Imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes en tranches aiguës du cerveau antérieur souris adultes

L’objectif global de cette procédure est d’étudier la migration des neuroblastes dans des tranches aiguës du cerveau de souris adulte. Ceci est accompli en marquant d’abord les précurseurs neuronaux dans la zone sous-ventriculaire adulte cinq à huit jours après le marquage des neuroblastes, préparez des tranches aiguës de la souris pour le cerveau. Ensuite, l’imagerie en accéléré de la migration des neuroblastes est effectuée.

En fin de compte, la microscopie en temps réel à champ large est utilisée pour montrer la dynamique de la migration des neuroblastes dans les coupes aiguës. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine du développement neuronal en étudiant le rôle de différents signaux moléculaires et mécanismes cellulaires impliquant la migration cellulaire. Maintenant, cette méthode peut donner un aperçu des processus physiologiques régulant la migration neuronale chez un adulte pour le cerveau, mais elle peut également être appliquée dans d’autres systèmes tels que l’étude de la migration neuronale dans le cerveau ischémique et pendant le développement embryonnaire.

Commencez cette procédure en préparant un liquide céphalo-rachidien artificiel à base de saccharose pour couper les tranches et un LCR à base de chlorure de sodium à 32 degrés Celsius pour maintenir les tranches jusqu’à l’imagerie, puis oxygénez les solutions en les faisant bouillir continuellement avec 95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, anesthésie la souris avec le neuroblaste marqué par fluorescence en utilisant de la kétamine xylazine en interallye. Préparez ensuite rapidement la solution de découpe glacée à l’aspect gélatineux à l’aide d’azote liquide.

Après cela, prélevez 15 à 20 millilitres de solution de découpe à froid glacé avec une seringue de 20 cc et perfuser la souris à l’intérieur du Cardi. Si les vaisseaux sanguins doivent être marqués au lieu d’être perfusés avec la solution de coupe, injectez 200 microlitres de dextran Texas red à une concentration de 10 milligrammes par millilitre, trans Cardi dans le ventricule gauche du cœur, et attendez deux à trois minutes avant de décapiter la souris après la perfusion transcardique, décapitez rapidement la souris, plongez rapidement la tête dans la solution de coupe glacée et déplacez-la vers le vibrato. Coupez le crâne avec des ciseaux le long de la suture sagittale du cervelet au bulbe olfactif.

Par la suite, retirez délicatement les lambeaux crâniens à l’aide d’une paire de pinces. Ensuite, excisez la partie du cerveau dorlotée à l’aide d’un scalpel. Faites ensuite deux coupes sagittales sur la partie la plus latérale de chaque hémisphère, et coupez le cerveau le long de la fissure intra-hémisphérique. Retirez ensuite délicatement le cerveau à l’aide d’une spatule et placez-le dans une solution de découpe à froid.

Placez les deux hémisphères séparément sur un bloc de gélose à 4 %, la face dorsale touchant la gélose. Ensuite, collez le bloc avec le côté coupé latéralement des deux hémisphères sur la plate-forme d’un Vibram avec le côté médial vers le haut. Après cela, placez la plate-forme dans la chambre Vibram.

Remplissez-le avec la solution de coupe. Ensuite, gardez la solution oxygénée tout au long de la préparation de la tranche en la faisant bouillonner avec 95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone. Préparez maintenant les sections de 250 microns d’épaisseur avec le vibromasseur.

Une faible vitesse de coupe et des vibrations de lame à haute fréquence doivent être utilisées pour obtenir des sections de haute qualité. Dès qu’une tranche est libérée de la lame, retirez-la délicatement de la solution de coupe et placez-la dans une chambre d’incubation remplie de LCR A oxygéné maintenu à 32 degrés Celsius dans un bain-marie. Dans cette procédure, placez soigneusement la coupe dans la chambre d’imagerie du microscope pour éviter la dérive de la coupe pendant l’imagerie.

Stabilisez-le en plaçant soigneusement une maille en nylon sur le dessus. Assurez-vous que la tranche est continuellement perfusée avec un LCR. Ensuite, utilisez un objectif 10 x pour trouver un champ d’intérêt.

Ouvrez le logiciel metamorph et assurez-vous que le treillis en nylon n’obstrue pas le champ d’imagerie. Engagez ensuite l’objectif 40x et ajustez la mise au point. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de solution entre l’objectif et la tranche.

À l’aide du logiciel metamorph, définissez les paramètres d’acquisition en accéléré, tels que la durée de l’excitation, le nombre de plans Z, la distance entre chaque section Z, l’intervalle de temps et la durée d’enregistrement. Lancez ensuite l’acquisition en accéléré. Les données sont automatiquement enregistrées par Metamorph sous forme de fichier tiff, chaque fichier correspondant à un point temporel de la vidéo time lapse acquise pour ouvrir le film dans Mrs.Chargez

les images acquises en glissant et déposant simplement la première image de point temporel de la vidéo dans l’icône du programme. Une fois la vidéo chargée, ajustez la luminosité et le contraste du signal dans la fenêtre de réglage de l’affichage. Définissez les paramètres de la vidéo acquise, tels que la taille du voxel et l’intervalle de temps dans les propriétés de l’image, et définissez des fenêtres de points temporels équidistants.

Après avoir spécifié la taille du voxel, il est possible de voir l’image en 3D ainsi que le temps et l’échelle de la vidéo pour suivre automatiquement les cellules enregistrées. Créez un spot pour chaque cellule du champ dans la fenêtre de surpasse en choisissant la fonction spots, mesurez le diamètre de la cellule à suivre dans la fenêtre de tranche. Définissez les paramètres de suivi et continuez.

Inspectez la fiabilité des objets détectés au fil du temps. Si toutes les cellules migrantes ne sont pas détectées automatiquement, modifiez le seuil de détection et assurez-vous que toutes les cellules ont été sélectionnées avec des points à tous les points temporels. La distance maximale et la taille maximale de l’espace entre deux points représentant des points temporels voisins de la même piste doivent être spécifiées afin que le programme puisse connecter les points temporels.

Une fois les pistes créées, il est possible de les filtrer et de supprimer les pistes non pertinentes en les supprimant simplement. Les pistes peuvent être corrigées en connectant et en déconnectant différentes pistes et différents points temporels d’une même piste dès que toutes les corrections ont été effectuées. Jetez un dernier coup d’œil aux pistes et exportez les données, y compris le déplacement de cellule par point temporel, la longueur de la piste, la longueur de déplacement et la durée de la piste dans un fichier Excel.

Cette vidéo montre l’imagerie en accéléré de la migration des neuroblastes verts le long des vaisseaux sanguins marqués en dextran, marqués en rouge au Texas. Notez que les neuroblastes migrateurs montrent un comportement saltatoire lorsque les phases migratoires sont interrompues par des périodes stationnaires. Et cette vidéo montre le suivi de la migration des neuroblastes par le logiciel imas.

Les sphères et les lignes indiquent respectivement les corps cellulaires et les voies de migration des cellules individuelles. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que des tranches de vie aiguë de bonne qualité du cerveau antérieur de souris adulte doivent être obtenues. De plus, les coupes doivent être bien stabilisées dans la chambre d’imagerie en plaçant soigneusement un treillis en nylon pour éviter la dérive de la tranche pendant l’imagerie.

Tout changement dans le taux de perfusion du LCR A, une perfusion irrégulière ou une variation drastique de la température peut provoquer une dérive et des modifications du plan focal pendant l’imagerie. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’enregistrer et d’analyser la migration des neuroblastes dans les tranches aiguës d’adultes. Nous recommandons d’utiliser un intervalle médical court de l’ordre de 15 à 30 secondes pour identifier de manière fiable le début et la fin des phases migratoire et stationnaire.