Name: Analyse de la transcription génique unique cellule par lARN fluorescent In Situ (FISH) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Apprenez la technique FISH pour analyser l'expression génique dans Plasmodium falciparum. Cette méthode permet de détecter simultanément plusieurs transcrits d'ARNm dans des érythrocytes infectés individuels.

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Les auteurs tiennent à remercier Michael Alifrangis et Ulla Abildtrup pour le génotypage des parasites et Christina Holm pour l&#39;assistance technique excellente. Ce travail a été financé par Howard Hughes Medical Institute (subvention 55.005.511), la Fondation Lundbeck (subvention R9-A840) et par la Fondation Niels Bohr.

1. Génération de fraîchement sélectionnées érythrocytes infectés Pour ce test, les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant des cultures fraîchement sélectionnés pour l&#39;expression en surface de la protéine PfEMP1. Dans cette expérience particulière du P. 3D7 lignée falciparum a été sélectionné en utilisant des anticorps spécifiques, comme décrit précédemment 1. Jour 1 <ol><li> Récolte 200 ul de cellules sanguines emballés à partir d&#39;un P. falciparum culture contenant 2-5% IE tardivement par centrifugation à 800 xg pendant 8 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 2 ml de sang de 37 ° C au chaud solution à 0,75% de gélatine dans un tube de 14 ml stérile et laisser reposer pendant 15-20 min à 37 ° C pour permettre l&#39;IE non infectés et la bague au stade de sédiments. </li><li> Récolter les IE au stade avancé, c&#39;est à dire la phase supérieure, dans un nouveau tube 14 ml et laver deux fois avec 10 ml de 37 ° C chaudes RBC-lavage médias. </li><li> Diluer 50 ul d&#39;anticorps spécifiques anti-PfEMP1 anticorps dans 2 ml de 37 ° C chaudes RBC-lavage médias et filtre stérile. </li><li> Mélanger la chaux stade avancé IE avec l&#39;antisérum dilué stérilisé dans un tube de 14 ml stérile et incuber pendant 30 min à 37 ° C sous agitation douce. </li><li> Centrifuger à 800 xg pendant 8 min à température ambiante, et laver deux fois avec 10 ml de 37 ° C chaudes RBC-lavage médias. </li><li> Lavez 50 pi de la protéine Dynabead Une suspension à deux reprises avec RBC-lavage médias utilisant une DynaMaq-15 aimant. </li><li> Remettre en suspension les Dynabeads dans 300 ul RBC-WASH pour les médias et les ajouter à la chaux stade avancé IE. Incuber pendant 30 min à 37 ° C sous agitation douce. </li><li> Transférer le tube de l&#39;aimant DynaMaq-15. Laissez-le pendant 1-2 min et éliminer tout le liquide. </li><li> Remettre en suspension les Dynabeads dans 4-5 ml de RBC de lavage médias. Transfert à l&#39;arrière du tube sur l&#39;aimant et le laisser pendant 1-2 min avant de retirer tout le liquide. Répéter l&#39;étape de lavage une fois. </li><li> Transférer les billes lavées à un 25 cm 2 f de culture stérilelask contenant 200 ul fraîchement concentré de globules rouges. Ajouter 5-6 ml de Albumax médias dans la culture. Stockez nuit à 5% de CO 2 à 37 ° C. </li></ol> Jour 2 <ol start="12"><li> Supprimer les Dynabeads de la culture lorsque la ré-envahi IE a sélectionné les cellules rouges du sang frais, en transférant toute la culture dans un tube de 14 ml stérile. Placer le tube sur le DynaMaq-15 aimant et laisser reposer pendant 1-2 min. Ensuite, versez tout le retour du liquide dans un flacon de culture. </li><li> La culture pour que les cycles possible jusqu&#39;à une parasitémie de 5-10% et les parasites sont à l&#39;ringstage. </li><li> IE doivent être analysés par FACS pour s&#39;assurer que le phénotype de surface correcte, à savoir l&#39;expression des protéines soit and/orPF11_0008 PFD1235w a été obtenue 1. </li></ol> 2. Préparation des sondes Les sondes antisens d&#39;ARN ont été générés à partir des régions les plus variables du PFD1235w et le var PF11_0008 &lt;/ Em&gt; des gènes de P. l&#39;ADN génomique falciparum 3D7. L&#39;ADN a été amplifié par PCR et cloné dans le vecteur pSPT18 ou 19 pour la transcription, respectivement selon la description du fabricant (Roche). Les sondes (580 paires de bases (pb) et 590 pb de longueur) ont été marqués par la digoxigénine (DIG) ou biotine en utilisant un kit de marquage DIG ARN ou une biotine ARN étiquetage Mix, respectivement. Nous avons confirmé la spécificité des sondes à la fois par des analyses par Northern blot et par une seule partie analyse FISH 1. 3. Frottis mince et fixation des parasites Avant hybridation in situ Jour 1 Toutes les étapes sont réalisées dans un environnement exempt de RNase et tous les réactifs sont sans RNase ou pré-traitées avec diéthyl pyrocarbonate (DEPC) ou RNase Zap (Invitrogen). Les diapositives et les lamelles couvre-objets doivent être nettoyés avec de l&#39;alcool pour enlever la graisse de résidu de fabrication. Il est important d&#39;effectuer le protocole sans aucune pause entre les étapesafin de minimiser le risque de contamination nucléase. <ol><li> Faire un frottis sanguin par la méthode standard propagation 3. Utilisation de la lentille de l&#39;objectif 100x du microscope, compter l&#39;IE et de calculer le pourcentage d&#39;IE dans la culture. Vérifiez que les stades parasitaires sont en synchronie approximative, dans l&#39;anneau et les premiers stades trophozoïtes du cycle de IE. Il s&#39;agit de la pré-réplication, uni-nucléés étapes, exprimant l&#39;ARNm du gène var et adapté à des dosages de cellules simples de transcription POISSONS de ce type. </li><li> Transférer 50 ul de la culture du parasite, à une parasitémie de 5-10%, 1,5 ml d&#39;une RNase-free tube Eppendorf. Centrifuger pendant 1 min à 2.000 tours par minute à température ambiante. </li><li> Retirez le support et ajouter 50 ul de PBS pH 7,2 en eau traitée au DEPC. Agiter doucement le tube. Répétez l&#39;étape sédimentation centrifuge à deux reprises pour laver les cellules libres de médias et les débris cellulaires. </li><li> Faites quatre frottis minces de bonne qualité. Pour chaque frottis, faire un frottis surun 11 mm de diamètre et d&#39;une diapositive 4 Les diapositives de verre soit quatre au total, dans une hotte sans RNase (une étape critique). Vague glisse brièvement en l&#39;air pour sécher. Faire trois lames supplémentaires pour les contrôles négatifs tiroir-une sonde de marquage unique pour tout autre gène pertinent à l&#39;aide d&#39;une sonde spécifique, une autre lame pour le traitement RNase et un troisième chariot contenant IE n&#39;exprimant pas le gène d&#39;intérêt. Laisser les lames sécher sur le banc pendant 10-20 min. </li><li> Fixer les couches minces en ajoutant 60 pl de solution de fixation contenant du paraformaldéhyde à 4% et 5% d&#39;acide acétique glacial dans le puits. Laisser reposer 10 minutes sur le banc à la température ambiante. </li><li> Laver les lames dans un tampon 2x SSPE pendant 5 minutes par agitation douce à température ambiante. Retirez brièvement l&#39;excès de liquide en touchant les puits contenant les cellules délicatement avec un mouchoir en papier. </li><li> Couvrir les lames avec de la pepsine 0,01% à 0,01 M HCl pendant 2 min à 37 ° C (une étape extrêmement critique). Laver les lames en 2x SSPE pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Diluer la solution RNase à une concentration finale de 10 pg / ml. Recouvrir le frottis de contrôle négatif avec 60 ul de la solution de RNase. Incuber pendant 30 min à 37 ° C, puis laver les lames en 2x SSPE pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Procéder immédiatement à l&#39;étape d&#39;hybridation. </li></ol> 4. L&#39;hybridation des sondes d&#39;ARN aux diapositives fixes Jour 1 <ol><li> Préparer la chambre d&#39;hybridation, comme un ThermoStar 100 HC4 ou une boîte vide pipette pointe mis dans un four propre, par pulvérisation avec de la RNase Zap et essuyant le nettoyer avec un mouchoir en papier. Remplir les canaux de la chambre d&#39;hybridation ou le fond de la boîte à eau traitée au DEPC à faire en sorte que les lames ne sèche pas pendant l&#39;hybridation. Fermer la chambre et préchauffer à 48 ° C. </li><li> Diluer les sondes dans la solution d&#39;hybridation à une concentration finale de 12 ng / pl. Dénaturer la solution de sonde à 65 ° C pendant 5 min dans un bloc de chauffage. Immédiatement refroidir sur glace. </li><li> En bref l&#39;air sécher les lames après le lavage 2x SSPE. Retirez délicatement l&#39;excès de liquide dans le puits avec un mouchoir en papier. </li><li> Ouvrez la chambre d&#39;hybridation et placer les lames dans la chambre. Appliquer une ou deux sondes dans un volume total de 60 ul par puits. Couvrez soigneusement la goutte de liquide avec une lamelle RNase-free à l&#39;aide des pinces stériles. </li><li> Fermer la chambre et l&#39;hybridation des lames à 48 ° C pendant au moins 16 heures pendant la nuit. </li></ol> 5. Conjugaison d&#39;anticorps et d&#39;amplification de fluorescence Jour 2 Les étapes suivantes sont basées sur le CST Plus System Palette de fluorescence de Perkin Elmer. Toutes les étapes sont réalisées à température ambiante. <ol><li> Laver les lames 3 fois dans du tampon TNT pendant 5 min sous agitation douce. </li><li> Bloquer le puits dans 150 ul de tampon TNB pendant 30 min. </li><li> Diluer le conjugué HRP-α-DIG anticorps dans un tampon TNB dans un rapport de 1:100 et le conjugué HRP-α-biotine dans du tampon TNB, selon un rapport de 1:500. Retirez tout excès de tampon TNB les lames avec un mouchoir en papier. Lors de la détection deux transcrits simultanément, les deux anticorps peut aller à la fois. Appliquer un montant total de 100 ul de la solution d&#39;anticorps-TNB par puits et soigneusement couvrir avec une lamelle. Incuber les lames pendant 2 h. </li><li> Retirez les lamelles avec précaution. Laver les lames dans du tampon TNT 3 fois pendant 5 min. </li><li> Diluer le FITC-fluorophore dans le réactif d&#39;amplification tyramide à un ratio de 1:500 et appliquer 100 ul de la solution dans chaque puits. Couvrir les puits avec lamelles et laisser incuber pendant 12 min. </li><li> Retirez le couvercle glisse avec précaution et laver les lames 3 fois pendant 5 minutes dans le tampon TNT par agitation douce. </li><li> Diluer le Cyan3-fluorophore dans le réactif d&#39;amplification tyramide à un rapport de 1:500. Ajouter 100 ul paret de cette solution. Couvrir les puits avec lamelles et laisser incuber pendant 12 min. </li><li> Retirez le couvercle glisse soigneusement puis rincez rapidement les diapositives par immersion dans du tampon TNT. </li><li> Laver les lames 3 fois avec du tampon TNT pendant 5 min. </li><li> Immerger les lames rapidement en eau traitée au DEPC. </li><li> Laisser les lames sécher à l&#39;air. Monter les préparations anti-décoloration réactif contenant du DAPI. Sceller les coins des lamelles avec du vernis à ongles. </li><li> Les diapositives sont maintenant prêts pour la microscopie. Gardez les lames recouvertes d&#39;une feuille d&#39;aluminium et conserver à 4 ° C si l&#39;expérience doit être rempli le jour suivant. Une étanchéité complète des faces des lames peut être effectuée 24 heures après l&#39;application du réactif anti-décoloration. Cela permettra aux diapositives à numériser jusqu&#39;à une semaine après le protocole a été complété. </li></ol> 6. Visualisation des sondes hybridées <ol><li> Allumez le microscope. Un microscope standard immunofluorescence est sufficient pour ce genre d&#39;expérience, mais si vous avez accès à un microscope confocal, vous pouvez également l&#39;utiliser pour des images en 3D ou pour obtenir des vidéos de vos cellules colorées. Laissez microscope pour se réchauffer pendant 15-30 min. Allumez l&#39;ordinateur et le logiciel. </li><li> Vérifier la qualité de la coloration au microscope par immunofluorescence. Choisissez un endroit contenant quelques parasites. </li><li> Ajuster le gain de chaque laser manuellement. Ajuster le séjour de pixels à 4-6 m -1 -1 s et les étapes à 512 x 512 pixels. </li><li> Prenez une photo de test en utilisant Cadre Lambda. Réajuster le gain laser. </li><li> Prenez un minimum de 20 bonnes photos de fluorescence des cellules individuelles. Au moins 2-5 photos d&#39;un champ contenant 5-20 parasites sont nécessaires afin d&#39;obtenir une vue d&#39;ensemble juste le pourcentage des parasites positifs. </li></ol>

<ol><li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083(2010).</li>
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<li>Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progression+of+the+intra-erythrocytic+cell+cycle+of+Plasmodium+falciparum+and+the+role+of+the+centriolar+plaques+in+asynchronous+mitotic+division+during+schizogony%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony.</a> Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).</li>
<li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Analyse FISH ARN, contrairement aux méthodes telles que Northern blot et RT-PCR, permet la discrimination des transcrits d&#39;ARNm spécifiques au niveau de la cellule unique. Cela permet de faire la distinction entre les cellules transcriptionnellement actifs et inactifs, dans cet exemple, P. falciparum protozoaires parasites à l&#39;intérieur des globules rouges humains. Ces cellules entières observations sont souvent nécessaires et peuvent percer importantes et nouvelles tendances de la transcription 1....

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Acide acétique </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> 338 826-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Albumax médias: solution de RPMI Glutamine 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml de RPMI 1640 Une solution à 5 ml de glutamine </td></tr><tr><td> Albumax médias: Gentamicine sulfate Albumax solution </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml de gentamycine sulfate 50 ml de solution Albumax </td></tr><tr><td> Albumax solution: Hypoxanthine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9377 </td><td> 0,8 g Hypoxanthine </td></tr><tr><td> Albumax solution: AlbuMAX II </td><td> Jenvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200 g Albumax </td></tr><tr><td> Albumax solution: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4 litres du milieu RPMI 1640 Dissoudre avec aimant au max. 50 ° C. Filtrez stériliser et conserver à -20 ° C en aliquots. </td></tr><tr><td> Amberlite </td><td> Sigma </td><td> A5710-110G </td><td> Résine de deionize formamide. </td></tr><tr><td> Anti-biotine conjugué à la peroxydase de chèvre pAb </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps anti-DIG </td><td> Novus biologiques </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fade réactif avec DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> Les milieux de montage doit durcir pendant 24 heures avant de sceller complètement la diapositive. </td></tr><tr><td> Biotine ARN étiquetage Mix </td><td&gt; Roche </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> Appareil photo numérique </td><td> Numérique Nikon F11 de vue CC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lamelles de </td><td> Menzel-Glaser </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> flacon de culture de 25 cm 2 de surface Nunclon </td><td> Nunc </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 32490-100ml </td><td> 1 ml DEPC dans 1000 ml d&#39;eau deinonized. Ajouter un barreau aimanté et remuer pendant 12 h. Autoclave pendant 30 min. </td></tr><tr><td> Appareil photo numérique </td><td> Numérique Nikon F11 de vue CC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Protéines Dynabeads A </td><td> Invitrogen </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15 Aimant </td><td> Invitrogen </td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td> Formamide bioultra 99% </td><td> Fluka/ Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Formamide désionisée: 5 g de résine échangeuse d&#39;ions par 100 ml de formamide. Mélanger 30 min. Filtrer sur papier Whatman. </td></tr><tr><td> . Gélatine 0 solution à 75%: gélatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2500 </td><td> 3,75 gélatine g dans 500 ml de RPMI 1640. La chaleur à 56 ° C pour dissoudre. Stériliser par filtration alors que 56 ° C. Conserver à -20 ° C en aliquots. </td></tr><tr><td> . Gélatine 0 solution à 75%: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 3,75 gélatine g dans 500 ml de RPMI 1640. La chaleur à 56 ° C pour dissoudre. Stériliser par filtration alors que 56 ° C. Conserver à -20 ° C en aliquots. </td></tr><tr><td> Solution Glutamine: L-glutamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td><td> 14,6 g L-glutamine dans 500 ml de NaCl 0,9%. Dissoudre, filtre sterilize et stocker à -20 ° C en aliquots. </td></tr><tr><td> Solution Glutamine: HCl </td><td> Sigma </td><td> H1758 </td><td> 14,6 g L-glutamine dans 500 ml de NaCl 0,9%. Dissoudre, filtrer stériliser et conserver à -20 ° C en aliquots. </td></tr><tr><td> Solution d&#39;hybridation: formamide Bio ultra 99% SSC 20x </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Total 20 ml, garder congelé à -20 ° C en aliquots 10 ml de formamide désionisée </td></tr><tr><td> Solution d&#39;hybridation: Concentré 50x Denhardt </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td> 5ml 20xSSC </td></tr><tr><td> Solution d&#39;hybridation: Levure tRNARoche blocage réactif </td><td> Sigma </td><td> R-6750 </td><td> 2 ml 50x Denhardt 250 ul de 20 mg par ml de levure ARNt </td></tr><tr><td><td> Fluka / Sigma </td><td> 31149-106GF </td><td> 0.4g Roche réactif de blocage 1 ml de 10 mg par ml d&#39;ADN de sperme de saumon (Critique: saumon dénaturent spermDNA à 96 ° C pendant 5 min avant d&#39;ajouter à la solution d&#39;hybridation) </td></tr><tr><td> Hybridizer ThermoStar 100 HC4 </td><td> Quantifoil Instruments GmbH </td><td> 1004-0011 </td><td> Peut être remplacé par un four d&#39;hybridation et d&#39;hybridation RNase chambres libres rembourrés avec de l&#39;eau DEPC. </td></tr><tr><td> Immersion huile transparente aux UV fluorescence gratuit </td><td> Sigma </td><td> 10976-1EA </td><td></td></tr><tr><td> Microscope confocal immunofluorescence ou </td><td> Nikon D-Eclipse TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vernis à ongles </td><td> Disponible dans n&#39;importe quelle pharmacie </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC désionisée H 2 O </td><td></td><td></td><td> Ajuster le pH à 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde à 4% </td><td> Fluka / Chemika </td><td> 76240 </td><td> 4 g PFA dans 80 ml de PBS / DEPC. La chaleur à 65 ° C jusqu&#39;à ce que le PFA dissout. Ajouter 20 ml de PBS, laisser la solution refroidir. Ajuster le pH à 7,4. Filtrer. Boutique en aliquotes à -20 ° C. </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde à 4% / acide acétique à 5% </td><td></td><td></td><td> 950 paraformaldhyde ul + 50 ul d&#39;acide acétique </td></tr><tr><td> Pepsine </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> Conjugué à la peroxydase anti-biotine </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC-milieu de lavage: solution de RPMI Glutamine 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml de RPMI 1640 une solution à 5 ml de glutamine </td></tr><tr><td> RBC-milieu de lavage: le sulfate de gentamicine </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml de gentamycine sulfate </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma / Aldrich </td><td></td><td> Faire un 10 mg / ml de solution. </td></tr><tr><td> RNase tube de 1,5 ml </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Zap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> Diapositives 11mm 4 puits </td><td> Thermo Scientific </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 3 M de NaCl (175 g / l) 0,3 M citrate de Na 3 x H 2 O (88 g / l) Ajuster à pH 7,0 avec HCl 1M </td></tr><tr><td> SSC 20x: citrate de sodium dihydraté </td><td> Sigma / aldrich </td><td> W302600 </td><td> 3 M de NaCl (175 g / l) 0,3 M citrate de Na 3 x H 2 O (88 g / l) Ajuster à pH 7,0 avec HCl 1M </td></tr><tr><td> PESS 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 175,3 g de NaCl </td></tr><tr><td> PESS 20x: NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S0751 </td><td> 27,6 g de NaH 2 PO 4. </td></tr><tr><td> PESS 20x: 4 EDTA en poudre </td><td></td><td></td><td> 9,4 g d&#39;EDTA en poudre Ajouter de l&#39;eau DEPC, ajuster le pH 7,4. Autofendit pendant 20 min </td></tr><tr><td> TNB mémoire tampon: tampon TNT </td><td></td><td></td><td> 10 ml du tampon TNT </td></tr><tr><td> TNB mémoire tampon: réactif de blocage </td><td></td><td></td><td> 0,05 g de réactif de blocage Pour dissoudre le réactif de blocage, chauffer la solution à 60 ° C pendant une heure sous agitation. Conserver à -20 ° C. (Dérivé de l&#39;Perkin Elmer TSA-protocole). </td></tr><tr><td> TNT mémoire tampon: Tris / HCl </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td> 1M Tris / HCl, pH 8,0 </td></tr><tr><td> TNT mémoire tampon: NaCl </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Tampon TNT: Tween20 </td><td> Sigma </td><td> 93773 </td><td> 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml Ajuster le pH à 7,5 à la température ambiante. (Dérivé de l&#39;Perkin Elmer TSA-protocole). </td></tr><tr><td> TSA, plus Cyanine3 / fluorescéine système </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEL753000IKT </td><td> Lire le protocole de la TSA Plus System Palette de fluorescence avec soin avant de commencer l&#39;expérience. </td></tr><tr><td> Tubes 14 ml stérile </td><td> Almeco - CM Aps LAB </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de la transcription génique unique cellule par l&#39;arn fluorescent<em&gt; in situ</emhybridation&gt; (fish)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

L&#39;adhérence des érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum (IE) à l&#39;homme récepteurs endothéliaux au cours des infections de paludisme est médiée par l&#39;expression de PfEMP1 variantes de protéines codées par les gènes var. Le P. haploïde falciparum génome abrite environ 60 différents gènes var dont une seule a été soupçonnés d&#39;être transcrit par cellule à la fois pendant la phase de l&#39;infection du sang. Comment une telle réglementation mutuellement exclusif de la transcription des gènes var est atteint n&#39;est pas claire, ainsi que l&#39;identification des différents gènes var ou sous-groupes de gènes var associés aux différents récepteurs et les conséquences de la liaison différentielle sur les résultats cliniques de P. infections à P. falciparum. Récemment, le paradigme de la transcription mutuellement exclusive a été mise en doute par des essais de transcription individuelle sur la base de P. identification transcription falciparum chez inf uniqueète cellules érythrocytaires en utilisant l&#39;ARN d&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH) de la transcription des gènes var par le parasite dans différents noyaux de P. falciparum IE 1. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la réalisation de la méthodologie ARN-FISH pour l&#39;analyse de la transcription des gènes var dans un seul noyau de P. falciparum infection des érythrocytes humains. La méthode est basée sur l&#39;utilisation de la digoxigénine marqué à la biotine et des sondes d&#39;ARN antisens en utilisant la TSA plus Fluorescence Palette Système 2 (Perkin Elmer), des analyses microscopiques et fraîchement sélectionné P. falciparum IE. Dans le procédé d&#39;hybridation in situ peut être utilisé pour contrôler la transcription et la régulation d&#39;une variété de gènes exprimés au cours des différentes étapes du P. cycle de vie falciparum et est adaptable à d&#39;autres espèces de parasites du paludisme et d&#39;autres organismes et des types cellulaires.

La figure 1 illustre un organigramme des principales étapes et pendant la durée de la méthodologie FISH ARN. Une série d&#39;images représentatives de bien et mal conservés tachées expériences FISH ARNm en utilisant unique P. falciparum IE sont présentés dans la figure 2. Ce protozoaire intracellulaire a une petite (1-1.5 um de diamètre) dans le noyau qui est coloré en bleu au DAPI. Vingt-quatre heures après l&#39;invasion érythrocytaire de P. f...

Fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; (FISH) pour identifier des transcrits d&#39;ARNm dans des cellules individuelles permet l&#39;analyse de l&#39;activité polygénique tel que la transcription simultanée de plus d&#39;un membre de la<em&gt; Var</emFamille multigénique&gt; dans<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Érythrocytes infectés<sup&gt; 1</sup&gt;. La technique est adaptable et peut être utilisé sur différents types de gènes, des cellules et des organismes.

Analyse de la transcription génique unique cellule par l&#39;ARN fluorescent<em&gt; In Situ</emHybridation&gt; (FISH)

L'adhésion des érythrocytes infectés (EI) par Plasmodium falciparum aux récepteurs endothéliaux humains lors des infections palustres est médiée par l'expression de variants de la protéine PfEMP1 codés par les gènes var. Le génome haploïde de P. falciparum contient environ 60 gènes var différents, dont on a longtemps pensé qu'un seul était transcrit par cellule à la fois pendant le stade sanguin de l'infection. La manière dont cette régulation mutuellement exclusive de la transcription des gènes var est réalisée reste obscure, tout comme l'identification des gènes var individuels ou des sous-groupes de gènes var associés à différents récepteurs, ainsi que la conséquence de la liaison différentielle sur l'issue clinique des infections à P. falciparum. Récemment, le paradigme de la transcription mutuellement exclusive a été remis en question par des essais de transcription basés sur l'identification de transcrits individuels de P. falciparum dans des cellules érythrocytaires infectées uniques, utilisant l'analyse par hybridation in situ en fluorescence (FISH) de l'ARN de la transcription des gènes var par le parasite dans les noyaux individuels des EI de P. falciparum. Nous présentons ici un protocole détaillé pour mettre en œuvre la méthodologie RNA-FISH pour l'analyse de la transcription des gènes var dans les noyaux uniques d'érythrocytes humains infectés par P. falciparum. La méthode repose sur l'utilisation de sondes ARN antisens marquées à la digoxigénine et à la biotine à l'aide du TSA Plus Fluorescence Palette System (Perkin Elmer), d'analyses microscopiques et d'EI de P. falciparum fraîchement sélectionnés. La méthode d'hybridation in situ peut être utilisée pour surveiller la transcription et la régulation d'une variété de gènes exprimés pendant les différentes étapes du cycle de vie de P. falciparum et peut être adaptée à d'autres espèces de parasites du paludisme ainsi qu'à d'autres organismes et types cellulaires.

Je m'appelle Elena Rand et je travaille au Centre de pathologie médicale de l'Université de Copenhague au Danemark. Ici, environ 60 personnes originaires de diverses régions du monde travaillent sur le paludisme. Notre équipe étudie les foyers de plasmodium, des parasites.Ils sont les plus virulents, provoquant la maladie du paludisme chez l'humain en plus du mode. Les foyers expriment des protéines de surface assurant diverses fonctions, telles que l'adhésion aux cellules hôtes. Le groupe le plus important de protéines d'adhésion est constitué des protéines de membrane érythrocytaire des foyers odum, appelées protéine de membrane de *Plasmodium falciparum* un, ou PfMP1.Il existe au moins 60 variants, dont un seul était jusqu'à présent considéré comme transcrit par cellule au cours du stade sanguin de l'infection. Dans notre département, nous pensons qu'plus d'une protéine peut être transcrit au même moment dans les parasites. Une méthode permettant de détecter une telle activité est l'hybridation in situ d'ARNm par fluorescence (FISH).Ici, nous présentons une méthode sur mesure permettant la détection d'ARNm, transcrits de deux gènes différents, dans un seul noyau d'érythrocytes infectés par odum FCI. La méthode nécessite deux jours pour être réalisée. Le premier jour comprend la préparation de sondes d'ARN, leur ajout sur les parasites fixés sur des lames de verre et l'hybridation pendant la nuit.Le deuxième jour comprend la congélation des anticorps, l'amplification du fluorophore et la visualisation des parasites colorés au microscope confocal. Pour donner un aperçu de l'expérience, un organigramme des opérations est présenté ainsi que les réactifs et matériaux critiques utilisés dans l'expérience. Kit de marquage RNAs zap dig biotine, mélange de marquage ARN, paraformaldéhyde, acide acétique glacial, anticorps anti-dig, anticorps anti-biotine, système de palette de fluorescence TSA PL plus, DPI RNAs, microtubes sans enzyme, ETH éthanol, lames de verre essuyées, lamelles stérilisées, matériel stérile tel que ciseaux et pinces, un bocal en verre pour couplage.Les érythrocytes infectés doivent être vérifiés par microscopie pour s'assurer qu'ils se trouvent au stade de développement approprié, c'est-à-dire les stades en anneau avec transcription de VAR, synchronisés et en bon état. Il est essentiel de choisir précisément le stade de développement du cycle biologique auquel a lieu la transcription.Étant donné que chaque espèce d'ARN est exprimée de manière étalée, transcrit spécifiquement et dégradé rapidement, les cellules doivent être lavées délicatement avant de réaliser des frottis sanguins très fins et de haute qualité sur des lames en verre propres ; une monocouche uniforme de globules rouges infectés sur la lame est ensuite fixée dans une solution contenant 4 % de paraformaldéhyde et 5 % d'acide acétique glacial pendant 10 minutes. Ensuite, les lames sont lavées deux fois dans du PBS ; retirez délicatement le liquide des lames à l’aide d’un mouchoir en papier. Puis perméabilisez les cellules à l’aide d’une solution d’acide chlorhydrique préchauffée à 10 millimolaire avant d’ajouter le Pepsi.Incuber ceci à 37 degrés Celsius pendant deux minutes avant l'hybridation. Les sondes sont dénaturées à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes, refroidies rapidement sur de la glace, puis ajoutées aux cellules, qui sont maintenant fixées sur la lame de verre. Placer une lamelle par-dessus les cellules et éliminer toute bulle d'air à l'aide d'une petite pointe de pipette. Humidifier la chambre d'hybridation en ajoutant des gouttes d'eau doublement distillée en périphérie de la chambre afin que les lames restent humides dans la chambre.Pendant la procédure d'hybridation, placez les lames en verre dans la chambre et laissez-les hybridater toute la nuit à 48 degrés Celsius. Après 16 à 17 heures d'hybridation, retirez soigneusement les lames de la chambre d'hybridation. À partir de cette étape, il n'est plus absolument nécessaire de disposer d'un environnement exempt d'ARN.Lavez les lames dans un bocal en verre rempli de tampon TNT, en veillant à ce que les lamelles se détachent de la lame en verre. Répétez la procédure de lavage trois fois, puis bloquez-les dans du tampon TNB pendant une demi-heure. Ajoutez les anticorps conjugués à la peroxydase (HRP) anti-digitoxine ou anti-biotine marqués aux cellules.Les deux types d'anticorps marqués peuvent être ajoutés simultanément. Si l'expérience vise à détecter deux transcrits d'ARNm dans les cellules, les anticorps doivent être pré-dilués. Dans le tampon TNB, incuber pendant une à deux heures, laver trois fois dans le tampon TNT, puis ajouter un fluorochrome aux cellules lavées, un FSE ou un cyan dilué.Trois solutions doivent être préparées fraîchement. À partir de cette étape, il est important de ne pas exposer directement les lames à une lumière intense. Incuber les lames en verre pendant 10 à 15 minutes avec le fluorochrome.Si la détection de deux transcrits d'ARNm est effectuée après la première incubation, éliminer le premier colorant par lavage et ajouter le second. Effectuer un lavage final dans le tampon TNT. Plonger les lames dans de l'eau doublement distillée avant de les faire sécher à l'air. Ajoutez le dappy et placez une lamelle au-dessus de la préparation. Éliminez toutes les bulles d'air et scellez les bords de la lamelle avec un vernis à ongles à séchage rapide. Ici, nous observons un érythrocyte infecté unique contenant un parasite.En bleu, la DPE représente l'ADN du parasite, et le vert représente l'ARNm d'un gène en cours de transcription. Sur l'autre image, la couleur rouge représente l'ARNm d'un autre gène, et sur la troisième image, on peut observer la double coloration des deux transcriptions géniques. Les images révèlent également que les ARNm associés sont superposés à l'ADN nucléaire et ne se trouvent généralement ni au-dessus ni à côté de celui-ci.Dans 99 % des érythrocytes infectés, nous pouvons détecter l'ARNm de deux gènes en cours de transcription. Un aspect important de cette expérience consiste à vérifier que les sondes ne s'hybrident pas à d'autres gènes. Sur cette image, nous avons incubé les érythrocytes infectés avec les deux sondes, mais une seule sonde correspond à un IE en cours de transcription. Les autres gènes ne sont pas transcrits ici.Cette situation est inversée sur ces autres images des érythrocytes infectés visualisés. Les parasites Plasmodium falciparum présentent généralement des membranes bien préservées avec une coloration bien définie de l'ADN et de l'ARN. Si les cellules sont de mauvaise qualité pour une raison quelconque, la coloration deviendra également médiocre.Comme le montre cette image, l'ADN et l'ARN apparaîtront diffus, trouble et relativement mal défini. En conclusion, on peut affirmer que cette méthode peut être facilement appliquée à d'autres parasites transmis par le sang. Nos données de transcription ont également été confirmées par des expériences visant à détecter les protéines traduites à partir des ARNm analysés, en utilisant des anticorps spécifiques ciblant les protéines pf EMP1 exprimées à la surface des cellules infectées.

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