Name: Préparation des tranches aiguës zone sous-ventriculaire pour limagerie calcique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-19T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Découvrez l'imagerie calcique dans la zone sous-ventriculaire postnatale en utilisant des tranches aiguës de souris. Cette méthode par injection de colorant révèle les dynamiques d'activité cellulaire et les patterns de communication intercellulaire.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (DC007681, AB), CT cellules souches subvention (AB), Pardee fondation (AB), Ruth L. prédoctorale Kirschstein national de recherches des bourses (NRSA) (SZY), et un NSF Graduate Research Fellowship (BL). Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Bordey des commentaires utiles sur le manuscrit. Le matériel actuel est basé sur le travail soutenu en partie par l&#39;État du Connecticut Connecticut sous la tige subventions Cellulaire Programme de recherche. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;État du Connecticut, le ministère de la Santé publique de l&#39;État du Connecticut CT ou des innovations, Incorporated.

1. Préparation des solutions, Dissection, et Vibratome <ol><li> Les solutions doivent être préparées à l&#39;osmolarité et le pH correct (tableau 1). Par rapport au liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF), la solution de dissection est préparé avec de faibles concentrations de sodium et de calcium, et de fortes concentrations de magnésium. Il s&#39;agit de minimiser les effets excitotoxicité pendant le tranchage. </li><li> Les deux solutions de dissection et ACSF doit être saturée avec 95% O 2/5% de CO 2 par barbotage pendant au moins 10 minutes pour atteindre le pH désiré de 7,3. </li><li> Préparer un bain de glace sur un plateau. Placez une plaque de dissection dans le bain de glace et remplir avec une solution de dissection. Bubble la plaque de dissection. </li><li> Préparer le vibratome en créant un bain de glace. Placer le plat de sectionnement dans le bain de glace, remplir la cuve avec une solution de dissection, et la bulle. </li><li> Remplissez la tranche chambre de retenue avec ACSF et la bulle afin d&#39;assurer que la solution soit suffisamment aéré quel que soitoù des tranches sont placées. </li></ol> 2. Élimination des tissus cérébraux Tranches cérébraux aigus ont tendance à être en meilleure santé avec de jeunes souris. L&#39;architecture cellulaire SVZ postnatale à des rongeurs est mature vers le jour postnatal (P) 20 1. Par conséquent, nous essayons de limiter nos expériences à l&#39;âge de la souris P20-P30, mais nous avons réalisé des expériences réussies chez des souris aussi vieux que 3 mois. Tout au long de la manipulation des tissus, il faut se garder de minimiser les mouvements mécaniques et de la pression dans le cerveau, maintenir des conditions de refroidissement, et d&#39;exposer la SVZ à la solution le plus rapidement possible suivant sacrifice. <ol><li> Après l&#39;injection de pentobarbital, la souris est rapidement décapité. La fourrure est enlevée et les incisions sont faites à travers la base du crâne. La tête est ensuite placé dans un bac rempli d&#39;une solution de dissection. </li><li> Alors que la stabilisation de la tête avec une pince, les coupes continues sont faites autour du crâne et parfois jusqu&#39;à la ligne médiane avec Microscissors. Attention pour minimiser le contact avec le tissu. Depuis le bulbe olfactif est la destination finale des nouveaux neurones de la SVZ, il faut tenir compte de la préservation de cette région, en particulier lors de l&#39;enlèvement des os autour de cette zone. Microscissor coupes faites autour du crâne doit être sur la face dorsale, afin de permettre un retrait facile du crâne. </li><li> Suppression du crâne recouvrant le cerveau est maintenant séparé de l&#39;os sous le cerveau. Si des coupes dans l&#39;étape précédente sont faites correctement, cet os sus-jacente peut être enlevé facilement avec des ciseaux ou des pinces. </li><li> Tout en maintenant la tête avec une pince, on peut utiliser une lame chirurgicale pour enlever proprement plusieurs morceaux de tissu cérébral avant le tranchage, telles que les suivantes. Une coupe coronale peuvent être faites au niveau du lambda. Coupes sagittales peuvent être faites sur les deux côtés du cerveau en dehors de la SVZ. Une estimation prudente serait ~ 2,5 mm de la ligne médiane. Si vous le souhaitez, le cerveau peut aussi être hemisected ici. Ces réductions seront tous deux faciliter le montage du tissu et permettre la SVZ être atteint plus rapidement lorsque le cerveau trancher. Il est important de se rappeler d&#39;exercer le minimum de forces mécaniques sur le cerveau (par exemple ne pas pousser ou tirer). </li></ol> 3. Aiguë Préparation de tranches de cerveau <ol><li> Pour préparer les étapes suivantes, s&#39;assurer que la super glue utilisé pour monter le tissu est exempt de sabots et prêts à appliquer à la plaque vibratome. Il est important d&#39;aller aussi vite que possible sans endommager le cerveau. </li><li> Le tissu cérébral peut alors être ramassé par le dessous, qui sépare le tissu de l&#39;os sous-jacent, tout en séparant les nerfs. </li><li> Le tissu est monté et collé sur une plaque et placé sur le vibratome. En raison de l&#39;anatomie rostro-caudale de la SVZ, nous nous sommes concentrés sur les coupes sagittales faire car il préserve la voie migratoire des neuroblastes, la gaine gliale, et la vascularisation qui sont en grande partie alignée dans cette direction. On peut soit moUNT du tissu ou sur la ligne médiane de la surface plane créée par des coupes sagittales latérales de la SVZ. Une étape facultative consiste à placer un bloc de 3% d&#39;agarose derrière le tissu à servir de butée à la lame lorsque les tranches se détacher. Nous utilisés de préférence à base de cyanoacrylate super glue. </li><li> Rincer la lame avec de l&#39;éthanol pour éliminer les huiles et rincer avec de l&#39;eau distillée. Placer la lame sur le porte-lame. Monter le support de lame à la vibratome. </li><li> Réglez les paramètres vibratome pour couper le tissu avec une épaisseur de 250-350 um par tranche. Il est important de couper l&#39;aide de vibrations à haute fréquence et à basse vitesse. </li><li> Section progressivement à travers le tissu. L&#39;apparition du bulbe olfactif est un bon indicateur que l&#39;on est près de la SVZ en coupes sagittales que les tranches les plus latérales contiendront aucune des deux régions. Autres sites à surveiller comprennent le ventricule et l&#39;épaississement du corps calleux, sous laquelle se trouve la SVZ. La SVZ apparaissent en premier dans sagit latérale plustranches mentales. Le RMS apparaîtra dans coupes sagittales médianes. </li><li> Retirer les tranches contenant la SVZ avec une pipette Pasteur en plastique avec la pointe coupée. Transfert vers la chambre de retenue tranche. Nous avons souvent obtenir plus de tranches que nous pouvons utiliser dans une journée de travail. Cependant, tranches varie de la quantité de cellules contenant la SVZ. Il est parfois nécessaire de regarder à travers plusieurs tranches de trouver celui qui vous intéresse pour l&#39;imagerie. </li></ol> 4. Préparation du microscope et colorants Les tranches besoin d&#39;un temps d&#39;incubation d&#39;une heure dans ACSF à se remettre de la dissection et de tranchage. Plusieurs mesures peuvent être effectuées au cours de cette période de récupération tranche. <ol><li> Préparation de pipettes pour la teinture de calcium et / ou demande de drogue <ol class="lalpha"><li> Pipettes en verre doivent avoir un bout de 2-3 um de diamètre et d&#39;une longueur de pointe (~ 2 mm) et angle (~ 16 ° pour le porte-pipette) qui empêche le contact avec la chambre de perfusion et laisse de la place pour le placement del&#39;objectif. </li><li> On peut généralement préparer 6-8 pipettes de pression pour chaque jour d&#39;expériences. </li></ol></li><li> Préparation de colorant Calcium <ol class="lalpha"><li> Lors de la préparation de la solution de travail (4-5 uM de bain, 250 uM par application de pression), il est préférable d&#39;exposer le minimum de DMSO pour les cellules. Ceci peut être réalisé en faisant des stocks hautement concentrées. Par exemple, pour Fluo-4, un tube contenant 50 ug par jour est utilisée. On peut faire un stock de 10 mM de cette aliquote en ajoutant 4,6 pi de solution de Pluronic F-127 à 20% dans le DMSO. </li></ol></li><li> Préparation de l&#39;installation microscope (Figure 2). <ol class="lalpha"><li> Utilisation d&#39;une pompe péristaltique pour écoulement de la solution a permis de réduire la dérive d&#39;image. Faites fonctionner la pompe péristaltique avant de permettre ACSF à courir à travers les lignes de perfusion et de s&#39;assurer qu&#39;il est exempt de bulles. </li><li> Réglez l&#39;entrée du tube de la chambre de perfusion et de s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y ait pas de fuites. </li><li> Positionner la pointe vide pour ensure que la solution est aspirée de la chambre de perfusion. Assurez-vous qu&#39;il est à un niveau suffisant pour que l&#39;objectif est immergé à la bonne distance de travail, mais pas assez élevée pour que la solution peut se répercuter sur la chambre. Un faible niveau de solution permettra également de minimiser les distorsions de flux. Une aspiration constante peut également être vérifié par l&#39;écoute de solidité. </li></ol></li></ol> 5. Colorant de charge Cette méthode a été décrite en détail dans un autre manuscrit 2. S&#39;il vous plaît voir les figures ci. <ol><li> Colorant de chargement Bath <ol class="lalpha"><li> Faire une solution de 1-2 ml de travail de la teinture. Pour Fluo-4 AM, une concentration de 5.4 uM est adéquate pour l&#39;étiquetage neuroblastes SVZ. </li><li> Les tranches sont d&#39;abord transférés à une boîte de culture de 35 mm avec un fond grillagé qui est déjà rempli avec ACSF. Remplacer la solution à l&#39;aide d&#39;une pipette en plastique 3 ml de transfert pour retirer doucement le ACSF, tout en ajoutant simultanément le calcium colorant la solution de travail. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 30-60 min dans un groupe CO 2 5% de gaz commandé par l&#39;environnement. </li><li> Placez la tranche de retour dans la chambre ACSF remplie de tenir à laver colorant qui n&#39;a pas pénétré dans les cellules. Alternativement, on peut le placer directement sur la chambre de perfusion microscope qui exécute ACSF. Cette période de lavage est 30-45 min. </li><li> Transférer la tranche de la chambre de perfusion. </li></ol></li><li> Application d&#39;une pression de colorant <ol class="lalpha"><li> Transférer la tranche à partir de la chambre de retenue à la chambre de perfusion sur la configuration de microscope. </li><li> Remplir une pipette en verre avec une solution de travail qui est de 250 uM et le placer sur le micromanipulateur. </li><li> Abaisser la pipette de la région d&#39;intérêt. La pipette peut être placé de telle sorte que la pointe soit quelques micromètres au-dessus de la surface de tranche enterrée ou plusieurs micromètres en dessous de la surface de la tranche, mais à l&#39;écart de la région enregistrée. L&#39;angle de la pipette n&#39;a pas affect l&#39;efficacité du chargement. Quand l&#39;imagerie en dessous de la surface de la tranche, nous constatons que de placer la pointe de pipette ci-dessous le plan d&#39;imagerie va marquer notre zone d&#39;imagerie souhaité mieux. </li><li> Lorsque le colorant d&#39;application de pression, fixé au Picospritzer de sorte qu&#39;il est &lt;3 psi. Nous n&#39;avons pas estimé le volume de diffusion des colorants, parce que c&#39;est sujettes à la variabilité du diamètre pointe de la pipette, la pression appliquée, et la densité du tissu où le colorant est injecté. Nous appliquons simplement jusqu&#39;à ce que nous atteignons notre charge désirée telle qu&#39;évaluée par l&#39;œil. Minimiser les dommages à la tranche lors de l&#39;application, en particulier lorsque la pointe est placée au-dessous de la surface de la tranche. Appliquer pendant 1-2 min. Parfois, des applications répétées sont nécessaires en fonction de l&#39;étiquetage tel qu&#39;évalué par l&#39;œil. Pendant cette durée de concentration et d&#39;application, nous constatons que l&#39;application de surface de colorant qualifie de préférence neuroblastes en dessous de la surface d&#39;application étiquettes préférentiellement les astrocytes. Cependant, l&#39;application&gt; 3 min à 500 uM également étiqueter les neuroblastesindépendamment du fait que la pointe se trouve au-dessus ou en dessous de la surface de la tranche (JC Platel, observation non publiée). Permettre de lavage et de récupération tranche pendant 30-45 min. </li></ol></li></ol> 6. Imagerie confocale de l&#39;activité de calcium <ol><li> Trouver la première région d&#39;intérêt avec un objectif à faible puissance telles que 4x ou 10x. Placez au centre du champ avant de passer à un objectif de puissance plus élevée. À ce stade, on peut évaluer la santé générale par tranche de noter l&#39;apparition de cellules SVZ en vertu contraste d&#39;interférence différentiel (DIC). Les cellules saines apparaissent rond et dodu. En outre, les cellules saines affiche faible Fluo-4 de chargement censé aucun chargement à fluorescence tout ou lumineux (une cellule de mourir). </li><li> Abaisser l&#39;objectif à immersion dans l&#39;eau sur la région d&#39;intérêt, qui est maintenant chargé de colorant. Soit un objectif 40x ou 60x a été adapté à nos besoins, bien que 40x offre un large champ de vision et permet un accès plus pipette. Quand l&#39;imagerie en dessous de lasurface, nous allons souvent au moins 15 um en dessous de la surface de la tranche où l&#39;architecture 3-dimensionnel et la santé des cellules sont mieux conservées. </li><li> Vérifiez que la perfusion et le vide sont adéquatement. </li><li> Configurez le microscope de manière à ce que la résolution time-lapse et la résolution spatiale sont mis à taux souhaités. Pour la microscopie confocale, ces facteurs doivent être soupesés par une augmentation de la résolution temporelle se traduit généralement par une perte de résolution spatiale en raison de la nature de balayage du système. Pour l&#39;activité calcique, nous avons imagé d&#39;un cadre à peu près chaque seconde avec une résolution de 512x512 pixels. Si plusieurs canaux acquises séparément sont nécessaires, cela va aussi affecter les taux d&#39;acquisition. Régler la durée de film (2-10 min). </li><li> Initier courir. Si la réalisation d&#39;études pharmacologiques, lavis sur des antagonistes ou des agonistes non désensibilisation pendant au moins 5-10 minutes, puis faire un autre film de 5-10 min. Agonistes qui peuvent désensibiliser les récepteurs peuvent être extrêmement appliquée, par exemple en utilisant un prEssure pipette contrôlée par un micromanipulateur. </li></ol> 7. Analyse de calcium Analyse suit les procédures standard que nous avons décrits dans les publications perméables 2-4. F 0 (référence exemple) et F sont les intensités moyennes de fluorescence mesurées dans l&#39;ensemble des régions d&#39;intérêt (ROI) et dans chaque ROI, respectivement. Un changement de la fluorescence a été considérée comme une augmentation de Ca 2 +, si elle était&gt; 15% F / F 0 augmentation. Intracellulaires de Ca + 2 modifications ont été calculés en utilisant Calsignal 5. 8. Les résultats représentatifs Nous avons pu obtenir chargement sélectif de cellules SVZ selon les protocoles de chargement colorant décrites ci-dessus et ailleurs 2-4,6. Chargement baignoire ou application d&#39;une pression sur la surface de la tranche de Fluo-quatre heures (4-5 ou 250 pM, respectivement) pour la plupart des étiquettes neuroblastes. Bien que l&#39;application de pression peut charger neurobdure plus rapidement que le chargement de bain en une seule tranche, le chargement bain permet le chargement simultané de plusieurs tranches. Nous confirmons l&#39;identité des cellules marquées que par les neuroblastes (1) si elles affichent un comportement migratoire 4,7, (2) leur morphologie, (3) coloration négative de sulforhodamine 101, un colorant spécifique des astrocytes-3 ou (4) une coloration positive avec DCX-DsRed expression (JC Platel, observation non publiée). Neuroblastes migrent rapidement (en moyenne 60 um / h) à température physiologique 4,7-9, mais leur mouvement peut être facilement observée même à température ambiante. Le mouvement des neuroblastes ne pose pas un problème en ce qui concerne la mise régions d&#39;intérêt (ROI) pour suivre l&#39;activité de calcium puisque nos films sont généralement de courte durée. Cependant, au cours de longues périodes d&#39;attente, comme lors des échanges de solutions de médicaments, les enquêteurs doivent faire attention à faire correspondre ROI dans le contrôle et périodes de traitement. Il n&#39;est pas rare pour les neuroblastes de migrer dans ou hors de l&#39;i<html> domaine de forgemagie ou plan focal. Application de la pression de Fluo-4 AM (250 uM) de profondeur dans la tranche et pour une durée limitée (&lt;2 min) qualifie préférentiellement les astrocytes SVZ 2. L&#39;étiquetage des astrocytes a été vérifiée par marquage positif avec sulforhodamine 101 et leur morphologie, en particulier par la présence de projections et endfeet sur ​​les vaisseaux sanguins que nous avons récemment décrits 3. En utilisant ces méthodes, nous avons observé une activité spontanée dans les deux neuroblastes SVZ et de la population d&#39;astrocytes (Figure 1). L&#39;activité dans les astrocytes prend souvent la forme d&#39;ondes qui se livrent 3 vaisseaux sanguins. En outre, en utilisant l&#39;imagerie de calcium en tant que test, l&#39;application d&#39;agonistes pharmacologiques ont révélé ou confirmé l&#39;expression des récepteurs GABA A sur les neuroblastes et les astrocytes 6, AMPA et NMDA récepteurs des neuroblastes 4. Chiffres 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Propager l&#39;activité de calcium dans les astrocytes. (A) représentant en moyenne l&#39;image d&#39;un enregistrement time-lapse de l&#39;activité de calcium. Astrocytes dans la SVZ étaient chargés de l&#39;application de la pression Fluo-quatre heures dans la tranche de profondeur. Films ont été acquises à 0,75 s temps-étapes. Régions d&#39;intérêt (ROI) sont placés sur des cellules présentant une activité. (B) Les traces de régions d&#39;intérêt placé au-dessus des cellules du film décrit en (A). Des traces ont été filtrés avec une moyenne mobile et normalisée. L&#39;échelle verticale représente 2 x AF / F 0, où F est l&#39;intensité de signal et F 0 est le signal de référence moyen et AF = 0 FF. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4071/4071fig2.jpg" /> Figure 2. Image du système de perfusion. Une extrémité d&#39;un tube est immergé dans 95% 2 O / 5% de CO 2 gaz-perfused solution. La solution est alors perfusé à travers le tube et dans la chambre de bain par une pompe péristaltique (non représentée). L&#39;autre extrémité est insérée dans l&#39;entrée de la solution de bain de la chambre montée sur une plate-forme. Le bec d&#39;aspiration est alors reliée à la sortie de la solution de la chambre et fixé à un niveau pour déterminer la hauteur solution. À partir de la sortie, le bec d&#39;aspiration est reliée à la canalisation à vide, qui aspire la solution de la chambre dans un récipient à déchets. Le système de perfusion est mis en valeur la platine du microscope pour la clarté visuelle.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Imagerie calcique des cellules SVZ a été utilisé pour étudier les tendances de l&#39;activité spontanée dans les neuroblastes 10, l&#39;expression du récepteur de canal dans les deux neuroblastes et les astrocytes et des vagues de calcium 4,6,8 astrocytaires 3. Comme les cellules de la SVZ sont soit immatures ou ayant des propriétés gliales, ils ne se déclenche pas d&#39;action potentiels 11,12, ce qui signifie que les changements dans milliseconde potentiel de tension indicat...

<table border="1"><tbody><tr><td> Soluté </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Dissection (mM) </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td> Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9888 </td><td> Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td><td> Dissection: 2,5 mM ACSF: 2,5 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 .6 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M9272 </td><td> Dissection: 4,33 mM ACSF: 1 mM </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4. H 2 O </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td> Dissection: 1,25 mM ACSF: 1,25 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td><td> Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6014 </td><td> Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td><td> Dissection: 1,33 mm ACSF: 2 mM </td></tr></tbody></table> Liste des produits chimiques Tableau 1. Recettes de solution dissection et ACSF. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> [En-tête] </td></tr><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT 1000S </td><td></td></tr><tr><td> Super Glue </td><td> Surehold ou 3M </td><td> Surehold 3G Super Glue ou 3M Vet-Bond </td><td></td></tr><tr><td> Outils de dissection </td><td> Roboz ou Ted Pella </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluo-quatre heures sensible au calcium colorant </td><td> Invitrogen </td><td> F14201 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green BAPTA-une heures de calcium colorant sensible </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td></td></tr><tr><td> Solution Pluronic F-127 20% dans du DMSO </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Upright microscope confocal </td><td> Olympe </td><td> FV300 FV1000 ou </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;eau d&#39;immersion objectifs </td><td> Olympe </td><td> LUMPlanFl 40 x L / IR (NA 0,80); LUMPlanFl 60 x W / I (NA 0,90) </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulateurs </td><td> Sutter </td><td> MPC-200/MPC-325/MPC-385 </td><td></td></tr><tr><td> &lt;Régulateur de pression/ Td&gt; <td> Parker Hannifin </td><td> Picospritzer </td><td> &lt;3 psi pendant l&#39;application </td></tr><tr><td> Pipette extracteur </td><td> Sutter ou Narshige </td><td> Sutter P-97 ou Narshige PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettes en verre </td><td> Sutter </td><td> BF150-110-10 </td><td> Identification: 1,10, OD: 1,50 </td></tr><tr><td> Pompe péristaltique </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modèle 720 </td><td> débit: 1 ml / min </td></tr><tr><td> Bain Chambre </td><td> Warner Instruments </td><td> RC-26 BPL </td><td> Profil bas permet un dégagement objectif </td></tr><tr><td> Tubes </td><td> Tygon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Contrôleur de température </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-324B/344B </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 2. Matériaux / liste d&#39;équipement.

préparation des tranches aiguës zone sous-ventriculaire pour l&#39;imagerie calcique

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

La zone sous-ventriculaire (SVZ) est l&#39;une des deux zones neurogènes dans le cerveau postnatal. La SVZ contient des cellules très denses, y compris les cellules progénitrices neurales avec des caractéristiques astrocytaires (appelées astrocytes SVZ), neuroblastes, et les cellules progénitrices intermédiaires. Neuroblastes nés dans la SVZ tangentiellement migrer une grande distance vers le bulbe olfactif, où ils se différencient en interneurones. Signalisation intercellulaires par l&#39;intermédiaire des molécules d&#39;adhésion et de signaux diffusibles jouent un rôle important dans la neurogenèse contrôle. Beaucoup de ces signaux déclencher l&#39;activité de calcium intracellulaire qui transmet l&#39;information à l&#39;intérieur et entre les cellules. L&#39;activité de calcium est donc le reflet de l&#39;activité des signaux extracellulaires et est un meilleur moyen de comprendre fonctionnelle signalisation intercellulaire entre les cellules SVZ. L&#39;activité de calcium a été étudiée dans de nombreuses autres régions et types de cellules, y compris les astrocytes et les neurones matures. Cependant, la méthode traditionnelle de loacellules d avec indicateur de calcium colorant (chargement de bain par exemple) n&#39;était pas efficace pour le chargement de tous les types de cellules SVZ. En effet, la densité cellulaire dans la SVZ empêche la diffusion de colorant dans le tissu. En outre, la préparation de coupes sagittales sera mieux préserver l&#39;agencement tridimensionnel de cellules, en particulier SVZ le flux de migration neuroblaste sur l&#39;axe rostro-caudal. Ici, nous décrivons les méthodes pour préparer des coupes sagittales contenant la SVZ, le chargement des cellules SVZ avec colorant indicateur de calcium, et de l&#39;acquisition de l&#39;activité de calcium avec time-lapse films. Nous avons utilisé Fluo-quatre heures colorant pour le chargement astrocytes SVZ l&#39;aide de l&#39;application de pression à l&#39;intérieur du tissu. L&#39;activité de calcium a été enregistrée à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal à balayage permettant une résolution précise pour distinguer les cellules individuelles. Notre approche est applicable à d&#39;autres zones neurogènes y compris la zone sous-granulaire de l&#39;hippocampe et des adultes embryonnaires zones neurogènes. En outre, d&#39;autres types de colorants peuventêtre appliqué en utilisant le procédé décrit.

Une méthode pour charger des sous-ventriculaire (SVZ zone) des cellules avec des colorants indicateurs de calcium pour l&#39;activité de calcium enregistrement est décrit. Le postnatale SVZ contient des cellules serrées y compris les cellules progénitrices neurales et neuroblastes. Plutôt que d&#39;utiliser le chargement de bain nous avons injecté le colorant par la pression à l&#39;intérieur du tissu permettant une meilleure diffusion du colorant.

Préparation des tranches aiguës zone sous-ventriculaire pour l&#39;imagerie calcique

La zone sous-ventriculaire (SVZ) est l'une des deux zones neurogéniques du cerveau postnatal. La SVZ contient des cellules densément regroupées, notamment des cellules neurales...

L'objectif de cette procédure est d'imaginer l'activité calcique des cellules dans la zone subventriculaire postnatale. Cela est réalisé en prélevant d'abord soigneusement le tissu cérébral d'une souris postnatale. La deuxième étape consiste à préparer des tranches aiguës de cerveau vivantes contenant la zone subventriculaire.Ensuite, les tranches cérébrales sont chargées avec un colorant sensible au calcium. La dernière étape consiste à imager l'activité à l'aide d'un microscope confocal en laps de temps. En définitive, l'imagerie en laps de temps de l'activité calcique dans les cellules de la zone ventriculaire est utilisée pour montrer la dynamique d'activité intercellulaire et révéler les schémas de communication entre différents types cellulaires et le réseau vasculaire.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurogenèse, telles que la manière dont les différents types cellulaires communiquent entre eux, et comment les cellules peuvent influencer le système vasculaire après avoir sacrifié et décapité un souriceau âgé de P 20 à P 30. Conformément aux lignes directrices approuvées par l'institution, placez la tête dans un plateau contenant de la solution de dissection. Stabilisez la tête à l’aide de pinces et utilisez des ciseaux microchirurgicaux pour effectuer des incisions continues tout autour du crâne et de la ligne médiane.Veillez à ce que le bulbe olfactif reste attaché au cerveau et ne soit pas endommagé. Effectuez des incisions sur la face dorsale, puis utilisez une pince pour retirer l'os du crâne recouvrant le cerveau. Ensuite, tout en maintenant la tête avec la pince, utilisez une lame chirurgicale pour réaliser une coupe coronale au niveau du lambda.Utilisez le même rasoir pour effectuer des coupes sagittales des deux côtés du cerveau, à environ deux à trois millimètres latéralement par rapport à la ligne médiane. Ensuite, utilisez la lame pour glisser sous le cerveau et le retirer complètement du crâne. Cette procédure doit être réalisée en moins de trois minutes.Déposez une petite quantité de colle superglue à base de cyanoacrylate sur la plaque du vibram. Ensuite, prenez le tissu cérébral et fixez-le sur l'une des faces planes créées par la coupe sagittale latérale. Le montage d'un bloc d'agarose pour stabiliser le tissu pendant la découpe est facultatif.Rincez la lame Vibram avec de l'éthanol pour éliminer les huiles, puis rincez-la avec de l'eau distillée. Placez la lame dans le porte-lame et fixez le porte-lame sur le vibreur. Réglez le vibreur de manière à couper des tranches de tissu d'une épaisseur de 250 à 350 microns, avec une vibration à haute fréquence et une vitesse lente, afin de sectionner progressivement le tissu.L'apparition du bulbe olfactif est un bon indicateur que les coupes sagittales approchent de la zone sous-ventriculaire. L'apparition des ventricules et l'épaississement du corps calleux sont également de bons indicateurs de la présence ultérieure de la zone sous-ventriculaire. Une fois la zone sous-ventriculaire atteinte, utilisez une pipette en plastique pour pâtes dont l'extrémité a été coupée pour retirer chaque tranche et la transférer dans une chambre de maintien des tranches.Avec du LCS A. Les tranches nécessitent une heure d'incubation dans le LCS A. Pendant ce temps, les pipettes, le colorant et le microscope peuvent être préparés pour les étapes d'imagerie suivantes.Pour préparer les pipettes, tirez six à huit pipettes en verre de manière à ce que chacune ait une longueur de pointe d’environ deux millimètres et un diamètre de deux à trois micromètres. En outre, le porte-pipette est préréglé à un angle d’environ 16 degrés afin que la pipette puisse être montée sans toucher la chambre de perfusion ni gêner le positionnement de l’objectif. Pour préparer le colorant calcique, ajoutez 4,6 microlitres de la solution à 20 % d’onic F1 27 dans le DMSO à un aliquot de 50 microgrammes de flu oh four.Enfin, pour préparer la pompe péristaltique, dont l'utilisation permet de minimiser la dérive d'image, faites circuler un LCR dans les lignes de perfusion et assurez-vous que les lignes sont exemptes de bulles. Placez maintenant la pointe de vide de manière à ce que la solution soit aspirée depuis la chambre de perfusion. Cette image montre l'installation du système de perfusion.La solution doit atteindre un niveau suffisant pour immerger l'objectif à la distance de travail appropriée, sans être trop haute au point que la solution déborde des bords de la chambre. Écoutez attentivement la régularité afin de vérifier une aspiration constante pour appliquer le colorant de charge par la méthode du bain. Préparez d'abord un à deux millilitres de solution de travail de colorant de quatre à cinq micromolaire en diluant la solution mère.Dans un LCR A, transférez les tranches dans une boîte de culture de 35 millimètres avec un fond en treillis rempli de LCR A. Utilisez une pipette plastique de transfert de trois millilitres pour retirer délicatement le LCR A tout en ajoutant simultanément la solution de travail du colorant au calcium. Incubez ensuite à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes dans un environnement contrôlé à 5 % de dioxyde de carbone.Après l'incubation, remettez la tranche dans la chambre de conservation remplie de LCR A afin de laver le colorant qui n'a pas pénétré dans les cellules. Après 30 minutes dans le LCR A, transférez la tranche dans la chambre de perfusion pour l'application sous pression du colorant. Transférez une tranche de la chambre de conservation vers la chambre de perfusion installée sur le microscope.Ensuite, remplissez par le haut la pipette en verre avec une solution-mère de colorant de 250 micromolaire. Veillez à ce que la pointe de la pipette soit exempte de bulles et correctement fixée sur le micromanipulateur. Abaissez maintenant la pipette jusqu’à la région d’intérêt.La pipette peut être positionnée de manière à ce que la pointe se trouve à plusieurs micromètres au-dessus de la surface tranchée, ou enfouie à plusieurs micromètres sous la surface, mais à distance de la région enregistrée. Régler le pico-spritzer pour délivrer moins de trois livres par pouce carré et appliquer le colorant pendant une à deux minutes. Des applications répétées peuvent être nécessaires selon l'étiquetage évalué à l'œil nu.Lorsqu'il est appliqué à la surface de la tranche, ce protocole marque de façon privilégiée les neuroblastes ; lorsqu'il est appliqué sous la surface, cette technique marque de façon privilégiée les astrocytes, mais s'il est appliqué pendant plus de trois minutes à une concentration de 500 micromolaire, les neuroblastes seront marqués. Quel que soit l'emplacement de l'extrémité de la pipette, laissez la tranche se laver et se rétablir dans du liquide céphalorachidien artificiel pendant 30 à 45 minutes. Localisez la région d'intérêt à l'aide d'un objectif de faible grossissement, puis passez à un objectif à immersion dans l'eau de plus fort grossissement et évaluez la santé des cellules dans la région d'intérêt.En contraste interférentiel différentiel, les cellules saines apparaissent rondes et gonflées et présentent un chargement faible en flu oh quatre. Après avoir vérifié que la perfusion et le vide fonctionnent correctement, régler la résolution temporelle et la résolution spatiale aux valeurs souhaitées. Dans ce cas, une image est acquise environ toutes les secondes avec une résolution de cinq cent douze par cinq cent douze pixels.Après avoir réglé la durée sur deux à dix minutes, lancez l'acquisition. Les agents pharmacologiques sont perfusés pendant cinq à dix minutes, puis éliminés par lavage pendant cinq à dix minutes supplémentaires. Cette image moyenne représentative, issue d'un enregistrement en lapse de temps de l'activité calcique, a été obtenue après les astrocytes de la zone subventriculaire.ont été chargés sous pression. Application de fluo 4:00 AM en profondeur dans la coupe. Des vidéos ont été acquises à 0,5.Ensuite, les régions d'intérêt sont placées sur les cellules présentant une activité. Voici les tracés provenant des régions d'intérêt numérotées montrées précédemment. Les tracés ont été filtrés à l'aide d'une moyenne mobile et normalisés.L'échelle verticale représente deux fois delta F sur F zéro, où F est l'intensité du signal et F zéro est le signal moyen de la ligne de base, et delta F est égal à F moins F zéro. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à cinq heures si elle est effectuée correctement.

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L'activité spontanée de développer des réseaux neuronaux peuvent être mesurées en utilisant AM-ester formes de colorants indicateurs sensibles au calcium. Modifications du calcium intracellulaire, indiquant l'activation neuronale, sont détectés comme des changements transitoires de la fluorescence indicateur avec un ou deux photons d'imagerie. Ce protocole peut être adapté pour une gamme de stade de développement qui dépendent des réseaux...

Imagerie fonctionnelle en calcium développement des réseaux corticaux

Dans ce protocole, nous mettons à jour les progrès récents de l'imagerie...

Les réponses de calcium dans les neurones d&#39;imagerie GFP-marqués de hypothalamiques tranches de cerveau de souris

Cette vidéo présente un protocole pour l’enregistrement par patch-clamp de cellules entières et l’imagerie calcique à deux photons dans des coupes d’hippocampe cérébral. Cette méthode permet d’étudier la dynamique des transitoires locaux Ca2+ (CaT) dans les dendrites de différents types neuronaux dans des coupes cérébrales aiguës.

Établissement d’une configuration de cellule entière pour l’imagerie calcique à deux photons de coupes de cerveau

Les procédures sont décrites pour effectuer des enregistrements simultanés du potentiel ou du courant de la membrane et des changements de concentration intracellulaire de calcium. Les neurones du noyau suprachiasmatique sont remplis de l’indicateur de calcium bis-fura-2 à l’aide d’une électrode de patch clamp dans la configuration de patch clamp de cellule entière.

Enregistrement électrophysiologique simultané et imagerie calcique des neurones du noyau suprachiasmatique

L'utilisation de plusieurs angles à couper le cerveau des petits de la souris, nous améliorons sur une tranche de cerveau aiguë décrite précédemment qui capture les liens entre la plupart des grands du mésencéphale et du cerveau antérieur structures auditives.

Modification d&#39;un Colliculo-thalamocortical cerveau de souris Slice, Intégrer l&#39;impression 3-D de la Chambre des composants et multi-échelle imagerie optique

Nous présentons une méthode combinant les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière et deux photons d’imagerie pour enregistrer des transitoires de Ca2 + en dendrites neuronales dans des tranches de cerveau aiguë.

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Nous décrivons ici les étapes essentielles pour des enregistrements de patch-clamp de la cellule entière faites de neurones substantia gelatinosa (SG) dans la tranche de la moelle épinière en vitro . Cette méthode permet les propriétés membranaires intrinsèques, la transmission synaptique et la caractérisation morphologique des neurones de la SG à étudier.

Préparation de tranches médullaires aiguës pour l’enregistrement de Patch-clamp de la cellule entière dans les neurones de Substantia Gelatinosa

Cet article vise à décrire un protocole systématique pour obtenir des tranches horizontales de cerveau hippocampal chez la souris. L’objectif de cette méthodologie est de préserver l’intégrité des voies de fibre hippocampal, telles que le chemin perforant et le tractus de fibre moussée pour évaluer les processus neurologiques liés au gyrus dentate.

Tranches hippocampiques horizontales du cerveau de souris

Nous présentons un protocole pour préparer des tranches aiguës de l’hippocampe dorsale-intermédiaire des souris. Nous comparons cette préparation transversale avec le tranchage coronal en termes de qualité des enregistrements et de préservation des caractéristiques morphologiques des neurones enregistrés.

Préparation de tranches aiguës de l’hippocampe dorsal pour l’enregistrement des cellules entières et la reconstruction neuronale dans le gyrus bosselé de souris adultes

Ce protocole démontre une méthode simple et robuste pour étudier la croissance in situ des axones et la dynamique des cônes de croissance. Il décrit comment préparer ex vivo des tranches de cerveau aiguës physiologiquement pertinentes et fournit un pipeline d’analyse convivial.

In situ Visualisation de la croissance des axones et de la dynamique des cônes de croissance dans des cultures de tranches cérébrales embryonnaires ex vivo aiguës

Découvrez l'imagerie calcique dans la zone sous-ventriculaire postnatale en utilisant des tranches aiguës de souris. Cette méthode par injection de colorant révèle les dynamiques d'activité cellulaire et les patterns de communication intercellulaire.

Préparation des tranches aiguës zone sous-ventriculaire pour l'imagerie calcique

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