Protocoles de coloration pour des îlots pancréatiques humains
23 mai 2012
Cette vidéo montre des procédures pour la caractérisation des îlots pancréatiques humains en utilisant l'hématoxyline et l'éosine (H & E) et l'immunohistochimie (IHC). Sections du pancréas, de la tête, le corps et les régions de la queue sont colorées à la fois par H & E et IHC pour déterminer la composition du système endocrinien îlot (insuline, le glucagon, et le polypeptide pancréatique), la réplication des cellules (Ki67), et des infiltrats inflammatoires (H & E, CD3). La région est localisée
L'objectif général de cette procédure est de caractériser les ilots pancréatiques humains à l'aide de la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine et de l'immunohistochimie. Cela est réalisé en créant des coupes sériées à partir d'un échantillon de pancréas inclus dans un bloc de paraffine. Les coupes sont ensuite placées sur des lames en conservant leur orientation d'origine.
Une partie des lames est colorée à l'hématine et à l'éosine, tandis que les lames restantes sont colorées par immunohistochimie ; la dernière étape consiste à numériser les lames colorées et à les organiser par cas. En définitive, ces images peuvent être téléchargées vers une base de données en ligne de pathologie, où elles peuvent être consultées par d'autres chercheurs du domaine. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que les lames sont colorées en série tout en conservant leur orientation d'origine.
La procédure sera démontrée par Linda Snyder, technicienne en histologie, Emily Montgomery, scientifique en biologie, et Tiffany Hippo, technicienne de laboratoire dans mon laboratoire. Commencez par installer le bain-marie et le microtome selon les procédures standard pour la microtomie à la paraffine. Ensuite, étiquetez les lames chargées positivement avec le numéro de cas, la région du pancréas et le numéro de lame.
Une fois que tout est préparé, placez le bloc de paraffine dans le porte-bloc du microtome avec l'étiquette de la cassette sur le côté gauche. En suivant les procédures habituelles de microtomie, sectionnez le bloc jusqu'à ce que le tissu soit uniformément exposé. Une fois que le tissu apparaît de manière homogène, produisez un ruban de sections sériées d'environ quatre micromètres d'épaisseur.
Trois à six sections sont nécessaires selon le nombre de colorations initiales requises. Ensuite, séparez les sections du ruban. Prenez chaque section dans l'ordre et placez-la sur une lame.
Enregistrez le numéro de section au crayon. Si une section est inutilisable, sautez ce numéro et continuez à numéroter les sections dans l'ordre exact. Veillez à conserver l'orientation identique sur la lame à celle trouvée dans la cassette, avec l'étiquette de la lame orientée vers la gauche.
Ensuite, placez les lames dans un porte-lames et laissez-les sécher toute la nuit. À température ambiante, refermez la surface du bloc de paraffine avec une fine couche de paraffine afin de préserver le tissu, puis archivez-le à température ambiante ou à moins 20 degrés Celsius. Répétez cette procédure pour l'échantillon suivant.
Il est important de conserver la numérotation des coupes sérielles à chaque niveau, comme indiqué ci-dessus pour la coloration H et E. Placer la première lame de chaque bloc dans un porte-lame, puis insérer le porte-lame dans le premier bac du colorateur automatique. Sélectionner le programme standard HE et démarrer le processus de coloration.
Lorsque la coloration est terminée, retirez les lames du colorateur automatique et placez-les sous la hotte pour la pose des lamelles. Appliquez une lamelle sur chaque lame en utilisant des techniques standard. Enfin, étiquetez les lames avec une étiquette imprimée et laissez-les sécher complètement sous la hotte.
Commencez par installer le colorateur automatique et préparer tous les réactifs nécessaires. Choisissez le programme Daco pour les colorations doubles. Saisissez le nombre de lames et le traitement à appliquer à chacune.
Chargez tous les réactifs dans l'auto-staineur selon les recommandations du fabricant. Préparez ensuite le TBST et le citrate, les tampons, les anticorps et les autres réactifs nécessaires à la procédure. Déparaffinez les lames en les plaçant dans le xylène pendant cinq minutes.
Ne laissez pas les lames sécher, car cela entraînerait un fond élevé et une coloration des pores pendant la déparaffination. Versez du tampon citrate dans un appareil à vapeur pour le préchauffer avant utilisation. Ensuite, soumettez les lames déparaffinées à une série de lavages à l'éthanol.
Rincez les lames une dernière fois avec de l'eau déionisée. Ajoutez les lames au tampon citrate préchauffé et laissez-les chauffer à la vapeur pendant 30 minutes. À l'issue de cette période, transférez immédiatement les lames dans un bain d'eau à température ambiante jusqu'à ce qu'elles refroidissent complètement.
Une fois refroidies, transférez les lames dans les supports du colorateur automatique Dayco en veillant à conserver la séquence appropriée. Enfin, lancez le programme de double coloration qui avait été chargé précédemment ; une fois le programme de double coloration terminé, retirez les lames du colorateur automatique et laissez-les sécher pendant au moins une heure avant la déshydratation.
Pour poursuivre la déshydratation, transférez-les dans de l'éthanol à 80 % pendant une minute. Poursuivez la déshydratation des lames en les faisant tremper dans de l'éthanol à 95 %, puis dans de l'éthanol à 100 %. Enfin, plongez les lames dans le xylène et maintenez-les immergées pendant une minute.
Montez immédiatement les lames avec des lamelles en utilisant du Cyto Seal pour terminer la procédure. Imprimez des étiquettes contenant les informations du cas, y compris l'organe et le numéro de bloc, le type de coloration et la date. Placez une étiquette sur chaque lame afin de numériser les lames colorées.
Placez-les sur le plateau d'un scanner et suivez les procédures standard. Archivez les lames colorées à température ambiante et toutes les lames restantes non colorées à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Enfin, organisez les images colorées selon le donneur et le type de tissu observé.
Voici un exemple de coloration pour KI 67 et l'insuline à faible et forte amplification. Les images des coupes pancréatiques colorées sont soumises à une base de données en ligne de pathologie, créant ainsi une biobanque virtuelle. À l’aide de cette base de données, les chercheurs peuvent rapidement accéder aux informations nécessaires pour la recherche sur le diabète de type 1.
Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer et colorer des lames de haute qualité à partir du pancréas humain.
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Aperçu
Ce vidéo montre les procédures permettant la caractérisation des îlots pancréatiques humains à l'aide de la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) et de l'immunohistochimie (IHC). Cette technique permet d'évaluer la composition endocrine des îlots, la réplication cellulaire et les infiltrats inflammatoires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Endocrinologie
- Histologie
Contexte
- Les îlots pancréatiques humains jouent un rôle crucial dans le métabolisme du glucose.
- La caractérisation de la composition des îlots est essentielle pour comprendre le diabète.
- L'hématoxyline-éosine et l'immunohistochimie sont des techniques classiques pour l'analyse des tissus.
- Le maintien de l'orientation d'origine des lames est essentiel pour une évaluation précise.
Objectif de l'étude
- Caractériser les îlots pancréatiques humains.
- Déterminer la composition endocrine des îlots.
- Évaluer la réplication cellulaire et les réponses inflammatoires.
Méthodes utilisées
- Préparation de coupes sériées à partir d'échantillons de pancréas inclus en paraffine.
- Coloration des coupes avec l'hématoxyline-éosine (H&E) et l'immunohistochimie (IHC).
- Numérisation des lames colorées pour analyse.
- Organisation des images par cas en vue d'un chargement dans une base de données.
Résultats principaux
- Identification de l'insuline, du glucagon et du polypeptide pancréatique dans les îlots.
- Évaluation de la réplication cellulaire par coloration au Ki67.
- Analyse des infiltrats inflammatoires par coloration H&E et CD3.
- Localisation réussie de la région unciforme par immunohistochimie.
Conclusions
- La méthode permet une caractérisation complète des îlots pancréatiques.
- Le maintien de l'orientation d'origine de la lame améliore la précision de l'analyse.
- Les résultats contribuent à la compréhension du fonctionnement pancréatique en santé et en pathologie.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Les protocoles normalisés d’histopathologie pour les îlots pancréatiques humains permettent une caractérisation reproductible des cellules endocrines, soutenant ainsi la validation de cibles en recherche sur le diabète. En préservant l’orientation des coupes sérielles et en produisant des images numérisées de diapositives entières, cette méthode facilite le partage interdisciplinaire des données et la constitution de biobanques, permettant une détection mécanistique des risques associés aux thérapies ciblant les îlots. Cette approche renforce la fiabilité prédictive des modèles précliniques en fournissant des données quantifiables et spatialement résolues sur la composition des îlots, leur réplication et les infiltrats immunitaires.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à une histopathologie rigoureuse et à l'immunolocalisation des cellules endocrines des îlots.
- Valeur opérationnelle : Contribue à la détection des risques biologiques en caractérisant la morphologie, la taille, la densité et la composition cellulaire endocrine des îlots à l'aide de colorations H&E et IHC.
- Valeur prédictive : Aide au tri du portefeuille en évaluant la réplication des îlots et les cellules apoptotiques à l’aide de Ki67 et d'autres marqueurs de prolifération.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour des flux de travail en aval grâce à un traitement standardisé du pancréas humain en régions définies (tête, corps, queue) et en sections transversales.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité des tests en numérotant et en désignant alphabétiquement les sous-régions selon leur taille, permettant ainsi une analyse complète des sections transversales.
- Valeur de la plateforme : Met en évidence la préparation au criblage et la possibilité de passage à l'échelle grâce à des images numérisées de lames entières organisées dans une base de données de pathologie en ligne, accessible à plus de 200 chercheurs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Analyse la pertinence pathologique en évaluant les îlots pour l'inflammation, la fibrose, l'amyloïde et les infiltrats de lymphocytes T à l'aide de colorations H&E et anti-CD3.
- Valeur opérationnelle : Décrit la continuité allant de la découverte à la validation préclinique en évaluant à la fois les compartiments endocrines et exocrines, y compris la pathologie ductulaire et les néoplasies.
- Progrès ajusté au risque : Se concentre sur la détection prédictive des risques en caractérisant la néoplasie intracanalaire pancréatique et sa relation avec le système ductal.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre à la continuité du processus de découverte, depuis la validation précoce de cibles jusqu'à l'évaluation préclinique, en permettant la sectionnement en série, la coloration standardisée et la biobanque numérique de tissu pancréatique humain.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques par l'histopathologie et l'immunolocalisation des îlots pancréatiques et des cellules endocrines.
- Depistage : Garantit la prêts à l'emploi et la reproductibilité des tests en maintenant l'orientation d'origine des lames lors de la coupe et de la coloration en série.
- Analytique : Met en évidence des mesures quantitatives de la surface des îlots, de leur nombre, de la composition cellulaire endocrine, de la réplication et des infiltrats de lymphocytes T à l'aide de colorations H&E et IHC, permettant ainsi des comparaisons entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Assure un lien avec la continuité préclinique en évaluant l'amyladoïde des îlots, la fibrose et les infiltrats inflammatoires liés à la pathogenèse du diabète de type 1.
- Réutilisation institutionnelle : Présente la méthode comme une capacité réutilisable grâce à une base de données en ligne de pathologie qui permet un partage rapide des données et une sélection de blocs pour des coupes sériées paraffinées ou congelées.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive, validation des cibles, réduction de l'ambiguïté mécanistique concernant la composition endocrine des îlots et les interactions immunitaires.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité du sectionnement en série, de la coloration et de l'archivage numérique des lames.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions d'aller/arrêt, efficacité du capital et réduction des risques biologiques en phase avancée grâce à l'identification précoce des pathologies des îlots et de leur statut de réplication.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et décisions d'avancement ajustées au risque, fondées sur la morphologie, la densité et les phénotypes cellulaires endocrines des îlots, quantifiables.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Expertise scientifique requise en histotechnologie, en immunohistochimie et en flux de travail de pathologie numérique.
- Besoins en instrumentation et en infrastructure analytique, notamment un microtome, un colorateur automatique, un numériseur de lames et un accès à une base de données en ligne de pathologie.
- Exigences de standardisation entre équipes concernant l'étiquetage des lames, la numérotation des coupes et le maintien de l'orientation entre les équipes d'histologie et d'imagerie.
- Considérations d'adaptation selon les systèmes modèles, en particulier pour appliquer un traitement régional standardisé (tête, corps, queue) à des pancréas non humains.
- Les limitations pratiques incluent la variabilité tissulaire provenant des donneurs d'organes et la nécessité d'une validation optimisée des anticorps pour la coloration immunohistochimique multiplexe.
