Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l'étude de la Transmigration des neutrophiles en conditions d'écoulement

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules endothéliales humaines de haute qualité et de les utiliser pour examiner les mécanismes régulant la transmigration des neutrophiles, dans des conditions d'écoulement. Cela est réalisé en isolant d'abord des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine, puis en les mettant en culture. La deuxième étape consiste à répartir les cellules dans des chambres IBD.

Ensuite, des neutrophiles humains fraîchement isolés sont perfusés sur des cellules endothéliales activées, entraînant un roulement des neutrophiles, une adhésion ferme et une transmigration. La dernière étape consiste à quantifier la transmigration à l’aide de la microscopie vidéo. En fin de compte, la microscopie fluorescente et la microscopie en champ clair peuvent être utilisées pour évaluer la transmigration des neutrophiles à travers les cellules endothéliales activées.

L'isolement des cellules endothéliales est facile à décrire, mais difficile à apprendre en partie parce que certaines étapes clés nécessitent la visualisation du cordon ombilical. Pour cette raison, la démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Cette méthode nous aidera à comprendre des questions fondamentales dans le domaine de l'inflammation, telles que le recrutement des leucocytes en conditions d'écoulement, et le comportement des cellules endothéliales en conditions d'écoulement sera mieux compris.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le recrutement des neutrophiles pendant l'inflammation, elle peut également être appliquée à des populations rares de leucocytes telles que les cellules Natural Killer et les éosinophiles. Hong Jang, technicien dans mon laboratoire, démontre cette procédure aux côtés de Ritu Sharma. Au moins une heure avant la procédure, pré-incuber un flacon T 75 avec de la gélatine à 37 degrés Celsius.

Ensuite, commencez la procédure d'isolement des cellules endothéliales dans la hotte à flux laminaire en utilisant une paire de ciseaux pour couper un cordon ombilical provenant d'un placenta. Après avoir changé pour des gants stériles, examinez attentivement le cordon et jetez toute portion contenant des caillots sanguins ou présentant des lésions dues à la pince sur le cordon lors de l'accouchement. Identifiez ensuite les deux artères et la veine unique présentes dans le cordon.

Ensuite, insérez délicatement une canule munie d'un robinet à deux voies à une extrémité de la veine, puis placez une pince autour de la canule pour la maintenir fermement en place. L'une des parties les plus délicates de la procédure consiste à perfuser le cordon ombilical. Pour vous assurer que cette étape est réalisée avec succès, perfusez le cordon avec un excès de tampon et observez le flux jusqu'à ce qu'il devienne limpide.

Perfuser la veine avec du tampon de cordon jusqu'à ce que l'écoulement soit clair, puis pincer l'extrémité du cordon. Parfois, durant la perfusion, un petit trou apparaît parce que les médecins ont prélevé du sang du cordon ombilical. Dans ces cas, des pinces hémostatiques peuvent être utilisées pour obstruer le trou et la perfusion peut se poursuivre tout en isolant les cellules endothéliales.

Il est essentiel de contrôler précisément la durée du traitement à la collagénase. Une durée trop courte ne permet pas de récolter suffisamment de cellules endothéliales, tandis qu'une durée trop longue peut entraîner une contamination par des cellules musculaires lisses ou endommager les cellules endothéliales. Ensuite, perfuser la veine avec une solution fraîchement préparée de collagénase tiède.

Fermez le robinet et incubez le cordon dans un bécher contenant du tampon chaud pour cordon. Après 10 minutes, retirez-le puis massez doucement le cordon pour détacher les cellules endothéliales de la lumière de la veine. Évacuez la solution dans un tube contenant cinq millilitres de milieu pour cellules endothéliales ou ECM, puis rincez le cordon deux fois avec le tampon pour cordon afin d'éliminer les cellules résiduelles.

Faire centrifuger les cellules pendant 10 minutes à 350 × g, à température ambiante. Retirer le surnageant, puis resuspendre le culot dans 10 millilitres de milieu pour cellules endothéliales. Transférer les cellules dans un flacon T75 revêtu de gélatine et les cultiver toute la nuit à 37 °C et 5 % CO2. Le lendemain, agiter doucement le flacon pour détacher les globules rouges éventuels.

Ensuite, retirez le surnageant et lavez la culture de cellules endothéliales avec du HBSS tiède. Après avoir retiré le HBSS, alimentez les cellules avec 10 millilitres de milieu ECM tiède. Examinez ensuite les cellules au microscope afin de confirmer que les globules rouges ont été éliminés et d'évaluer le degré de confluence ainsi que la morphologie des cellules endothéliales.

Continuez à changer le milieu tous les trois jours jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence. À ce stade, séparez les cellules à l'aide d'une solution de trypsine et d'EDTA. Ensuite, récoltez les cellules détachées et remettez-les en suspension dans la matrice extracellulaire (ECM).

Enfin, recouvrir chaque puits d'une chambre IBD de gélatine. Éliminer l'excès de gélatine, puis ajouter 1,5 × 10⁶ cellules par millilitre de la suspension de cellules endothéliales dans chaque puits de la chambre. Commencer par induire la sur-expression des molécules d'adhésion et d'activation à la surface cellulaire en incubant les cellules endothéliales avec un stimulant approprié pendant l'activation des cellules endothéliales.

Isoler les neutrophiles à partir du sang périphérique de donneurs humains sains par centrifugation de densité selon une méthode déjà publiée, puis suspendre les cellules à une concentration de 1 × 10⁶ par millilitre dans du HBSS additionné d'albumine humaine. Après avoir mis en place le microscope, fixer la chambre IBD contenant les cellules endothéliales activées au tube du microscope. Sélectionner l'objectif de contraste de phase 10 ×, puis régler la pompe à perfusion pour aspirer et initier l'écoulement du HBSS à la contrainte de cisaillement souhaitée.

Arrêtez brièvement l'écoulement en tournant le robinet à trois voies du côté de la sortie vers la position fermée et en changeant la ligne d'entrée du HBSS aux neutrophiles isolés. Recommencez l'écoulement en remettant le robinet à trois voies en position ouverte. Commencez ensuite l'enregistrement à l'aide d'une caméra CCD connectée à un enregistreur DVD.

Démarrer le chronomètre. Lorsque les neutrophiles pénètrent dans la chambre après quatre minutes, revenir au HBSS pour empêcher l'attachement de nouveaux neutrophiles. Si l'on souhaite obtenir des données sur les interactions totales, le roulement et l'adhérence ferme, utiliser un objectif 10 x en contraste de phase.

Objectif d'acquérir six champs aléatoires pendant 10 secondes chacun entre la quatrième et la cinquième minute. Passez enfin à un objectif 40 x et enregistrez un seul champ de vision au moment d'intérêt. Après la perfusion des neutrophiles à 10 minutes, collectez entre cinq et dix champs de vision aléatoires.

Les cellules endothéliales non stimulées ne favorisent pas le recrutement des neutrophiles. Par conséquent, les figures suivantes montrent des neutrophiles interagissant avec des cellules endothéliales stimulées par le TNF alpha. Remarquez le neutrophile adhérent indiqué par la flèche jaune et le neutrophile en cours de transmigration désigné par la flèche blanche.

La transmigration des neutrophiles peut se produire au niveau des jonctions cellulaires ou à travers les cellules endothéliales elles-mêmes. Pour distinguer ces deux conditions, les cellules endothéliales ont été marquées avec un anticorps anti-VE cohérent. Comme indiqué ici en rouge, la transmigration est évaluée comme étant paracellulaire ou transcellulaire.

Dans ce modèle, pratiquement toute la transmigration est paracellulaire, comme le montre cette figure illustrant la superposition des deux figures précédentes. Dans ce premier graphique sur trois, les interactions des neutrophiles ont été examinées et mesurées à l'aide du logiciel ImageJ. Remarquez qu'un nombre significativement plus élevé d'interactions entre les neutrophiles et les cellules endothéliales activées par le TNF alpha s'est produit par rapport aux cellules endothéliales non stimulées du groupe témoin.

Les cellules interagissantes totales ont été davantage caractérisées comme roulant, adhérentes fermement ou en cours de transmigration, comme précédemment. Une transmigration significativement plus importante des neutrophiles a été observée dans les puits contenant des cellules endothéliales activées après l'isolement des cellules endothéliales. D'autres méthodes telles que le western blot, la PCR en temps réel et la mesure de la résistance endothéliale peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires liées à la biologie des cellules endothéliales après développement.

Cette méthode aidera les chercheurs dans le domaine de l'inflammation et de la biologie vasculaire à comprendre comment se déroule le recrutement des leucocytes en conditions d'écoulement dans un modèle humain. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine et de les utiliser pour étudier la transmigration des neutrophiles en conditions d'écoulement à l'aide d'une chambre à flux.