Name: Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans létude de la Transmigration des neutrophiles en conditions découlement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Apprenez à isoler des cellules endothéliales de veines ombilicales humaines pour étudier la transmigration des neutrophiles en conditions d'écoulement. Cette méthode permet l'imagerie en temps réel des interactions cellulaires.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions le Dr Pina Colarusso et le Fonds pour Live Cell Imaging pour leur aide avec l&#39;imagerie et l&#39;analyse d&#39;image, Mme Lailey pour son assistance technique et l&#39;unité 51 à l&#39;Hôpital Foothills de Calgary, AB pour la fourniture de cordons ombilicaux humains. Le Dr Patel KD est un Innovates Alberta: Health Solutions scientifique. Ce travail a été soutenu par une subvention de fonctionnement de l&#39;Institut canadien de recherche en santé et subventions d&#39;équipement et d&#39;infrastructure de la Fondation canadienne pour l&#39;innovation et l&#39;Alberta Science and Research Authority.

1. L&#39;isolement et la maintenance des cellules endothéliales vasculaires humaines <ol><li> Niveau 2 procédures de biosécurité doit être utilisé lorsque l&#39;on travaille avec du sang et de tissus humains. L&#39;aide de ciseaux couper le cordon du placenta, puis d&#39;examiner de près le cordon de caillots sanguins et les dommages causés par le clampage du cordon pendant l&#39;accouchement. Couper et jeter ces parties de la moelle. </li><li> Préparer la solution de collagénase fraîche à 1 mg / ml en versant 50 ml de tampon cordon chaud dans un tube qui contient 50 mg de la collagénase. </li><li> Changement dans les gants stériles et d&#39;ouvrir un plateau à instruments stérilisés autoclavé contenant canules mousses, pinces, ciseaux, de la moelle à trois voies robinets d&#39;arrêt et de la gaze dans une hotte à flux laminaire. </li><li> Identifier les deux artères et du présent seule veine dans la moelle. Les artères sont plus petits et ont tendance à être étroitement resserré, tandis que la veine est grand et facile à cathétériser. Pour vider le sang de la veine, insérer doucement une canule d&#39;un robinet à deux voies qui s&#39;y rattachent into une extrémité de la veine et le lieu d&#39;une pince autour de la canule pour le maintenir fermement en place. Perfuser tampon cordon à travers la veine. Répétez jusqu&#39;à ce que l&#39;écoulement à travers est clair, puis serrer l&#39;extrémité de la corde. </li><li> Collagénase perfuser dans la veine, fermer le robinet, placez le cordon dans un bécher contenant un tampon cordon chaud et incuber pendant 10 minutes. Après 10 minutes, retirez le cordon et masser doucement le cordon pour desserrer les cellules endothéliales de la lumière de la veine. Videz la solution dans le tube contenant des cellules endothéliales des médias (ECM). Rincer avec un tampon de cordon à deux reprises pour éliminer les cellules restantes. Videz la solution dans le même tube. </li><li> Centrifuger les cellules à 350 xg pendant 10 minutes à granulés les cellules endothéliales. </li><li> Eliminer le surnageant et ajouter 10 ml d&#39;ECM au culot. Resuspendre doucement les cellules de l&#39;ECM, puis de transférer les cellules à un flacon T75 pré-enduit avec 0,2% de gélatine. Pré-revêtement avec de la gélatine a été fait pour au moins 1 heure à 37 ° C. Cultiver les cellules à 37 ° C et 5% De CO 2. </li><li> Le lendemain, secouez doucement le flacon pour déloger les globules rouges, puis enlever le surnageant et laver avec une solution chaude saline équilibrée de Hank (HBSS). Retirer HBSS et nourrir les cellules avec 10 ml d&#39;ECM chaud. Examiner les cellules sous le microscope pour s&#39;assurer que les globules rouges ont été retirés. Évaluer le degré de confluence et de la morphologie des cellules endothéliales. Les cellules endothéliales à ce stade doit être allongée sans aucun signe de vacuoles. </li><li> Continuer à changer les médias tous les trois jours jusqu&#39;à ce que les cellules atteignent confluence, les cellules, puis répartis en utilisant une solution de 0,08% de trypsine contenant 1 mM d&#39;EDTA. Cellules endothéliales dans des boîtes de plaques désirées pré-enduit avec 0,2% de gélatine. Les cellules doivent atteindre la confluence en 3-6 jours. </li><li> Lorsque vous utilisez ibidi chambres, pré-couche chaque chambre avec 0,2% de gélatine. Enlever l&#39;excès de gélatine et de la fibronectine, puis ajoutez 1,5 X 10 6 / mL de cellules endothéliales en suspension dans l&#39;ECM dans la chambre. Changer les médias tous les jours jusqu&#39;à ce que confluent. Les cellules doivent être confluentes en 2-3 jours en fonction de la moelle. </li></ol> 2. Préparation de neutrophiles <ol><li> Les neutrophiles ont été isolés à partir du sang périphérique de volontaires sains en utilisant la centrifugation de densité. Un protocole détaillé avec une démonstration visuelle pour l&#39;isolement des neutrophiles peut être trouvée dans le numéro précédent de cette revue 6. Une fois isolés, des cellules neutrophiles Resuspendre à une concentration de 1x10 6 / ml dans du HBSS contenant 0,5% d&#39;albumine humaine. </li></ol> 3. Mise en place de la Chambre ibidi <ol><li> Cultiver les cellules endothéliales dans une chambre de la gélatine enduit ibidi. Examinez tous les jours en utilisant la microscopie à contraste de phase jusqu&#39;à ce qu&#39;ils deviennent bien confluentes. </li><li> Stimuler les cellules endothéliales pour augmenter l&#39;expression des molécules d&#39;adhésion et d&#39;activation. Pour les fins du présent protocole, les cellules endothéliales sont stimulées avec 10 ng / ml de TNF recombinant-α pendant quatre heures à 37 ° C et 5% de CO <sub&gt; 2 avant la mise en place de la chambre ibidi pour l&#39;imagerie dans des conditions d&#39;écoulement. </li><li> Préparer le microscope, et la pompe seringue comme décrit visuellement par Wiese et ses collègues 11 en utilisant une chambre vide ibidi. </li><li> Principales différences entre ce protocole et la procédure Wiese inclure le pré-remplissage du tube pour prévenir l&#39;exposition des cellules endothéliales dans l&#39;air, le maintien de la mémoire tampon à 37 ° C en utilisant un bain d&#39;eau, en utilisant des tubes PharMed de garder la mémoire tampon de perdre la température et l&#39;utilisation de différents objectifs sur le microscope selon que l&#39;imagerie à contraste de phase ou de fluorescence. </li><li> Une fois que le microscope est mis en place et le tube est rempli avec du HBSS, fermez toutes les robinets et de supprimer la chambre vide ibidi. </li><li> Connectez la chambre ibidi contenant du TNF-α stimulé les cellules endothéliales à la tubulure. </li></ol> 4. Le recrutement des neutrophiles et de la Transmigration <ol><li> Visualisez la monocouche de cellules endothéliales dans le Microscope l&#39;aide d&#39;un objectif de phase 10x contraste. </li><li> Définir la pompe à seringue de retirer et de commencer l&#39;écoulement de HBSS à la contrainte de cisaillement de consigne (typiquement entre 0,5 à 2 dynes / cm 2). </li><li> Sur le côté de l&#39;entrée, commutateur de HBSS à neutrophiles isolés (1x10 6 / ml) en tournant la façon dont trois robinet. </li><li> Commencer l&#39;enregistrement à l&#39;aide d&#39;une caméra CCD reliée soit à un enregistreur de DVD ou relié directement à l&#39;ordinateur. Démarrer la minuterie lorsque les neutrophiles pénètrent dans la chambre. Perfuser neutrophiles pendant quatre minutes. Un total de 3 mL de la suspension de neutrophiles est suffisante pour une expérience unique. </li><li> Après quatre minutes, revenir à HBSS pour empêcher la fixation de nouveaux neutrophiles. Si les données concernant les interactions au total, le produit laminé et d&#39;adhérence ferme sont souhaitées, image 6 champs aléatoires pendant 10 secondes chacune avec un objectif de phase 10x contraste entre 4 et 5 minutes. </li><li> Basculer vers un objectif 40x et d&#39;enregistrer un seul champ de vue entre 5 et 10 minutes. A 10 minutes, recueillir desentre 5 et 10 champs de vue aléatoires. </li><li> Arrêter l&#39;écoulement et de passer à la chambre suivante. </li></ol> 5. L&#39;imagerie de fluorescence dans des conditions de débit utilisant une chambre d&#39;ibidi <ol><li> Cellules endothéliales ou l&#39;étiquette soit neutrophiles avec une sonde fluorescente d&#39;intérêt. Par exemple, un anticorps anti-VE-cadhérine conjugué à Alexa-[547] peut être utilisé pour visualiser jonctions des cellules endothéliales. </li><li> Assemblez chambre ibidi sur un microscope à contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) et des capacités fluorescentes. Nous utilisons un FluoView 1000 confocale (Olympus) avec une chambre de l&#39;environnement. Concentrez-en utilisant un objectif conçu pour le travail DIC et fluorescente. </li><li> Acquérir des images simultanées DIC et les lampes fluorescentes à l&#39;aide du logiciel fourni par le vendeur, tout en suivant le cours du temps décrit à la section 4. </li></ol> 6. Analyse du recrutement des neutrophiles <ol><li> Analyse du matériel et d&#39;interagir des cellules est décrite par Wiese et al 11. </li&gt; <li> Pour mesurer le pourcentage de neutrophiles qui roulent sur la monocouche endothéliale compter le nombre de neutrophiles qui ont ému plus d&#39;un diamètre de cellule dans une période de 5 secondes. Divisez ce chiffre par le nombre total de leucocytes dans le domaine afin de déterminer le pourcentage de cellules de roulement. Par extension, les cellules restantes sont considérées comme très adhérente. </li><li> Mesurer la vitesse de roulement de neutrophiles en calculant la distance parcourue dans le neutrophile une période donnée, puis en le divisant par ce temps en secondes. </li><li> Transmigration est déterminé en comptant le nombre de neutrophiles qui ont changé de forme et a migré au-dessous de la monocouche 10. Ces neutrophiles sont identifiés par le fait qu&#39;ils changent la phase d&#39;être claire lorsqu&#39;il est sur ​​le dessus de la monocouche d&#39;être foncée de phase lorsque dessous de la monocouche 10. Le nombre de cellules transmigré peut être exprimée en pourcentage des cellules totales dans le champ de vision ou en tant que première insensibleer des cellules transmigré par unité de surface. Dans ce système modèle, typiquement 50% de neutrophiles transmigrent après 10 minutes. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Les cellules endothéliales non stimulées ne prend pas en charge le recrutement des neutrophiles. En revanche, la stimulation des cellules endothéliales avec le TNF-alpha dans les résultats des neutrophiles de roulement, l&#39;adhérence ferme et la transmigration. Un exemple de ces données est montré dans les figures 1 et 2. La figure 1A montre les neutrophiles qui interagissent avec le TNF-α-cellules endothéliales stimulées. Ces interactions peuvent être quantifiés, révélant le nombre total de neutrophiles qui interagissent avec les cellules endothéliales ainsi que le nombre de neutrophiles roulants, adhérente ou transmigré (Figure 2). La transmigration des neutrophiles peut se produire au niveau des jonctions cellulaires ou par l&#39;intermédiaire des cellules endothéliales elles-mêmes. Pour différencier ces deux conditions, les cellules endothéliales sont marquées avec un anti-VE-c<html> anticorps adherin et la transmigration est marqué comme se produisant paracellularly ou transcellularly (figure 1B et C). Dans ce modèle, la quasi-totalité transmigration est paracellulaire 7. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig1.jpg" /> Figure 1. DIC simultanée et l&#39;imagerie de fluorescence dans des conditions d&#39;écoulement à l&#39;aide d&#39;une chambre ibidi. (A) image DIC fraîchement isolés neutrophiles humains qui migrent à travers les cellules endothéliales de veines ombilicales. Le jaune flèche montre un neutrophiles adhérente; la flèche blanche indique un neutrophile transmigrant. (B) jonctions des cellules endothéliales ont été colorées avec un anticorps anti-VE-cadhérine conjugué à Alexa-[547] et imagé. (C) montre superposition de canaux A et B révèle que la quasi-totalité transmigrant dans ce modèle est paracellulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4032/4032fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . _content &quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig2.jpg" /> Figure 2. Les cellules endothéliales ont été laissés non stimulées ou ont été stimulées avec 10 ng / ml de TNF-α. Après 4 heures, une chambre à plaques parallèles de débit a été assemblé et neutrophiles ont été perfusés à travers au 1 dyn / cm 2. (A) les interactions neutrophiles ont été examinés et mesurés à l&#39;aide du logiciel ImageJ du NIH. Les cellules en interaction totales ont été caractérisés comme (B) de roulement, adhérente ou (C) transmigrant. Les données représentent la moyenne + SEM comprise entre 3 et 5 expériences. La différence entre le contrôle et le TNF dans les panneaux A et C était significative (p &lt;0,001).

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li>
<li>Diacovo, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+rolling%2C+arrest%2C+and+transmigration+across+activated%2C+surface-adherent+platelets+via+sequential+action+of+P-selectin+and+the+beta+2-integrin+CD11b%2FCD18%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18.</a> Blood. 88, 146-157 (1996).</li>
<li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Petri, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+LSP1+is+involved+in+endothelial+dome+formation%2C+minimizing+vascular+permeability+changes+during+neutrophil+transmigration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo.</a> Blood. 117, 942-952 (2011).</li>
<li>Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+junctional+adhesion+molecule-C+promotes+neutrophil+transendothelial+migration+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Isolation+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Isolation Protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745(2008).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+leukocyte+transmigration%3A+cell+surface+interactions+and+signaling+events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events.</a> J. Immunol. 172, 7-13 (2004).</li>
<li>Alcaide, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+under+shear+flow%3A+it%27s+all+about+endothelial+cell+rings+and+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps.</a> Microcirculation. 16, 43-57 (2009).</li>
<li>Jutila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+neutrophil+adhesion+under+conditions+mimicking+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Neutrophil+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow.</a> Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).</li>
<li>Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+leukocyte+rolling+and+adhesion+in+vitro+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Cell+Culture+Protocols%22%5BJournal%5D)">Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions.</a> Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).</li>
<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Physiologic+E-Selectin-Mediated+Leukocyte+Rolling+on+Microvascular+Endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009(2009).</li>
<li>Petzelbauer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li>
<li>Bonder, C. S., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+leukocyte+recruitment+to+splanchnic+organs+to+reduce+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Phys+-+Gastrointestinal+and+Liver+Phys%22%5BJournal%5D)">Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation.</a> Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).</li>
<li>Cuvelier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophil+adhesion+under+flow+conditions+activates+mechanosensitive+signaling+pathways+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells.</a> J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).</li>
<li>Massia, S. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cell+interactions+with+surface-coupled+adhesion+peptides+on+a+nonadhesive+glass+substrate+and+two+polymeric+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mat.+Res%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials.</a> J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

<html> Les chercheurs ont systématiquement utilisé des cellules endothéliales à partir de différents lits vasculaires pour étudier le recrutement des neutrophiles et la transmigration. Les exemples incluent, mais ne sont pas limités à, des cellules endothéliales microvasculaires dermiques 12, le foie les cellules endothéliales sinusoïdales 13 et les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine 10. Parmi eux HUVEC acquis une grande popularité en raison de leur relative facilité de l&...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif et le matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> La collagénase de type 1 </td><td> Worthington </td><td> 4197 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon cordon </td><td></td><td></td><td> Composition: NaCl 140 mM 4 mM de KCl 10 mM de D-glucose dans 1mM NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 à pH 7,4 </td></tr><tr><td> Médias cellules endothéliales (ECM) </td><td></td><td></td><td> M199 avec des sels d&#39;aigle supplémentés avec du sérum humain 16% contenant 100 unités de pénicilline 100 ug de streptomycine et de 0,3 mg de L-glutamine/ml </td></tr><tr><td> M199 </td><td> GIBCO </td><td> 31100-035 </td><td></td></tr><tr><td> Le glutamate streptomycine pénicilline (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Ibidi chambres </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td><td></td></tr><tr><td> TNF-α </td><td> Prepro Tech </td><td> 300-01A </td><td></td></tr><tr><td> Solution d&#39;albumine humaine 20% </td><td> Bioproduits Gemini </td><td> 800120050 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS sans Ca 2 + et Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> H2487-10X </td><td></td></tr><tr><td> HBSS avec Ca 2 + et Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> H1387-10X </td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l&#39;étude de la transmigration des neutrophiles en conditions d&#39;écoulement

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Les neutrophiles sont le type le plus abondant de globules blancs. Ils constituent une partie essentielle du système immunitaire inné 1. Au cours de l&#39;inflammation aiguë, les neutrophiles sont des cellules inflammatoires premiers à migrer vers le site de la lésion. Le recrutement des neutrophiles à un site de la lésion est un processus par étapes qui comprend d&#39;abord, la dilatation des vaisseaux sanguins pour augmenter le flux sanguin, en deuxième lieu, les changements structurels microvasculaires et d&#39;échapper à des protéines plasmatiques de la circulation sanguine, en troisième lieu, le laminage, l&#39;adhérence et la transmigration des neutrophiles dans l&#39;ensemble du accumulation et quatrième neutrophiles au site de la lésion 2,3; endothélium. Un large éventail de in vivo et in vitro a évolué pour permettre l&#39;étude de ces 4 processus. Cette méthode met l&#39;accent sur la transmigration des neutrophiles à travers les cellules endothéliales humaines. Une méthode populaire pour l&#39;examen des processus moléculaires impliqués dans la transmigration des neutrophiles utilise humaine neutrophils interagissant avec les cellules humaines primaires endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) 5. L&#39;isolement des neutrophiles a été décrit visuellement ailleurs 6; donc cet article vous montrera la méthode pour l&#39;isolement de cellules HUVEC. Une fois isolées et cultivées à confluence, les cellules endothéliales sont activées aboutissant à la régulation à la hausse des molécules d&#39;adhésion et l&#39;activation. Par exemple, l&#39;activation des cellules endothéliales avec des cytokines telles que le TNF-alpha entraîne la E-sélectine augmenté et IL-8 expression 7. E-sélectine médie de capture et le laminage de neutrophiles et d&#39;IL-8 et d&#39;activation de médiateur d&#39;adhérence ferme de neutrophiles. Après neutrophiles adhérence transmigrer. Transmigration peut se produire paracellularly (à travers les jonctions des cellules endothéliales) ou transcellularly (à travers la cellule endothéliale elle-même). Dans la plupart des cas, ces interactions se produisent dans des conditions d&#39;écoulement trouvés dans le système vasculaire 7,8. La chambre de plaques parallèles de débit est un système largement utilisé que mile cisaillement hydrodynamique micros contraintes trouvé in vivo et permet l&#39;étude du recrutement des neutrophiles dans des conditions d&#39;écoulement in vitro 9,10. Plusieurs entreprises produisent parallèles chambres d&#39;écoulement de la plaque et ont chacune leurs avantages et leurs inconvénients. Si fluorescente imagerie est nécessaire, en verre ou en une optiquement similaire polymère doit être utilisé. Les cellules endothéliales ne poussent pas bien sur le verre. Nous présentons ici une méthode simple et rapide pour l&#39;imagerie à contraste de phase, DIC et de la transmigration des neutrophiles fluorescente utilisant une lame de faible volume canal ibidi constitué d&#39;un polymère qui prend en charge l&#39;adhérence et la croissance rapides des cellules endothéliales humaines et a des qualités optiques qui sont comparables à verre. Dans cette méthode, les cellules endothéliales ont été cultivées et stimulées dans une μslide ibidi. Les neutrophiles ont été introduits dans des conditions d&#39;écoulement et de la transmigration a été évaluée. L&#39;imagerie de fluorescence des jonctions activé en temps réel de détermination de l&#39;étendue de paracellulaire par rapporttransmigration transcellulaire.

Cet article décrit tout d&#39;abord une procédure pour isoler les cellules endothéliales humaines de veines ombilicales puis montre comment utiliser ces cellules pour examiner la transmigration des neutrophiles dans des conditions d&#39;écoulement. En utilisant une chambre d&#39;écoulement à faible volume faite d&#39;un polymère avec des caractéristiques optiques de verre, des cellules vivantes d&#39;imagerie de fluorescence de populations de cellules rares est également possible.

Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l&#39;étude de la Transmigration des neutrophiles en conditions d&#39;écoulement

Les neutrophiles sont le type de globule blanc le plus abondant. Ils constituent un élément essentiel du système immunitaire inné1. Lors d'une inflammation aiguë, ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules endothéliales humaines de haute qualité et de les utiliser pour examiner les mécanismes régulant la transmigration des neutrophiles, dans des conditions d'écoulement. Cela est réalisé en isolant d'abord des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine, puis en les mettant en culture. La deuxième étape consiste à répartir les cellules dans des chambres IBD.Ensuite, des neutrophiles humains fraîchement isolés sont perfusés sur des cellules endothéliales activées, entraînant un roulement des neutrophiles, une adhésion ferme et une transmigration. La dernière étape consiste à quantifier la transmigration à l’aide de la microscopie vidéo. En fin de compte, la microscopie fluorescente et la microscopie en champ clair peuvent être utilisées pour évaluer la transmigration des neutrophiles à travers les cellules endothéliales activées.L'isolement des cellules endothéliales est facile à décrire, mais difficile à apprendre en partie parce que certaines étapes clés nécessitent la visualisation du cordon ombilical. Pour cette raison, la démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Cette méthode nous aidera à comprendre des questions fondamentales dans le domaine de l'inflammation, telles que le recrutement des leucocytes en conditions d'écoulement, et le comportement des cellules endothéliales en conditions d'écoulement sera mieux compris.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le recrutement des neutrophiles pendant l'inflammation, elle peut également être appliquée à des populations rares de leucocytes telles que les cellules Natural Killer et les éosinophiles. Hong Jang, technicien dans mon laboratoire, démontre cette procédure aux côtés de Ritu Sharma. Au moins une heure avant la procédure, pré-incuber un flacon T 75 avec de la gélatine à 37 degrés Celsius.Ensuite, commencez la procédure d'isolement des cellules endothéliales dans la hotte à flux laminaire en utilisant une paire de ciseaux pour couper un cordon ombilical provenant d'un placenta. Après avoir changé pour des gants stériles, examinez attentivement le cordon et jetez toute portion contenant des caillots sanguins ou présentant des lésions dues à la pince sur le cordon lors de l'accouchement. Identifiez ensuite les deux artères et la veine unique présentes dans le cordon.Ensuite, insérez délicatement une canule munie d'un robinet à deux voies à une extrémité de la veine, puis placez une pince autour de la canule pour la maintenir fermement en place. L'une des parties les plus délicates de la procédure consiste à perfuser le cordon ombilical. Pour vous assurer que cette étape est réalisée avec succès, perfusez le cordon avec un excès de tampon et observez le flux jusqu'à ce qu'il devienne limpide.Perfuser la veine avec du tampon de cordon jusqu'à ce que l'écoulement soit clair, puis pincer l'extrémité du cordon. Parfois, durant la perfusion, un petit trou apparaît parce que les médecins ont prélevé du sang du cordon ombilical. Dans ces cas, des pinces hémostatiques peuvent être utilisées pour obstruer le trou et la perfusion peut se poursuivre tout en isolant les cellules endothéliales.Il est essentiel de contrôler précisément la durée du traitement à la collagénase. Une durée trop courte ne permet pas de récolter suffisamment de cellules endothéliales, tandis qu'une durée trop longue peut entraîner une contamination par des cellules musculaires lisses ou endommager les cellules endothéliales. Ensuite, perfuser la veine avec une solution fraîchement préparée de collagénase tiède.Fermez le robinet et incubez le cordon dans un bécher contenant du tampon chaud pour cordon. Après 10 minutes, retirez-le puis massez doucement le cordon pour détacher les cellules endothéliales de la lumière de la veine. Évacuez la solution dans un tube contenant cinq millilitres de milieu pour cellules endothéliales ou ECM, puis rincez le cordon deux fois avec le tampon pour cordon afin d'éliminer les cellules résiduelles.Faire centrifuger les cellules pendant 10 minutes à 350 × g, à température ambiante. Retirer le surnageant, puis resuspendre le culot dans 10 millilitres de milieu pour cellules endothéliales. Transférer les cellules dans un flacon T75 revêtu de gélatine et les cultiver toute la nuit à 37 °C et 5 % CO2. Le lendemain, agiter doucement le flacon pour détacher les globules rouges éventuels.Ensuite, retirez le surnageant et lavez la culture de cellules endothéliales avec du HBSS tiède. Après avoir retiré le HBSS, alimentez les cellules avec 10 millilitres de milieu ECM tiède. Examinez ensuite les cellules au microscope afin de confirmer que les globules rouges ont été éliminés et d'évaluer le degré de confluence ainsi que la morphologie des cellules endothéliales.Continuez à changer le milieu tous les trois jours jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence. À ce stade, séparez les cellules à l'aide d'une solution de trypsine et d'EDTA. Ensuite, récoltez les cellules détachées et remettez-les en suspension dans la matrice extracellulaire (ECM).Enfin, recouvrir chaque puits d'une chambre IBD de gélatine. Éliminer l'excès de gélatine, puis ajouter 1,5 × 10⁶ cellules par millilitre de la suspension de cellules endothéliales dans chaque puits de la chambre. Commencer par induire la sur-expression des molécules d'adhésion et d'activation à la surface cellulaire en incubant les cellules endothéliales avec un stimulant approprié pendant l'activation des cellules endothéliales.Isoler les neutrophiles à partir du sang périphérique de donneurs humains sains par centrifugation de densité selon une méthode déjà publiée, puis suspendre les cellules à une concentration de 1 × 10⁶ par millilitre dans du HBSS additionné d'albumine humaine. Après avoir mis en place le microscope, fixer la chambre IBD contenant les cellules endothéliales activées au tube du microscope. Sélectionner l'objectif de contraste de phase 10 ×, puis régler la pompe à perfusion pour aspirer et initier l'écoulement du HBSS à la contrainte de cisaillement souhaitée.Arrêtez brièvement l'écoulement en tournant le robinet à trois voies du côté de la sortie vers la position fermée et en changeant la ligne d'entrée du HBSS aux neutrophiles isolés. Recommencez l'écoulement en remettant le robinet à trois voies en position ouverte. Commencez ensuite l'enregistrement à l'aide d'une caméra CCD connectée à un enregistreur DVD.Démarrer le chronomètre. Lorsque les neutrophiles pénètrent dans la chambre après quatre minutes, revenir au HBSS pour empêcher l'attachement de nouveaux neutrophiles. Si l'on souhaite obtenir des données sur les interactions totales, le roulement et l'adhérence ferme, utiliser un objectif 10 x en contraste de phase.Objectif d'acquérir six champs aléatoires pendant 10 secondes chacun entre la quatrième et la cinquième minute. Passez enfin à un objectif 40 x et enregistrez un seul champ de vision au moment d'intérêt. Après la perfusion des neutrophiles à 10 minutes, collectez entre cinq et dix champs de vision aléatoires.Les cellules endothéliales non stimulées ne favorisent pas le recrutement des neutrophiles. Par conséquent, les figures suivantes montrent des neutrophiles interagissant avec des cellules endothéliales stimulées par le TNF alpha. Remarquez le neutrophile adhérent indiqué par la flèche jaune et le neutrophile en cours de transmigration désigné par la flèche blanche.La transmigration des neutrophiles peut se produire au niveau des jonctions cellulaires ou à travers les cellules endothéliales elles-mêmes. Pour distinguer ces deux conditions, les cellules endothéliales ont été marquées avec un anticorps anti-VE cohérent. Comme indiqué ici en rouge, la transmigration est évaluée comme étant paracellulaire ou transcellulaire.Dans ce modèle, pratiquement toute la transmigration est paracellulaire, comme le montre cette figure illustrant la superposition des deux figures précédentes. Dans ce premier graphique sur trois, les interactions des neutrophiles ont été examinées et mesurées à l'aide du logiciel ImageJ. Remarquez qu'un nombre significativement plus élevé d'interactions entre les neutrophiles et les cellules endothéliales activées par le TNF alpha s'est produit par rapport aux cellules endothéliales non stimulées du groupe témoin.Les cellules interagissantes totales ont été davantage caractérisées comme roulant, adhérentes fermement ou en cours de transmigration, comme précédemment. Une transmigration significativement plus importante des neutrophiles a été observée dans les puits contenant des cellules endothéliales activées après l'isolement des cellules endothéliales. D'autres méthodes telles que le western blot, la PCR en temps réel et la mesure de la résistance endothéliale peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires liées à la biologie des cellules endothéliales après développement.Cette méthode aidera les chercheurs dans le domaine de l'inflammation et de la biologie vasculaire à comprendre comment se déroule le recrutement des leucocytes en conditions d'écoulement dans un modèle humain. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine et de les utiliser pour étudier la transmigration des neutrophiles en conditions d'écoulement à l'aide d'une chambre à flux.

isolation-human-umbilical-vein-endothelial-cells-their-use-study

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ce protocole vidéo illustre l'isolement et la culture de cellules humaines endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) de cordon ombilical humain. Une fois isolé ces cellules peuvent être utilisées pour des dosages angiogenèse in vitro comme le dosage optimisé fibrine billes de gel a également démontré par le laboratoire de M. Hughes.

Isolement de cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC)

La vidéo présente une méthode d’étude de l’impact des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes. Dans un modèle de chambre d’écoulement de plaques parallèles, les cytokines pro-inflammatoires induisent l’expression des récepteurs d’adhésion par les cellules endothéliales, facilitant le recrutement et la migration des neutrophiles. La diaphonie entre les cellules stromales et les cellules endothéliales diminue le recrutement des neutrophiles dans les cellules endothéliales.

Une étude in vitro de l’effet des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes

Un procédé de quantification de l'adhésion des neutrophiles est rapporté. Cette méthode permet de créer un environnement dynamique d'écoulement semblable à celle rencontrée dans un vaisseau sanguin. Il permet à l'enquête de l'adhésion des neutrophiles soit à des molécules purifiées d'adhésion (ligand) ou substrat de cellules endothéliales (HUVEC) dans un contexte similaire à l'environnement in vivo avec contrainte de cisaillement.

Human neutrophiles Chambre flux Essai d&#39;adhésion

Les leucocytes traversent la monocouche endothéliale utilisant le paracellulaire ou la voie transcellulaire. Nous avons développé un test simple de suivre la distribution de jonction endogène VE-cadhérine et PECAM-1 au cours de la migration leucocytaire transendotheliale sous flux physiologique à une discrimination entre les deux voies de transmigration.

Imagerie en temps réel des jonctions endothéliales cellule-cellule Pendant neutrophiles Transmigration Sous physiologique débit

Cellules endothéliales primaires de la veine ombilicale humaine (HUVECs) ont été cultivées jusqu’à la confluence au sein d’un dispositif de réseau microfluidique. La jonction cellulaire endothéliale et les distributions de l’actine F ont été illustrées et les changements dans la concentration intracellulaire de calcium et la production d’oxyde nitrique en réponse à l’adénosine triphosphate (ATP) ont été quantifiés en temps réel au niveau cellulaire individuel.

Développement et caractérisation de<em&gt; In vitro</em&gt; Microvaisseaux réseau et des mesures quantitatives de l&#39;endothélium [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Et production d&#39;oxyde nitrique

Les protocoles pour la culture de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), la transfection transitoire de marqueurs de croissance des microtubules marqués par fluorescence, l’imagerie de cellules vivantes et l’analyse automatisée de la dynamique de croissance des microtubules interphase sont détaillés.

Haute résolution Time-lapse d&#39;imagerie et d&#39;analyse automatisée des microtubules Dynamics Living ombilicale humaine Cellules endothéliales de veine

Ce protocole vise à isoler les cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical. Parmi les applications incluent l’utilisation de ces cellules comme biomarqueur pour identifier les patients à risque cardiovasculaire, traitement des maladies ischémiques, et constructions de création valve tissulaire cardiaque et vasculaire.

Isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain

Nous présentons ici un protocole intégré qui mesure la sous-population de monocyte traite sous flux in vitro par l’utilisation de marqueurs de surface spécifiques et la microscopie confocal fluorescence. Ce protocole peut être utilisé pour explorer les étapes séquentielles de recrutement aussi bien quant à profil autres sous-types de leucocytes à l’aide d’autres marqueurs de surface spécifiques.

Étude simultanée du recrutement des sous-populations de Monocyte sous flux In Vitro

Bien que difficile, l’isolement des cellules endothéliales pulmonaires est essentiel pour les études sur l’inflammation pulmonaire. Le présent protocole décrit une procédure pour l’isolement à haut rendement et à haute pureté des cellules endothéliales macrovasculaires et microvasculaires.

Isolement et purification de cellules endothéliales microvasculaires et macrovasculaires à partir d’échantillons dérivés de poumons

Nous décrivons un protocole pour isoler et cultiver des cellules endothéliales de veine saphène humaine (hSVEC). Nous fournissons également des méthodes détaillées pour produire une contrainte de cisaillement et un étirement pour étudier la contrainte mécanique dans les hSVEC.

Isolement des cellules endothéliales de la veine saphène humaine et exposition à des niveaux contrôlés de contrainte de cisaillement et d’étirement

Apprenez à isoler des cellules endothéliales de veines ombilicales humaines pour étudier la transmigration des neutrophiles en conditions d'écoulement. Cette méthode permet l'imagerie en temps réel des interactions cellulaires.

Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans létude de la Transmigration des neutrophiles en conditions découlement (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l'étude de la Transmigration des neutrophiles en conditions d'écoulement

Explorer plus de vidéos