Extraction d'ARN à partir de cellules Neuroprecursor Utiliser le Bio-Rad ARN total Kit

Bonjour, je suis Josh Sh, étudiant diplômant au laboratoire du Dr Ed Maki à l'Université de Californie à Irvine. Je vais vous montrer comment extraire l'ARN à partir de cellules souches neuronales en utilisant ce kit BioRad To RNA Mini. J'utilise ce kit depuis plusieurs années déjà dans ce laboratoire, et il m'a toujours fourni des résultats reproductibles avec des rendements élevés.

Les cellules que nous utilisons sont des cellules souches neurales Eton et demi, dissociées de manière aiguë à partir de cortèges embryonnaires, et nous les mettons en culture, généralement dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits traitée, recouverte de PD L et de laminine, à raison de cent mille cellules par puits. Avant de commencer, je dois vous préciser que vous devez travailler sur un poste de travail désigné spécifiquement pour vos manipulations d'ARN. La première étape consiste à vous assurer que votre poste de travail pour l'ARN est propre.

La méthode appropriée pour nettoyer la paillasse consiste à utiliser ce produit RNA zap. En substance, il élimine tous les ARN, car l'agent actif détruit fondamentalement vos ARN. Une autre mesure importante est de toujours porter des gants lorsque vous manipulez l'extraction, car votre peau est remplie de ces ARN.

Donc, c'est absolument à proscrire. Bon, ce que j'ai ici est le kit mini total ADN de BioRad. J'en ai sorti le contenu, alors laissez-moi vous montrer ce qu'il contient.

La première chose est que nous avons un PBS traité avec X dep C et de l'éthanol traité à 70 % DEP. Nous disposons d'une solution de lyse d'ARN total à laquelle de l'éthanol Dan me en majuscule a été ajouté. La seconde est une solution de lavage à faible stringence contenant 100 % d'éthanol, le lavage à haute stringence, la solution de dilution de l'ADN, l'ADN lui-même et l'élution d'ARN total.

Donc la solution, que nous placerons dans le bloc chauffant à 70 degrés. Les autres éléments dont nous avons besoin sont des tubes à bouchon de 1,5 ml. Ces tubes ne contiennent ni ADN ni inhibiteurs, veillez donc à disposer de tubes qui ne contiennent pas ces substances.

Nous avons deux tubes de 2 ml sans bouchon. Et la chose la plus importante est la colonne à ARN elle-même. Sans elle, vous ne pouvez pas effectuer les extractions d'ARN.

Ainsi, pour assembler ces colonnes, vous avez besoin de la colonne d'ARN et de deux millicapillaires sans bouchon, que vous assemblez simplement comme ceci, et vous devriez être prêt à commencer. Très bien, et la dernière chose dont nous avons toujours besoin, ce sont ces cellules. Les cellules utilisées ici sont des cellules précurseurs neuronales Eton et demi.

Ils ont été dissociés de manière aiguë à partir de cortèges embryonnaires. Ils ont été cultivés pendant quelques jours dans un milieu Temple. J'ai sorti les cellules de l'incubateur à 37 degrés.

Ce protocole est spécifique aux cellules adhérentes. Ces cellules ont été cultivées sur des plaques de culture tissulaire traitées à 0,4 puits, revêtues de PDL et de laminine. Je vais maintenant prendre un tuyau d'aspiration et demander à rompre le milieu.

Et l'étape suivante consiste à ajouter environ 500 microlitres de SEA PBS dép. Et encore une fois, nous devons utiliser des embouts filtrants. Le PBS a pour fonction principale de rincer le milieu.

Ainsi, vous ne voulez aucun composant du milieu dans votre colonne d'ARN, au risque de perturber l'extraction d'ARN et d'obtenir de faibles rendements. Compris ? Je vais maintenant aspirer rapidement le PBS, car les cellules souches neuronales n'apprécient pas le PBS. J'ajoute maintenant 350 microlitres de tampon de lyse à chacun.

Bien, assurez-vous que vous avez de l'éthanol β à concentration élevée dans le tampon de lyse. Maintenant, je vais pipeter le tampon de lyse vers le haut et vers le bas 15 fois pour m'assurer que les cellules sont lysées. Ainsi, nous pouvons extraire le contenu en ARN.

Maintenant, je vais ajouter de l'éthanol 70 % dans chaque puits. Après avoir ajouté 350 microlitres de cet éthanol 70 %, je vais pipeter vers le haut et vers le bas chaque puits 10 fois. J'ai pipeté 10 fois vers le haut et vers le bas pour chacun. À présent, je vais régler mon pipeteur à plus de 700 microlitres, puisque le volume total de chaque puits est de 700 microlitres.

Ensuite, après avoir prélevé le matériel excédant 700 microlitres, je vais le dispenser dans une colonne à ARN. Après avoir ajouté le contenu de la colonne, je vais passer à la centrifugeuse et effectuer une centrifugation de 30 secondes à vitesse maximale. Après la première centrifugation du lysat pendant 32 secondes, je vais éliminer le filtrat en le versant dans un récipient vide.

Ou bien, certaines personnes utilisent un tuyau de soutien pour aspirer le filtrat. Ensuite, vous allez ajouter 700 microlitres du tampon de lavage à faible force ionique. Et encore une fois, assurez-vous d'ajouter l'éthanol à l'intérieur.

Maintenant, je vais centrifuger pendant 30 secondes à vitesse maximale. Après avoir centrifugé le tampon de lavage à faible force ionique, je vais jeter le filtrat. D'accord ? Ensuite, je vais préparer la solution d'ADN, la solution D.

Ainsi, pour chaque échantillon, vous allez ajouter cinq microlitres d'ADN. Pour notre part, nous aliquotons réellement l'ADN avant même de commencer cette étape, car encore une fois, il s'agit d'une enzyme.

Il est préférable de les conserver sous forme d'aliqotes. Si vous les conservez en bloc, les cycles de congélation et de décongélation détruiront l'activité enzymatique. Ainsi, après avoir ajouté cinq microlitres d'ADN, je vais les diluer avec 75 microlitres de solution de dilution de l'ADN.

Donc, après avoir ajouté cela, le volume total sera de 80 microlitres de solution d'ADN. Maintenant, je vais ajouter 80 microlitres de la solution d'ADN à chaque échantillon. Veillez à bien les déposer sur la membrane de la colonne.

Vous souhaitez donc que la solution d'ADN imprègne bien la membrane. Ainsi, vous éliminerez l'ADN. Ainsi, vous augmenterez votre rendement en ARN.

Après avoir ajouté les ADN, laissez la colonne reposer 15 minutes à température ambiante afin de permettre à l'enzyme d'agir. Incubez à nouveau pendant 15 minutes. Très bien, le minuteur est arrêté.

Après l'incubation de 15 minutes, je vais procéder à la centrifugation et centrifuger les ADN pendant 30 secondes à vitesse maximale. Bon, après avoir centrifugé pendant 30 secondes afin d'éliminer les ADN, je vais jeter le filtrat. Maintenant, je vais ajouter 700 microlitres d'un tampon à haute force ionique pour éliminer tout ADN résiduel.

Ensuite, après avoir ajouté cela, je vais effectuer une nouvelle centrifugation pendant 30 secondes supplémentaires. Après la centrifugation, je vais éliminer le filtrat à haute stringence, en le jetant simplement dans un récipient. Nous allons alors ajouter 700 microlitres du tampon à faible stringence.

Cette fois, je vais centrifuger pendant une minute à vitesse maximale à la Centri Beach. Après ce premier lavage d'une minute à faible force ionique, je vais éliminer le filtrat. Et cette fois, je n'ajouterai rien, mais je vais centrifuger à nouveau pendant deux minutes supplémentaires afin d'éliminer l'excès de solution à faible force ionique, car celle-ci contient de l'éthanol, ce qui réduirait votre rendement en ARN.

Maintenant, je vais sortir le tampon d'élution du bloc chauffant à 70 degrés. Pour vous rappeler, assurez-vous, avant de commencer l'expérience, d'avoir placé le tampon d'élution à 70 degrés, et nous voulons le garder au chaud afin d'augmenter l'efficacité de votre rendement en ARN. J'ai donc les colonnes prêtes.

Ils ont été sortis de la centrifugeuse. Donc, lors des prochaines étapes, ils retirent les colonnes. Bon, je vais jeter les tubes de capuchon et nous allons les transférer dans ces tubes à chat.

Vous allez ajouter 50 microlitres du tampon Lucian sur chaque colonne. Veillez à bien appliquer le tampon d'élution sur la membrane afin qu'elle l'absorbe correctement. Dans le cas contraire, vous n'obtiendrez pas un bon rendement en ARN.

Vous laissez maintenant la colonne reposer pendant une ou deux minutes afin de vous assurer que l'illusion imprègne bien la membrane de la colonne. Très bien, c'est maintenant une minute. Je peux maintenant l'emmener à la centrifugeuse.

Maintenant, je vais placer les colonnes dans la centrifugeuse. Je vais centrifuger pendant une minute à vitesse maximale. Cette étape de centrifugation est la dernière, au cours de laquelle vous récupérerez l'eluant ou l'ARN dans ces tubes munis de bouchons.

Maintenant, après la dernière centrifugation, retirez votre échantillon, enlevez la colonne, vous pouvez jeter celle-ci, fermez le tube, puis vous pouvez les conserver à −80 °C, et vous pourrez les utiliser ultérieurement selon vos besoins. J'ai donc extrait de l'ARN à l'aide du kit d'extraction d'ARN de BioRad. Maintenant, je vais mesurer la concentration de l'ARN extrait, ou bien lire la DO à l'aide d'un spectrophotomètre.

Voici donc ce que je vais vous montrer. Tout d'abord, nous devons préparer un mélange de dilution. Il s'agira d'une dilution au 1/5.

Nous allons mélanger notre ARN et de l'eau filtrée MQ. Je vais donc d'abord préparer un blanc. Je vais prélever deux microlitres de notre solution d'élution que nous utilisons pour éluer notre ARN au départ, puis j'ajouterai huit microlitres d'eau MQ. D'accord ?

C'est donc notre témoin. Maintenant, je vais préparer l'échantillon. Il contiendra deux microlitres, notre ARN d'intérêt.

Nous allons ajouter à nouveau huit microlitres d'eau MQ. Cela donnera une dilution au 1/5, n'est-ce pas ? J'ai ce tube en verre où je vais placer mes échantillons, puis je vais insérer ce tube dans le spectromètre.

Alors, mesurons cela. Avant de mesurer la DO des échantillons d'ARN, je devrai nettoyer ma cuvette. Encore une fois, voici la cuvette en verre.

Vous ne devez jamais toucher la face avant. Vous laisserez ainsi des empreintes qui fausseront les mesures. Alors, ce que je vais faire d'abord, c'est laver la lame en verre avec de l'eau doublement distillée et déionisée.

Ensuite, je vais prendre un tuyau sous vide. Je vais aspirer l'eau. Après ce lavage, je vais le laver avec de l'éthanol à 95 %, puis je vais utiliser à nouveau un tuyau sous vide pour éliminer l'éthanol.

Maintenant, je suis prêt à charger mon témoin. Nous avons besoin du témoin en premier afin de normaliser nos mesures. Je vais donc prélever 10 microlitres du mélange que nous venons de préparer.

Je vais donc mélanger notre solution de haut en bas pour obtenir un mélange homogène. Je vais l'amener au spectrophotomètre. Il s'agit de l'appareil Ultra Spec 3 avec sonde 100, et nous allons mesurer la concentration en ARN.

Ouvrez donc la machine et placez-la dans l'un de ces supports. Nous allons modifier les programmes de manière à ne lire que l'ARN. D'accord, encore une fois, nous avons effectué une dilution au 1/5.

Nous voulons donc régler notre facteur de dilution à cinq. Très bien, je suis prêt à commencer. Je vais donc appuyer sur « exécuter » afin de référencer le témoin.

Très bien, il est maintenant remis à zéro. Nous sommes donc prêts à mesurer notre échantillon. Je vais donc sortir la cuvette en verre.

Je vais aspirer le contenu du témoin. Encore une fois, je vais le rincer avec de l'eau doublement distillée. Je vais le rincer avec de l'éthanol à 95 %.

J'aimerais maintenant charger 10 microlitres de notre échantillon d'intérêt. Encore une fois, assurez-vous de bien mélanger votre échantillon. Versez-le ensuite dans la cuvette en verre.

Nous sommes maintenant prêts à effectuer la lecture. Après avoir mesuré l'OD, un bon rendement en parité devrait présenter un rapport d'absorbance ARN à 260/280 d'environ 2. Le rendement est d'environ 144 microgrammes par millilitre.

Bien que la machine indique 72 microgrammes par millilitre, nous devons multiplier cette valeur par deux en raison de la demi-longueur de nos cuvettes. Deux centimètres vous ont montré comment extraire l'ARN à partir de cellules souches neuronales. Encore une fois, nous utilisons le kit total mini ARN de BioRad. Nous avons essayé d'autres kits et celui-ci est le meilleur que nous utilisons en fonction de son efficacité.

Cela permet d'obtenir de l'ARN de haute qualité. Si vous utilisez ce kit, vous obtiendrez les mêmes résultats de haute qualité que ceux que nous obtenons toujours.