Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

L'objectif général de l'expérience suivante est d'imaginer l'activité neuronale de la souris au moyen de l'IRM rehaussée au manganèse. Cela est réalisé en stimulant unilatéralement la vibrissation et en cartographiant la réponse neuronale dans le cortex du champ barillet controlatéral. La première étape consiste à assembler et à étalonner le système d'échographie composé d'un transducteur ultrasonore non focalisé piloté par le générateur de signaux et l'amplificateur pour l'expérience.

Après une injection intrapéritonéale de manganèse, la barrière hémato-encéphalique est ouverte à l'aide d'ultrasons et de microbulles, permettant ainsi au manganèse d'entrer dans le parenchyme cérébral. Ensuite, la souris est soumise à un paradigme de stimulation neuronale, entraînant une accumulation plus importante de manganèse dans les régions cérébrales les plus actives. Enfin, des images IRM sont obtenues, montrant des différences régionales d'intensité en imagerie pondérée en T1 selon les niveaux d'accumulation de manganèse dans le cerveau.

En neurosciences, la souris constitue le système modèle dominant pour l'étude des bases génétiques et moléculaires du développement cérébral et des maladies neurologiques. Cette technique offre un outil non invasif permettant de cartographier l'activité neuronale chez ces modèles murins. Non seulement la disruption ultrasonore de la barrière hémato-encéphalique peut être utilisée pour délivrer du manganèse dans le parenchyme cérébral aux fins d'imagerie neurofonctionnelle, mais elle permet également d'acheminer une grande variété d'autres composés vers le parenchyme cérébral, notamment des agents de contraste à base de gadolinium ou des chimiothérapeutiques.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés à calibrer le système d'échographie et à manipuler les microbilles. La démonstration de la procédure sera effectuée par chacun des techniciens de notre laboratoire. Le système d'échographie est composé d'un transducteur ultrasonore à élément unique, dont le diamètre est suffisamment grand pour couvrir l'ensemble du cerveau de la souris, et dont la fréquence centrale se situe dans la gamme de deux mégahertz.

Le transducteur est actionné par un générateur de signaux et un amplificateur de puissance de 50 décibels, qui produit la séquence d'impulsions ultrasonores. Étalonner le système ultrasonore dans un réservoir d'eau. Placer l'hydrophone au fond du réservoir et positionner le transducteur au-dessus à l'aide d'une plateforme de translation à trois axes.

Appliquez ensuite une courte série d'impulsions sinusoïdales au transducteur et ajustez la platine pour trouver la réponse maximale, qui doit se situer au centre du faisceau ultrasonore et au foyer naturel du transducteur. Ensuite, effectuez plusieurs mesures de pression acoustique pour une gamme de tensions d'entrée et utilisez une régression linéaire pour estimer la relation entre la tension d'entrée et la pression acoustique. Déterminez l'amplitude de l'impulsion permettant de générer une pression acoustique négative maximale d'environ 0,36 mégapascals.

À cette étape, anesthésiez l'animal en administrant l'isoflurane par le cône nasal. L'appareil à cône nasal doit fixer la tête de l'animal de manière précise et fiable dans la même position à chaque fois ; notre dispositif maintient la tête dans une position plane par rapport au crâne. Pendant l'expérience, utilisez un oreiller pneumatique pour surveiller la fréquence respiratoire et ajuster l'anesthésique afin de maintenir une fréquence respiratoire comprise entre 85 et 125 cycles par minute. En même temps, surveillez la température de l'animal à l’aide d’une sonde rectale et maintenez sa température corporelle à l’aide d’une lampe chauffante ou d’air soufflé.

Ensuite, insérez un cathéter veineux fémoral et un cathéter intrapéritonéal chez l'animal. L'étape suivante consiste à raser les poils afin de démontrer une stimulation unilatérale du VII et cartographier la réponse neuronale dans le cortex du champ barillet controlatéral. Sectionnez le VII controlatéral le plus près possible de la surface de la peau sans irriter le follicule ou la peau environnante.

Ensuite, transférez l'animal vers le système d'échographie et appliquez le gel échographique sur le cuir chevelu, puis placez une feuille mince en plastique contenant une colonne d'eau sur la tête. À travers la colonne d'eau, utilisez un coton-tige pour extraire les bulles d'air éventuellement piégées dans le gel échographique. Positionnez ensuite le transducteur échographique dans l'eau, à sa distance focale naturelle, directement au-dessus du cerveau de la souris, et essuyez le transducteur avec le doigt pour éliminer toute bulle d'air résiduelle.

Ensuite, produire les microsphères lipidiques de Perrin en agitant le flacon dans l'agitateur pendant 45 secondes pendant le travail. Laisser le flacon à température ambiante, mais le conserver au réfrigérateur après la dernière utilisation de la journée, avant la première utilisation. Les jours suivants, agiter à nouveau le flacon stocké dans l'agitateur.

Ensuite, injectez 0,5 millimole par kilogramme de chlorure de manganèse par voie intrapéritonéale et attendez 10 minutes pour permettre sa distribution. Puis agitez manuellement le flacon de microbulles pendant une minute afin de resuspendre les microsphères. Par la suite, aspirez 30 microlitres plus le volume mort de la cathéter.

Veillez à ne pas injecter d'air dans le flacon car cela dégraderait les microbulles restantes. Commencez immédiatement la séquence d'impulsions ultrasonores et injectez les microsphères par le cathéter de la veine caudale avec un délai minimal. Poursuivez la sonication pendant trois minutes.

Ensuite, éteignez le système d'échographie. Une fois que le niveau de manganèse dans le cerveau s'est stabilisé pendant environ 40 minutes, éteignez l'isoflurane et retirez le cône nasal. À ce stade, commencez le paradigme de stimulation neuronale afin de cartographier le cortex du champ barillet.

Déplacer un pinceau en mouvement circulaire à une fréquence d’environ un à cinq hertz à travers le réseau de vibreurs controlatéral pendant 90 minutes. Reprendre l’anesthésie après la stimulation, puis continuer à maintenir la température corporelle et ajuster le niveau d’isoflurane afin d’obtenir une fréquence respiratoire comprise entre 85 et 125 cycles par minute. Ensuite, placer la souris dans une bobine d’IRM et la transférer vers le système d’IRM.

Ensuite, acquérez les images pondérées en T1 à haute résolution en trois DT, comme indiqué ici. La rupture de la barrière hémato-encéphalique après l'administration d'un agent de contraste raccourcissant le T1, tel que le manganèse ou un agent à base de gadolinium, entraîne une augmentation du signal dans le parenchyme cérébral en imagerie pondérée en T1, par comparaison aux cerveaux où la BOMA n'a pas été réalisée. Voici les cartes d'activité neuronale générées par la stimulation unilatérale du risi chez sept animaux, présentées dans la première colonne.

Les cartes de différence à deux emplacements distincts montrent un signal IRM accru controlatéral à la stimulation par brissy. Dans la deuxième colonne, les cartes de valeurs-p indiquent la signification relative de ces différences. Dans la troisième colonne, les diagrammes correspondants de l'atlas cérébral montrent que ces régions actives correspondent au champ des barillettes du cortex sensoriel primaire.

Après un certain entraînement, cette technique peut être réalisée en environ deux heures, plus la durée de la simulation. Lors de l'exécution de la procédure, il est important de bien agiter le flacon de microbulles avant l'injection et de faire attention à ne pas injecter d'air dans le flacon. En outre, il est essentiel de s'assurer qu'aucune bulle d'air n'est piégée dans le gel échographique ou sous le transducteur échographique.

Pour cette démonstration, nous avons choisi de stimuler les vibrisses, mais il est évident que cette technique peut être adaptée pour étudier tout stimulus d'intérêt. Après la procédure, l'animal peut se remettre complètement, permettant des études longitudinales.