Protocoles de coloration pour des îlots pancréatiques humains
May 23rd, 2012
Cette vidéo montre des procédures pour la caractérisation des îlots pancréatiques humains en utilisant l'hématoxyline et l'éosine (H & E) et l'immunohistochimie (IHC). Sections du pancréas, de la tête, le corps et les régions de la queue sont colorées à la fois par H & E et IHC pour déterminer la composition du système endocrinien îlot (insuline, le glucagon, et le polypeptide pancréatique), la réplication des cellules (Ki67), et des infiltrats inflammatoires (H & E, CD3). La région est localisée
L’objectif général de cette procédure est de caractériser les œillets pancréatiques humains à l’aide de la coloration à l’hématine et à l’éosine et de l’immunohistochimie. Ceci est accompli en créant des coupes en série à partir d’un échantillon de pancréas intégré dans un bloc de paraffine. Les sections sont ensuite placées sur des diapositives dans leur orientation d’origine.
Une partie des lames est colorée à l’hématine et à l’eoïne tandis que les lames restantes sont colorées par immunohistochimie, l’étape finale consiste à scanner les lames colorées et à les organiser par cas. En fin de compte, ces images peuvent être téléchargées dans une base de données de pathologie en ligne où elles peuvent être consultées par d’autres chercheurs dans le domaine. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que les lames sont colorées en série tout en conservant leur orientation d’origine.
Linda Snyder, technologue histo, Emily Montgomery, biologiste, et Tiffany Hippo, technicienne de laboratoire dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, installez le bain-marie et le microtome en suivant les procédures standard pour la microtomie à la paraffine. Ensuite, étiquetez les lames chargées positivement avec le numéro de cas, la région du pancréas et le numéro de la lame.
Une fois que tout est prêt, placez le bloc de paraffine dans le mandrin du microtome avec l’étiquette de la cassette sur le côté gauche. Après les procédures normales de microtomie, sectionnez le bloc jusqu’à ce que le tissu soit uniformément exposé. Une fois que le tissu est uniformément rencontré, produisez un ruban de sections en série d’environ quatre microns d’épaisseur.
Trois à six sections sont nécessaires en fonction du nombre de taches initiales requises. Ensuite, séparez les sections du ruban. Prenez chaque section dans l’ordre et placez-la sur une diapositive.
Notez le numéro de section avec un crayon. Si une section est inutilisable, sautez ce numéro et continuez à numéroter les sections dans l’ordre exact. Prenez soin de garder la même orientation sur la diapositive que celle que l’on trouve dans la cassette avec l’étiquette de la diapositive orientée vers la gauche.
Ensuite, placez les diapositives dans un support à diapositives et laissez-les sécher pendant la nuit. À température ambiante, refermez la surface du bloc de paraffine avec une fine couche de paraffine pour préserver le tissu et archivez-le à température ambiante ou moins 20 degrés Celsius. Répétez cette procédure pour l’échantillon suivant.
Il est important de maintenir la numérotation des sections en série à chaque niveau, comme vu ci-dessus pour la coloration h et e. Placez la première diapositive de chaque bloc dans un support de diapositives, puis placez le support dans le premier plateau de la coloration automatique. Sélectionnez le programme HE standard et lancez le processus de coloration.
Lorsque la coloration est terminée, retirez les lames de la tache automatique et placez-les dans le capot pour que le couvercle puisse glisser. Placez une lamelle sur chaque lame en utilisant des techniques standard. Enfin, étiquetez les lames avec une étiquette imprimée et laissez-les sécher complètement dans la capuche.
Commencez par configurer le colorateur automatique et préparez tous les réactifs nécessaires. Choisissez le programme Daco pour les teintures doubles. Entrez le nombre de lames et le traitement que chacune d’entre elles recevra.
Chargez tous les réactifs dans le colorateur automatique conformément aux recommandations du fabricant. Ensuite, préparez le TBST et le citrate, les tampons, les anticorps et les autres réactifs nécessaires à la procédure. Déparisez les lames en les plaçant dans du xylène pendant cinq minutes.
Ne laissez pas les lames se dessécher car cela entraînerait une coloration excessive du fond et des pores pendant que les lames sont éteintes. Versez le tampon de citrate dans un cuiseur vapeur pour le préchauffer avant utilisation. Ensuite, soumettez les lames de depa à une série de lavages à l’éthanol.
Rincez une dernière fois les lames à l’eau déminéralisée. Ajoutez les lames dans le tampon de citrate préchauffé et laissez-les cuire à la vapeur pendant 30 minutes. Après cette période, transférez immédiatement les lames dans un bain-marie à température ambiante jusqu’à ce qu’elles refroidissent complètement.
Une fois refroidies, transférez les lames dans les supports de coloration automatique Dayco, en prenant soin de maintenir la bonne séquence. Enfin, exécutez le programme de coloration double qui a été chargé précédemment lorsque le programme de coloration double est terminé. Retirez les lames du colorant automatique et laissez-les sécher pendant au moins une heure avant de les déshydrater.
Pour continuer la déshydratation, transférez-les à 80 % d’éthanol pendant une minute. Continuez à déshydrater les lames en les trempant dans de l’éthanol à 95 %, puis à 100 %. Enfin, trempez et maintenez les lames dans du xylène pendant une minute.
Montez immédiatement les lames avec des lamelles à l’aide du sceau cyto pour terminer la procédure. Imprimez des étiquettes contenant des informations sur le cas, y compris le numéro d’organe et de bloc, le type de tache et la date. Placez une étiquette sur chaque lame pour scanner les lames de teinture.
Placez-les sur un plateau de scanner et suivez les procédures habituelles. Archivez les lames de teinture à température ambiante et toutes les lames non tachées restantes à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation future. Enfin, organisez les images colorées par donneur et par type de tissu vu.
Voici un exemple de coloration à l’insuline KI 67 plus à des niveaux de grossissement faibles et élevés. Les images des coupes pancréatiques colorées sont soumises à une base de données de pathologie en ligne, créant ainsi une biobanque virtuelle. Grâce à cette base de données, les chercheurs peuvent accéder rapidement aux informations nécessaires à la recherche sur le diabète de type 1.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer et de colorer des lames de haute qualité à partir du pancréas humain.
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Aperçu
Cette vidéo démontre les procédures pour la caractérisation des îlots pancréatiques humains en utilisant la coloration hématoxyline-éosine (H&E) et l'immunohistochimie (IHC). La technique permet l'évaluation de la composition endocrine des îlots, de la réplication cellulaire et des infiltrats inflammatoires.
Composantes clés de l'étude
Domaine de la science
- Neurosciences
- Endocrinologie
- Histologie
Contexte
- Les îlots pancréatiques humains jouent un rôle crucial dans le métabolisme du glucose.
- La caractérisation de la composition des îlots est essentielle pour comprendre le diabète.
- H&E et IHC sont des techniques standard pour l'analyse des tissus.
- Le maintien de l'orientation originale des lames est crucial pour une évaluation précise.
Objectif de l'étude
- Caractériser les îlots pancréatiques humains.
- Déterminer la composition endocrine des îlots.
- Évaluer la réplication cellulaire et les réponses inflammatoires.
Méthodes utilisées
- Création de sections sérielles à partir d'échantillons de pancréas en paraffine.
- Coloration des sections avec H&E et IHC.
- Scan des lames colorées pour analyse.
- Organisation des images par cas pour le téléchargement dans la base de données.
Principaux résultats
- Identification de l'insuline, du glucagon et du polypeptide pancréatique dans les îlots.
- Évaluation de la réplication cellulaire en utilisant la coloration Ki67.
- Évaluation des infiltrats inflammatoires par coloration H&E et CD3.
- Localisation réussie de la région uncinée en utilisant l'IHC.
Conclusions
- La méthode fournit une caractérisation complète des îlots pancréatiques.
- Le maintien de l'orientation originale des lames améliore la précision de l'analyse.
- Les résultats contribuent à la compréhension de la fonction pancréatique en santé et en maladie.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Standardized histopathology workflows for human pancreatic islets enable reproducible endocrine cell characterization, supporting target validation in diabetes research. By preserving serial section orientation and generating digitized whole-slide images, the method facilitates cross-functional data sharing and biobanking for mechanistic de-risking of islet-targeted therapies. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by providing quantifiable, spatially resolved data on islet composition, replication, and immune infiltrates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through rigorous histopathology and immunolocalization of islet endocrine cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking by characterizing islet morphology, size, density, and endocrine cell composition using H&E and IHC stains.
- Predictive Value: Assists in portfolio triage by evaluating islet replication and apoptotic cells via Ki67 and other proliferation markers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized processing of human pancreas into defined regions (head, body, tail) and transverse sections.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility by numbering and alphabetically denoting subsections based on size for complete cross-sectional analysis.
- Platform Value: Highlights screening readiness and scalability via digitized whole-slide images organized in an online pathology database accessible to over 200 researchers.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by evaluating islets for inflammation, fibrosis, amyloid, and T-cell infiltrates using H&E and CD3 staining.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by assessing both endocrine and exocrine compartments, including ductular pathology and neoplasia.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses on predictive de-risking by characterizing pancreatic intraductal neoplasia and its relationship to the duct system.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical assessment by enabling serial sectioning, standardized staining, and digital biobanking of human pancreatic tissue.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through histopathology and immunolocalization of pancreatic islets and endocrine cells.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility by maintaining original slide orientation during serial sectioning and staining in series.
- Analytics: Highlights quantitative measurements of islet area, numbers, endocrine cell composition, replication, and T-cell infiltrates via H&E and IHC to enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by evaluating islet amyloid, fibrosis, and inflammatory infiltrates relevant to type 1 diabetes pathogenesis.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability through an online pathology database that provides rapid data sharing and block selection for paraffin or frozen serial sections.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in islet endocrine composition and immune interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of serial sectioning, staining, and digital slide archiving.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early identification of islet pathology and replication status.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantifiable islet morphology, density, and endocrine cell phenotypes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histotechnology, immunohistochemistry, and digital pathology workflows.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including microtome, auto stainer, slide scanner, and online pathology database access.
- Cross-team standardization requirements for slide labeling, section numbering, and orientation maintenance across histology and imaging teams.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for applying standardized regional processing (head, body, tail) to non-human pancreata.
- Practical limitations include tissue variability from organ donors and the need for optimized antibody validation for multiplex IHC staining.
