus foamy prototype. Ensuite, les hétérocarions sont infectés par le VHC. Après l'une ou l'autre méthode de formation des hétérocarions, une microscopie en fluorescence est réalisée afin de confirmer la fusion, et la production de particules infectieuses est quantifiée.

Le principal avantage de cette technique est qu'elle est utile pour cribler un grand nombre de lignées cellulaires et de cellules primaires afin de détecter l'expression de facteurs de restriction dominants spécifiques aux HV. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la spécificité d'espèce et les noms du VHC. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle pour faciliter la compréhension des concepts sous-jacents aux deux systèmes de fusion, avant l'induction de la fusion cellulaire par le polyéthylène glycol.

Les cellules HUH 7.5 sont transfectées avec l'ARN du VHC selon les protocoles standard et cultivées pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone le jour suivant. Récoltez les cellules HUH 7.5 transfectées contenant le réplicon sous-génomique ainsi que les cellules d’emballage heal R et hep 56 1D. Ces cellules d’emballage ont été conçues pour exprimer de façon ectopique les protéines du VHC : core, E1, E2, p7 et NS2. Après trypsination, resuspendez les cellules dans un milieu complet DMEM et diluez les suspensions cellulaires aux concentrations suivantes : HUH 7.5 à cinq fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre, et les cellules heal et hep 56 1D à deux fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre.

Ensuite, préparez une plaque de culture à six puits contenant deux à trois lamelles de verre stériles par puits. Pour une analyse complémentaire de l'efficacité de fusion, mélangez un millilitre de cellules HUH 7.5 transfectées avec un millilitre de cellules d'emballage et semez le tout dans un puits de la plaque à six puits. Incubez pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après 24 heures, vérifiez la densité cellulaire.

La densité cellulaire doit être comprise entre 60 et 80 % de confluence avant l'induction de la fusion cellulaire afin que les cellules soient suffisamment proches pour que leurs membranes cellulaires puissent fusionner. Aspirez le milieu des cellules en co-culture et rincez une fois avec un millilitre de PBS. Ensuite, ajoutez délicatement 500 microlitres de polyéthylène glycol à 40 % préchauffé, ou PEG 1 500. Ajoutez 500 microlitres de PBS dans un autre puits de cellules en co-culture comme témoin. Incubez pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius pour induire la formation d'hétérokarions. Aspirez le PEG et ajoutez soigneusement deux millilitres de PBS. Après une minute, aspirez le PBS et ajoutez deux millilitres de PBS frais. Rincez avec du PBS de trois à cinq fois, une minute par rinçage, afin d'éliminer l'excès de PEG.

Enfin, ajouter deux millilitres de milieu complet DMEM dans chaque puits et incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures. 48 heures après la fusion. Récupérer chaque SNAT et filtrer à travers un filtre de 0,45 micron. Après la collecte du surnageant de culture cellulaire, l'efficacité de fusion peut être déterminée par immunofluorescence. Laver les puits contenant les lamelles de verre une fois avec un millilitre de PBS pendant une minute.

Fixer les cellules avec 600 microlitres de paraformaldéhyde à 3 % dans du PBS pendant 15 minutes. Laver trois fois avec du PBS pendant une minute par lavage après le dernier lavage. Utiliser une pince pour transférer soigneusement les lamelles dans une plaque de 24 puits contenant des cellules perméabilisées avec 500 microlitres de Triton X-100 à 0,5 % dans du PBS pendant cinq minutes.

Ensuite, laver trois fois avec du PBS, puis appliquer 250 microlitres de la solution d'anticorps primaire à chaque puits. Utiliser un anticorps anti-NS5a à une concentration de 0,5 microgramme par millilitre et un anticorps monoclonal humain anti-E2 à une concentration de 6,4 nanogrammes par millilitre. Incuber pendant 45 minutes à température ambiante. Après 45 minutes, laver trois fois avec du PBS.

Ensuite, ajoutez 250 microlitres d'anticorps secondaires dans chaque puits ; des anticorps secondaires de chèvre anti-souris ou anti-humain IgG spécifiques conjugués à Alexa Fluor 546 ou Alexa Fluor 488 sont utilisés à une concentration de deux microgrammes par millilitre. Incubez pendant 30 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière. Après 30 minutes, lavez une fois avec du PBS.

Colorer ensuite les noyaux cellulaires avec 250 microlitres de DPI dilué au 1/3000 dans du PBS. Incuber pendant une minute à température ambiante à l'abri de la lumière, laver quatre fois avec du PBS et une fois avec de l'eau. Enfin, monter les lamelles à l'envers sur une goutte de milieu Flora Mount déposée sur une lame de microscope et laisser sécher à l'abri de la lumière.

Pour commencer cette procédure, récolter et préparer des suspensions monocellulaires des cellules suivantes : la lignée cellulaire humaine de foie Luna NA, qui ne présente pas d'expression endogène de CD81 ; les cellules d'emballage He r ; et les cellules Hep 56 1D exprimant de façon stable le CD81 humain. Co-cultiver les cellules Luna n avec les cellules He r selon un rapport de un pour un, et avec les cellules Hep 56 1D HCD81 selon un rapport de un pour deux, afin d'obtenir une densité cellulaire totale de 1,5 × 10⁵ cellules par 12.

Incuber les puits pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone le jour suivant. Transfecter de façon transitoire les cellules avec une protéine d'enveloppe PFE hautement fusogénique en utilisant Lipofectamine 2000 selon les instructions du fabricant. 30 heures après la transfection avec la glycoprotéine PFE, inoculer les hétérocarions avec 350 microlitres d'un stock viral préparé au préalable à un MOI d'environ 2,3.

Incuber pendant 12 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone le lendemain matin. Rincer une fois avec du PBS et ajouter un millilitre de milieu complet DMEM par puits ; incuber pendant 48 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après 48 heures, récolter le surnageant des cultures de carions hétérologues, filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,45 micron. Ensuite, utiliser le surnageant pour inoculer des cellules HUH 7.5 qui avaient été semées la veille dans des plaques de 96 puits, dans le cadre d’un essai de dilution limitante ; incuber pendant 72 heures avant de quantifier la production de particules progénies infectieuses.

La procédure permettant de visualiser les événements de fusion doit être réalisée six heures avant la mise en culture. Laver les cellules d'adhérence une fois avec cinq millilitres de PBS, puis ajouter quatre millilitres de la solution DI appropriée par boîte de 10 centimètres. Incuber les cellules pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Laver les cellules une fois avec cinq millilitres de PBS pendant une minute, puis ajouter le milieu complet DMEM. Incuber pendant six heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avant la mise en culture. Ajouter un couvre-objet dans chaque puits d'une plaque de 12 puits, puis semer et transfecter les cellules comme indiqué précédemment. Trente heures après la transfection, laver soigneusement les cellules avec un millilitre de PBS pendant une minute, puis fixer les cellules avec 250 microlitres de paraformaldéhyde à 3 % pendant 15 minutes à température ambiante.

Laver les cellules une fois avec un millilitre de PBS pendant une minute, puis colorer avec dappy pendant une minute après avoir lavé les cellules une fois avec du PBS et une fois avec de l'eau. Monter les lamelles, les verres de protection, les lames dans une première approche afin d'étudier l'impact des facteurs de restriction sur l'achèvement du cycle de réplication du VHC. Dans des hétérocarons, les cellules HUH 7.5 ont d'abord été transfectées de manière transitoire avec un réplicon sous-génomique exprimant un transgène luciférase et les protéines non structurales du VHC, puis co-cultivées et fusionnées à des lignées cellulaires exprimant les protéines structurales Core et les protéines accessoires du VHC. Un résultat représentatif est illustré dans cette figure : cellules immunomarquées à l'aide d'anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine structurale E2 et la protéine non structurale NS5A.

Les images des panneaux supérieurs montrent qu'après traitement avec du PEG, des signaux pour MS five A et D two ont été détectés simultanément dans le même cytoplasme, indiquant une autofusion. En revanche, les images des panneaux inférieurs montrent que lorsque les cellules en co-culture ont été traitées avec du PBS, aucune fusion n'a été induite. Ainsi, aucune colocalisation de signaux n'a été observée. Pour quantifier l'infectiosité virale, des surnageants ont été recueillis à partir des co-cultures 48 heures après l'induction de la fusion et utilisés pour inoculer des cellules HUH 7.5 naïves en vue d'essais ultérieurs de luciférase.

Dans ce graphique, les valeurs moyennes de trois expériences indépendantes sont affichées. La barre horizontale grise représente le fond pour les unités de lumière relative ou RLU déterminées dans des cellules HUH 7.5 non infectées. Notamment, lorsque les cellules réplicantes HUH 7.5 ont été soit fusionnées avec des lignées cellulaires naïves, soit traitées au PBS comme témoin, aucune infectiosité n’a été détectée dans les fluides de culture.

Cependant, lorsque la fusion cellulaire entre la lignée cellulaire HUH 7.5 porteuse du réplicon et les lignées cellulaires d’emballage a été induite par le PEG, des particules virales infectieuses ont été libérées dans les milieux de culture. Cela indique que la production de virus nécessite la fusion cellulaire et l’expression de protéines virales dans les lignées cellulaires d’emballage, remarquablement non seulement les hétérocarions dérivés des cellules d’hépatome humain HUH 7.5, mais aussi les hétérocarions formés avec des cellules hépatiques humaines non hépatiques et des cellules hépatiques de souris ont permis la libération du virus, suggérant que l’assemblage et la libération ne sont pas majoritairement inhibés par d’éventuels facteurs de restriction présents dans ces types cellulaires. Dans une approche alternative, la fusion de cellules somatiques a été induite par l’expression d’une glycoprotéine virale après culture des cellules.

Les hétérocarions ont été visualisés en colorant des lignées cellulaires distinctes avec des colorants traceurs avant leur co-culture et transfection avec la protéine génique. Les cellules ont été fixées et colorées avec le DAPI 30 heures après la transfection, et un résultat représentatif est montré dans cette figure. La fusion de deux types cellulaires est indiquée par un hétérocarion présentant une répartition homogène des colorants dans le cytoplasme, comme illustré ici. En revanche, les images du panneau inférieur montrent l'absence de cellules présentant un cytoplasme doublement coloré, indiquant ainsi l'absence de fusion cellulaire.

Ce graphique final montre que tous les facteurs d'entrée du VHC sont exprimés uniquement dans les cultures hétéro porteurs de cellules Luna N associées à des cellules hela ou Hep 56 1D exprimant le CD 81 humain. Ici, les cultures ont été inoculées avec des particules de VHC infectieuses. Les milieux de culture ont été recueillis 48 heures plus tard, et la libération de nouvelles particules par les hétéro porteurs a été déterminée par un essai de dilution limite utilisant des cellules cibles HUH 7.5 naïves ; les valeurs moyennes de trois expériences indépendantes sont indiquées, et la barre horizontale grise représente la limite de détection de l'essai.

A titre de contrôle, des cellules lunaires N ont été fusionnées avec des cellules lunaires N, ce qui a entraîné des niveaux très faibles de VHC infectieux, proches de la limite de détection. Des résultats similaires ont été obtenus lors de la fusion de cellules lunaires N avec des cellules HEP 56 1D naïves. Dans les deux cas, le CD 81 humain était absent, de sorte que le VHC ne pouvait pas infecter de manière productive les hétérocytes.

En revanche, une production de novo de progéniture virale infectieuse environ dix fois supérieure au fond de l'essai a été observée dans les cellules lunar 10 exposées au heer et dans les cellules lunar hand fusionnées avec des cellules HEP 56 1D exprimant le CD 81 humain. Cela indique que le VHC a correctement accompli son cycle de réplication dans les RetroCars, écartant ainsi l'expression de facteurs de restriction dominants dans ces lignées cellulaires. Une fois maîtrisée, la procédure expérimentale complète peut être réalisée en une semaine si elle est effectuée correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment générer un hétérocarion pour l'identification de facteurs de restriction VHC possibles. N'oubliez pas que le travail avec le virus de l'hépatite C peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles qu'un niveau élevé de biosécurité doivent toujours être prises en compte lors de la réalisation de cette procédure.