Name: Transformation génomique de la Picoeukaryote Ostreococcus tauri (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Découvrez la transformation génétique par électroporation d'Ostreococcus tauri, une algue marine unicellulaire modèle. Cette méthode permet de générer des lignées transgéniques stables pour étudier les réseaux régulateurs végétaux.

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SynthSys un Centre de biologie intégrative des systèmes financés par le BBSRC et d&#39;attribution EPSRC D019621. EU FP6 réseau d&#39;excellence &quot;Marine Genomics&quot; subvention à FYB a financé le développement de méthodes de transformation génétique.

1. Préparation du matériel d&#39;algues <ol><li> Cellules sont cultivées dans Ostreococcus eau de mer artificielle (ASW). Sels de la Mer (généralement environ 40 grammes par litre) sont dissous dans l&#39;eau déminéralisée à une salinité de 30 ppt, tel que mesuré à l&#39;aide d&#39;un mètre de la salinité. 11,12 milieu d&#39;enrichissement, éléments traces métalliques et des vitamines sont ajoutées, comme décrit dans les tableaux 1-3. Les médias est alors stérilisé par filtration à travers un filtre de 0,22 um. </li><li> Pour l&#39;entretien, les cellules de la souche Ostreococcus OTTH95 sont sous-cultivées aseptiquement à une dilution de 1/100 en eau douce ASW tous les 7 jours et a grandi sous la lumière constante dans la croissance des plantes incubateur muni d&#39;Moonlight filtre bleu. L&#39;intensité lumineuse doit être proche de 20 pmoles m -2 s -1 et de la température est maintenue à 20 ° C. Les cellules n&#39;ont pas besoin d&#39;une agitation constante, mais sont secoués une fois tous les 2 à 3 jours pour empêcher l&#39;agrégation. </li><li> Pour chaque transformation, 50 ml de cellules sont nécessaires à une cellule density de 20-30 x 10 6 ml -1, ce qui devrait être atteint 5-7 jours après le repiquage. La densité cellulaire approximative et axeny peut être déterminée en utilisant la cytométrie de flux ou l&#39;autre ou un hémocytomètre à un minimum de grossissement x40. </li></ol> 2. L&#39;électroporation <ol><li> Préparer l&#39;ADN pour la transformation. Pour chaque transformation, 5 pg de pur, d&#39;ADN plasmidique linéarisé est nécessaire à une concentration de 1 pg / pi dans l&#39;eau dé-ionisée. Pour obtenir cet ADN, les auteurs recommandent d&#39;utiliser un kit Qiagen midi de préparation, même si d&#39;autres méthodes pourraient tout aussi bien fonctionner. Digérer le produit avec une enzyme qui coupe dans le squelette du vecteur utilisé, mais pas dans le transgène ou un gène de sélection. En outre purifier et concentrer l&#39;ADN résultant par précipitation à l&#39;éthanol linéaire, et remettre en suspension le produit dans le volume approprié de haute qualité d&#39;eau dé-ionisée. </li><li> Préparer des microtubes contenant 5 ug d&#39;ADN pour chaque transformation. Une control sans ADN est nécessaire pour chaque lignée cellulaire pour être transformé. Maintenir ces tubes sur de la glace, avec une cuvette d&#39;électroporation 2 mm pour chaque transformation. </li><li> Préparer 2,2 ml de tampon de resuspension par la transformation. Dissoudre sorbitol à une solution 1 M dans le trou DDH 2 O, ajouter 0,1% d&#39;acide pluronique F68 et filtre-stériliser. </li><li> Ajouter de l&#39;acide pluronic F68, à une concentration finale de 0,1% à des cellules, et les granulés pendant 10 minutes à 8000X g à 10 ° C dans un tube de 50 ml à fond conique. Immédiatement remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de resuspension par aspiration et refoulement, et de transférer dans un microtube. Centrifuger pendant 10 minutes à 8000 xg à 10 ° C, et de travailler rapidement, répétez cette étape de lavage une fois de plus. </li><li> Avec une pointe de coupe, remise en suspension chaque culot final dans 40 ul de tampon de resuspension. Ajouter 40 ul des cellules remises en suspension dans chaque tube de l&#39;ADN linéarisé sur la glace, mélanger délicatement et transférer à la cuvette d&#39;électroporation. </li><li> Mettez la cuvette dans le electropMachine oraison. Modifiez les paramètres à 6 kV cm -1, 600 Ω, et 25 uF. Électroporer des cellules. </li><li> Incuber les cellules electoporated dans les cuvettes à température ambiante pendant 10 minutes, et utiliser ce temps pour préparer les flacons de culture tissulaire. Les étiqueter et ajouter 30 ml de frais à chaque ASW. Prélever 1 ml de chaque flacon et doucement l&#39;ajouter à la cuve correspondante. Incuber pendant 2 minutes et retirez délicatement la ASW, qui contient maintenant le globule de cellules et doucement et lentement pipeter directement dans le ASW dans le flacon de culture. </li><li> Les cellules restent généralement dans un globule. Prenez soin de ne pas secouer ou de déranger les cellules agrégées en ce moment. Laisser les cellules de récupérer dans l&#39;incubateur pendant 1-2 heures, puis remise en suspension en agitant les flacons. A cette époque, les cellules doivent remettre en suspension librement et sans grumeaux doit être visible. Laissez les cultures afin de récupérer la nuit dans l&#39;incubateur. </li></ol> 3. L&#39;inclusion de cellules sur des plaques dans milieu semi-solide <ol><li&gt; Le lendemain, à l&#39;autoclave une solution de 2,1% d&#39;agarose à faible point de fusion dans le trou DDH 2 O dans un flacon contenant un barreau d&#39;agitation. Garder fondu à 65-90 ° C dans une plus grande bécher contenant de l&#39;eau sur un agitateur magnétique chauffant. Pour chaque transformation de préparer des boîtes de Pétri (8 55 mm de diamètre) et 8 tubes de 15 ml contenant chacun 9 ml de ASW, plus la sélection requise. Si vous utilisez nourseothricine ou G418, utilisez 2 mg / ml. </li><li> Recueillir les cellules transformées de l&#39;incubateur. Travailler dans un Flowhood stérile, ajouter 1 ml d&#39;eau bouillante agarose LMP à la 9 ml dans l&#39;un des tubes. Fermer le tube, et mélanger en inversant. Ajoutez ensuite 0,5 ml de cellules fraîchement transformées, mélanger rapidement et verser dans la plaque. Répétez cette procédure avec les 7 autres tubes et ensuite dans le ballon de transformation suivante. </li><li> Laisser les plaques d&#39;ouvrir dans la hotte à flux pendant une heure, pour l&#39;agarose à définir. Ensuite, fermez les plaques et les transférer à grands carrés des boîtes de Pétri, qui détiennent 4 plaques chacun. Sceller l&#39;esprit carré plaquesh parafilm. Notez que les plaques ne seront pas entièrement fixé, et, par conséquent, le gel est très fragile. Il faut prendre soin de ne pas briser le gel lors de la manipulation des plaques. Placez tous les assiettes carrées dans l&#39;incubateur. </li></ol> 4. Sélection des colonies transformées <ol><li> Colonies devrait apparaître au bout de 10 à 21 jours sur les plaques de transformation, mais pas sur les plaques des simulacres transformées. Pour prélever des colonies utiliser une pipette 200 pi avec coupure conseils. Il suffit de sélectionner les colonies libres et aspirer la colonie verte. Prenez soin de ne pas inclure toutes les cellules de colonies voisines. </li><li> Transférer les cellules à 2 ml de milieu liquide contenant la sélection, dans une plaque de 24 puits. Lorsque vous utilisez nourseothricine, utilisez 1,75 mg / ml. Mélanger en pipetant. Sélectionnez 24-50 colonies par la transformation. Sceller les plaques avec du parafilm et transfert à l&#39;incubateur. </li><li> Après une semaine, transférer 100 ul de chaque puits à 2 ml frais ASW avec sélection dans une plaque de 24 puits et de grandir pour une additional 7 jours. Lignées de cellules survivantes peuvent être utilisés pour des études ultérieures. Stabilité de l&#39;intégration du génome du nombre et de l&#39;insertion doivent être analysés en utilisant la PCR et Southern Blot. L&#39;ADN génomique peut être obtenu à ces fins en utilisant n&#39;importe quelle méthode bas-échelle standard pour l&#39;extraction d&#39;ADN des plantes. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Fractionner les cellules 1/100 a atteint une densité de 25 millions de cellules par millilitre après avoir progressé pendant 7 jours. Électroporation des cellules avec les paramètres appropriés entraîné dans un entre 10 et 14 millisecondes constante de temps. Lorsque les cellules sont transférées dans un milieu en flacons de culture, un globule de cellules doit se former. Lorsque légèrement secoué après une heure, les cellules devraient facilement remettre en suspension. L&#39;inclusion de 1 ml de cellules transformées en agar LMP 0,2% devrait se traduire d&#39;une manière cohérente, mais seulement un gel semi-solide. Colonies devrait apparaître au bout de 10 à 21 jours. Lors de la transformation 5 ug d&#39;ADN linéarisé en utilisant le protocole ci-dessus, 50-100 colonies par la transformationplaque ont été généralement prévu, contre aucun sur les plaques de contrôle négatif. ~ 80% des colonies ont été cueillies sélectionné de façon positive par la résistance aux antibiotiques en milieu liquide et ont été utilisés dans des études ultérieures. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> La concentration finale </td><td> Solution mère </td><td> Volume pour 1 litre </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td> 8,83 x 10 -4 M </td><td> 75 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> 3,63 x 10 -5 M </td><td> 2,68 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> β-glycérophosphate </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 2,16 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 1,29 mg / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Tris-base forte (pH 7,2) </td><td> 1 x 10 -3 M </td><td> 121,1 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Solution K métaux-traces </td><td></td><td> Tableau 2 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> f / 2 solution de vitamines </td><td></td><td> Tableau 3 </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Constituants du milieu pour la croissance de O. tauri 11, 12. Faire un volume total de 1 litre d&#39;eau de mer artificielle à une salinité de 30 ppt, et ajouter les composants ci-dessus à partir de solutions mères comme indiqué. Filtrez-stériliser le milieu et l&#39;utilisation dans une semaine. Les stocks de tous les composés à l&#39;exception de la solution de vitamine A peut être mis en commun pour ajouter 6 ml de cette solution pour chaque litre de milieu. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> La concentration finale </td><td> Solution mère </td><td> Montant pour 1 litre </td></tr><tr><td> Na 2 </sub&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -4 M </td><td></td><td> 41,6 g </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td></td><td> 3,15 g </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 6,3 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> ZnSO 4 .7 H 2 O • </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 22,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 10,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 180,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 .5 H 2 O • </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 9,8 g / L dH <sub&gt; 2 O </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Tracer une solution métallique 11,12. Maquillage pour un total de 1 litre, en DH 2 O, et chauffer pour dissoudre. Aliquoter la solution et le gel pour le stockage. Les concentrations finales indiquées se rapportent à la moyenne finale, pas la solution des métaux traces. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> La concentration finale </td><td> Solution mère </td><td> Montant pour 1 litre </td></tr><tr><td> La vitamine B 12 </td><td> 1 x 10 -10 M </td><td> 1 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> La biotine </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 0,1 g / L dH 2 O </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Thiamine • HCl </td><td> 1 x 10 -7 M </td><td></td><td> 200 mg </td></tr></tbody></table> Tableau 3. f / 2solution de vitamines 11. Maquillage pour un total de 1 litre en dH 2 O, le filtre-stériliser, aliquoter et congeler. Les concentrations finales indiquées se rapportent à la moyenne finale, pas la solution la vitamine. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> Figure 1. Présentation graphique de la procédure de transformation. Représentation schématique de la procédure à transformer génétiquement Ostreococcus tauri par électroporation. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> Figure 2. La croissance des cellules de la culture. Sont sous-cultivées aseptiquement à une dilution de 1/100 en eau douce ASW tous les 7 jours et a grandi sous la lumière constante dans la croissance des plantes incubateur muni d&#39;Moonlight filtre bleu. L&#39;intensité lumineuse doit être proche de 20 pmoles m -2 s -1 et de la température est maintenue à 20 ° C Cellules ne nécessitent pas une agitation constante, mais ils sont sHaken une fois tous les 2 à 3 jours pour empêcher l&#39;agrégation. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> Figure 3. La formation de colonies sur les 0,2% d&#39;agarose LMP. Transfert 4 plaques à une boîte de Pétri grand carré, et le joint avec du parafilm (en haut à gauche). Lorsque les colonies se sont formées, il suffit de sélectionner libres (idéalement de forme conique) colonies (en haut à droite) et les sucer de la plaque avec une pipette P200. Il devrait y avoir aucune colonie sur le contrôle négatif (en bas à droite).

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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Cellulaire axeny Etat et de la culture est d&#39;une importance cruciale pour la procédure de transformation. Bien que les cellules sont généralement maintenus en cycles de 12 heures de lumière, 12 heures sombres, l&#39;efficacité de transformation dans les cellules cultivées dans ces conditions ont été jugées insuffisantes. Au cours des répétées de granulation / remise en suspension des mesures, les cellules doivent toujours remettre en suspension facilement. Si globale cellules, ou d&#39;une substance comme le mucus est présent, il est préférable de commencer la procédure depuis le début. En règle générale, environ 50 colonies on peut s&#39;attendre sur chaque plaque de transformation, par opposition à aucune sur la plaque de contrôle négatif. En cas de faible efficacité de transformation, des conditions de culture doit être modifiée afin d&#39;assurer cellules sont dans l&#39;état optimal. Les variables qui affectent l&#39;efficacité de transformation comprennent la température ambiante dans le laboratoire (qui devrait être proche de 20 ° C) et la vitesse de traitement (la procédure de centrifugation des cellules [2.3] à la reprise [2,7] devrait prendre environ 1 heure). Il est également important que toutes les solutions d&#39;unre fait frais avant chaque transformation. Pour être inclus dans des plaques, la concentration de agarose LMP est crucial. Cellules Ostreococcus ne poussent pas dans des concentrations élevées d&#39;agarose, et se diffuse dans de faibles concentrations. Trois vecteurs de transformation pour Ostreococcus ont déjà été publiés 6, et plus de vecteurs devraient être générées et publiées sous peu. Le vecteur existant Pot-Luc 6 permet l&#39;utilisation d&#39;un promoteur de choix en combinaison avec une étiquette de luciole luciférase C-terminale permettant la sélection de ligne plus rapide transgénique plus motifs d&#39;expression traitables, que le vecteur porte la Potox 6 inductible fort 13 promoteur de la prise Ostreococcus Haut Phosphate Transporter Affinity (HAPT) gène de la surexpression du gène d&#39;intérêt. Le vecteur Potox-Luc dérive de Potox, portant un marqueur luciférase supplémentaire qui peut être utilisé pour la sélection indirecte de lignes surexpression <sjusqu&#39;à&gt; 14. Marqueurs de sélection retenus sur ces vecteurs sont nourseothricine et G148. Cependant, les cellules Ostreococcus sont très résistantes à de nombreux antibiotiques, et les concentrations de composés nécessaires pour la sélection des cellules transgéniques Ostreococcus est plus élevé que pour les systèmes de modèle classique (2 mg / ml). Bien que le processus semble inefficace, le grand nombre de cellules et l&#39;ADN plasmidique nécessaire pour cette procédure ne pose aucun obstacle significatif. Un plus grand limitation est que chaque ligne générée qui est résistant à l&#39;marqueur sélectionnable doit être analysés individuellement pour vérifier que la construction entière est intégré dans l&#39;ADN. Nous avons observé des exemples dans lesquels l&#39;expression réussie du marqueur de sélection ne correspondent pas à l&#39;insertion du gène d&#39;intérêt réel; intégrations partielles peuvent se produire soit. De toute évidence, l&#39;insertion au hasard dans le génome signifie également qu&#39;il n&#39;y a pas de contrôle du site d&#39;insertion en utilisant cette méthode, et les méthodes de basé sur la recombinaison homologue sont actuellement en cours d&#39;élaboration. Cependant, la méthode décrite ici est, à notre connaissance, actuellement la seule méthode pour générer des cellules caractérisée Ostreococcus génétiquement modifiés. Comme Ostreococcus tauri a récemment été utilisé comme un organisme modèle expérimental, la plupart des méthodes de travail avec ces cellules est susceptible d&#39;évoluer et d&#39;être affiné par la communauté de recherche de plus en plus impliqués. Ce protocole est destiné à aider les gens à entreprendre des travaux avec Ostreococcus, mais ne prétend nullement à décrire tout ce qu&#39;il ya à savoir sur la transformation de la génomique cette microalgue. La confiance auteurs que les lecteurs seront en mesure d&#39;adapter ce protocole à leurs propres besoins que de petites différences dans les incubateurs (niveaux de luminosité ou de qualité) et d&#39;autres paramètres seront présentes et sans doute être optimisé dans tous les laboratoires individu d&#39;obtenir des cultures saines nécessaires à cette protocole. Après avoir maîtrisé les techniques décrites ici,vecteurs peut être construit pour générer luminescente, fluorescente ou d&#39;autres lignes de fusion étiquette sous le contrôle d&#39;une série de promoteurs. Cette plate-forme expérimentale roman passionnant sera utile d&#39;étudier comment les problèmes complexes biochimiques sont résolus dans un eucaryote de réduction de la complexité, dans laquelle les approches pharmacologiques sont hautement facilitées 3.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Constituants du milieu </td></tr><tr><td> Chimique </td><td colspan="2" > Numéro de catalogue </td><td> Fournisseur </td></tr><tr><td> Instantanée Ocean Marine sel </td><td colspan="3"> à partir <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> ou <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Glycérol-2-phosphate hydrate de sel disodique </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td colspan="2"> 84920-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ultra pure tris </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Na 2 EDTA • 2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100G-R </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ZnSO 4 .7 H 2 O • </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203734-5G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CuSO 4 .5 H 2 O • </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> La vitamine B 12 (cyanocobalamine) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> La biotine </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Thiamine • HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ampicilline </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Néomycine </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Kanamycine </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td colspan="4"> Consommables pour la culture </td></tr><tr><td colspan="2"> Point </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Fournisseur </td></tr><tr><td colspan="2"> Culture de tissus cultures Flacon de suspension T25 ventilé avec Verser Manche </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Culture de tissus cultures Flacon de suspension T75 ventilé avec Verser Manche </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Culture de tissus cultures Flacon de suspension T175 ventilé avec Verser Manche </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtres digitaux TPP, 1L, complets </td><td> 99950T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtres bouteilles TPP top, 500ml, </td><td> 99500T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtres digitaux TPP, 250ml, </td><td> 99250T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtres digitaux TPP et 150ml, </td><td> 99150T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> Compteur de salinité pour Marine Aquarium </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > Produits chimiques pour la transformation </td></tr><tr><td> Chimique </td><td> Cataloguenombre </td><td> Fournisseur </td></tr><tr><td> D-Sorbitol </td><td> S6021-1KG </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Pluronic F-68 solution </td><td> P5556-100ML </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td> Werner </td></tr><tr><td> Bas point de fusion d&#39;agarose </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> Consommables pour la transformation </td></tr><tr><td> Point </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Fournisseur </td></tr><tr><td> Culture de tissus cultures Flacon de suspension T25 ventilé avec Verser Manche </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Culture de tissus cultures Flacon de suspension T75 ventilé avec Verser Manche </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Flacon de culture tissulaire T175 Suspension Cultures ventilé avec Verser Manche </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Tubes à centrifuger 50ml Greiner </td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> Gene Pulser / MicroPulser Cuves, 0,2 cm, l&#39;écart de 50 </td><td> 165-2086 </td><td> Bio-Rad </td></tr><tr><td> Petri plat rond PS 3 VENTS H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR International </td></tr><tr><td> Une boîte de Pétri carrée avec quatre évents polystyrène stérile par irradiation 120mm clair </td><td> FB51788 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Moonlight Blue filtre de lumière </td><td> 183 </td><td> Lee éclairage </td></tr></tbody></table>

transformation génomique de la picoeukaryote<em&gt; ostreococcus tauri</em

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Les problèmes courants qui empêchent des progrès rapides en sciences de plantes comprennent les cellules, des tissus et de la complexité organisme entier, et notamment le niveau élevé de redondance génomique touchant la génétique simples chez les plantes supérieures. Le roman organisme modèle Ostreococcus tauri est le plus petit eucaryote libre-vivant connu à ce jour, et possède une taille de génome très réduit et 1,2 complexité cellulaire, qui se manifeste par la présence d&#39;un seul de la plupart des organites (mitochondrie, chloroplaste, pile de Golgi) par cellulaire, et un génome contenant seulement de ~ 8000 gènes. En outre, la combinaison de unicellularity et de la culture facile fournit une plate-forme se prête à des approches de biologie chimique. Récemment, Ostreococcus a été employée avec succès pour étudier les mécanismes sous-jacents de base chronométrage circadien 3-6. Les résultats de cet organisme modèle ont eu un impact non seulement la science des plantes, mais aussi la biologie des mammifères 7. Cet exemple met en évidence comment l&#39;expérimentation rapide dans uneucaryote simple à partir de la lignée verte peut accélérer la recherche dans les organismes plus complexes en générant des hypothèses testables en utilisant des méthodes techniquement réalisables que dans ce contexte de complexité réduite. Connaissance d&#39;un génome et la possibilité de modifier les gènes sont des outils essentiels dans toutes les espèces modèles. Génomique 1, transcriptomique 8, 9 et protéomique des informations de cette espèce est disponible gratuitement, alors que les méthodes précédemment rapportés à 6,10 génétiquement transformer Ostreococcus sont connus pour quelques laboratoires à travers le monde. Dans cet article, les méthodes expérimentales pour transformer génétiquement cet organisme nouveau modèle à une surexpression de construire au moyen de l&#39;électroporation sont décrites en détail, ainsi que la méthode de l&#39;inclusion des cellules transformées en pourcentage d&#39;agarose à bas pour permettre la sélection de lignées transformées provenant d&#39;une seule cellule transformée. Suite à l&#39;application réussie de OstreocoCCU à la recherche du rythme circadien, un intérêt croissant pour Ostreococcus On peut s&#39;attendre à des domaines de recherche différents dans et en dehors des sciences végétales, y compris les zones biotechnologiques. Les chercheurs d&#39;un large éventail de sciences biologiques et médicales qui travaillent sur ​​les voies biochimiques conservés peut considérer la recherche poursuit dans Ostreococcus, exempt de la complexité génomique et organismique d&#39;espèces modèles plus grands.

Cet article décrit la transformation génétique de l&#39;algue marine unicellulaire<em&gt; Ostreococcus tauri</em&gt; Par électroporation. Cet organisme eucaryote est une plate-forme modèle efficace pour les plantes supérieures, possesing considérablement réduit la complexité génomique et cellulaire et à être prête à la culture cellulaire et biologie chimique.

Transformation génomique de la Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Les problèmes courants entravant les progrès rapides en sciences végétales incluent la complexité cellulaire, tissulaire et de l'organisme entier, et notamment le niveau élevé de complexité génomique...

L'objectif général de cette procédure est de générer et de sélectionner des lignées transgéniques stables du nouvel organisme modèle, Austria Occus Tori, une espèce d'algue eucaryote marine picoplanctonique. Cette étape est réalisée en premier lieu en obtenant des pastilles cellulaires à partir de 50 millilitres de culture dense d'ALG par transformation. La deuxième étape consiste à mélanger les cellules avec de l'ADN linéarisé, puis à effectuer l'électroporation.Après avoir dilué les cellules transformées dans un milieu frais et les avoir incubées toute la nuit, ajoutez 0,2 % d'agarose à bas point de fusion et un agent sélectif, puis versez une couche mince du mélange dans de petites boîtes de Pétri. La dernière étape consiste à sélectionner les colonies apparues après une incubation de deux à trois semaines sous lumière bleue constante. Enfin, une sélection en milieu liquide, suivie d'analyses moléculaires telles que la PCR et le Southern blot, permet de confirmer l'intégration réussie du construct dans le génome des lignées transgéniques obtenues.Le principal avantage de l'utilisation de cet organisme par rapport aux organismes modèles existants comme Arabidopsis est de réduire considérablement la complexité génomique, permettant ainsi l'étude des réseaux régulateurs dans un contexte pratiquement dépourvu de redondance génétique. Bien que dans mon laboratoire nous ayons utilisé osteo occus pour étudier l'horloge circadienne des plantes, il peut être utilisé pour étudier de nombreux autres réseaux cellulaires complexes. Les implications de cette technique s'étendent donc bien au-delà du domaine de la biologie végétale.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car, bien que les étapes individuelles semblent assez simples, la manipulation adéquate des cellules et un flux de travail efficace sont essentiels pour obtenir un bon résultat. Certaines parties de ce protocole seront démontrées par Culin Kish, une assistante de recherche d'un laboratoire. Les cellules Austria Occus sont acclimatées dans de l'eau de mer artificielle ou un SW afin de préparer un SW contenant 40 grammes par litre. Sels marins dans de l’eau déionisée jusqu’à une salinité de 30 parties par millier ou PPT, mesurée à l’aide d’un salinomètre. Ajouter un enrichissement, des oligo-éléments métalliques pour milieu de culture et des vitamines, puis filtrer stérilement à travers un filtre de 0,22 micron des cellules grossières de la souche *Austria cocus* O TT H 95 en milieu SW sous lumière constante. Dans un incubateur de croissance végétale équipé d’un filtre bleu type lumière lunaire, l’intensité lumineuse doit être proche de 20 micromoles par mètre carré par seconde, et la température maintenue à 20 degrés Celsius. Les cellules ne nécessitent pas d’agitation constante, mais sont agitées une fois tous les deux à trois jours afin d’éviter l’agrégation.Pour l'entretien, repiquez les cellules de manière aseptique à une dilution d'une à 100 dans un milieu SW frais toutes les sept jours. Chaque transformation nécessite 50 millilitres de cellules à une densité de 20 à 30 fois 10 à la puissance six cellules par millilitre. Cette densité doit être atteinte cinq à sept jours après le repiquage.La densité cellulaire approximative et l'axe peuvent être estimées à l'aide d'un hémocytomètre avec un grossissement minimal de 40 fois. La détermination par cytométrie en flux est préférable. Un exemple de cultures saines par rapport à des cultures non saines est présenté ici.Chaque tracé biométrique représente la diffusion latérale ou SSC sur l’axe des y en fonction de la fluorescence rouge par cellule ou FL3 sur l’axe des x. FL3 correspond à la fluorescence rouge de la chlorophylle, et la SSC indique la taille relative des cellules. Les cellules saines se situent dans la fenêtre Austria Occus, tandis que les cellules mourantes ou les bactéries contaminantes se trouvent en dehors de cette fenêtre.Idéalement, plus de 99 % des cellules devraient se trouver dans la fenêtre Austria Occus. Pour une transformation génétique efficace, chaque transformation nécessite cinq microgrammes de plasmide linéarisé pur, d'ADN à une concentration d'un microgramme par microlitre. Dans de l'eau déionisée stérile, le plasmide a été linéarisé par une enzyme qui coupe dans l'ADN squelette du vecteur utilisé, mais pas dans le transgène ou le gène de sélection.Gardez le tube de microcentrifugeuse contenant l'ADN sur de la glace, accompagné d'une cuvette d'électroporation de deux millimètres pour chaque transformation. Un témoin sans ADN est nécessaire pour chaque lignée cellulaire à transformer. Pour chaque transformation, transférez 50 millilitres de cellules dans un tube à fond conique, ajoutez de l'acide F 68 à 0,1 %, puis centrifugez pendant 10 minutes à 8 000 ×g à 10 degrés Celsius.Pour faire précipiter les cellules, jeter immédiatement le surnageant et ajouter un millilitre de tampon de resuspension Resus aux cellules. Resus suspendre les cellules en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas, les transférer dans un tube microfuge et centrifuger pendant 10 minutes à 8 000 × g à 10 degrés Celsius. Travailler rapidement et laver les cellules une fois de plus après la deuxième centrifugation.Couper la pointe d'une pipette P200 pour resuspendre chaque culot dans 40 microlitres de tampon de resuspension. Ajouter 40 microlitres des cellules resuspendues dans chaque tube contenant de l'ADN linéarisé placé sur de la glace. Mélanger délicatement et transférer dans la cuvette d'électroporation.Placez le vete dans la machine d'électroporation. Réglez les paramètres sur six kilovolts par capteur réciproque, 600 ohms et 25 micro-jours. Électro-activer les cellules après électroporation.Incuber les cellules dans les cuvettes à température ambiante pendant 10 minutes. Pendant ce temps, étiqueter les flacons de culture tissulaire et ajouter 30 millilitres de a SW frais à chaque flacon. Prélever un millilitre de a SW dans chaque flacon et l'ajouter doucement au vete correspondant, puis incuber pendant deux minutes.Ensuite, retirez délicatement un SW contenant l'amas de cellules et versez lentement et doucement directement dans un autre SW. Dans le flacon de culture, les cellules restent généralement regroupées en un gros amas. Veillez à ne pas agiter ni perturber les cellules agrégées à ce stade. Laissez les cellules se rétablir dans l'incubateur pendant une à deux heures.Enfin, resuspendre les cellules en agitant manuellement le flacon. À ce stade, les cellules doivent se resuspendre librement et aucun agrégat ne doit être visible. Laisser les cultures se reconstituer toute la nuit dans l'incubateur le jour suivant l'électroporation ; stériliser à l'autoclave une solution de 2,1 % d'agarose à bas point de fusion dans de l'eau doublement distillée dans un flacon contenant une barrette magnétique.Garder à l'état fondu à 65 à 90 degrés Celsius dans un grand bécher contenant de l'eau sur un agitateur magnétique chauffant. Pour chaque transformation, préparer huit boîtes de Pétri de 50 millimètres et huit tubes de 50 millilitres contenant chacun neuf millilitres de SW plus. La sélection requise.Prélève les cellules transformées depuis l’incubateur. La partie la plus délicate de cette procédure consiste à intégrer les cellules transformées dans des gels d’agarose à faible pourcentage sans compromettre l’intégrité des cellules en les exposant à une chaleur excessive. Il est donc essentiel d’effectuer rapidement et efficacement les prochaines étapes de la procédure dans une hotte à flux stérile.Ajoutez un millilitre d'agarose à bas point de fusion, presque bouillant, aux neuf millilitres d'un SW. Dans l'un des tubes, fermez le tube et retournez-le pour mélanger. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de cellules fraîchement transformées. Fermez rapidement et retournez le tube pour mélanger, puis versez son contenu dans la boîte de Pétri.Répétez ce processus avec les sept autres tubes, puis passez au prochain flacon de transformation. Laissez les boîtes ouvertes dans le flux laminaire pendant une heure afin que le milieu gélifie. Ensuite, refermez les boîtes et transférez-les soigneusement dans des boîtes de Petri carrées de grande taille, chacune pouvant contenir quatre boîtes rondes.Étant donné que les boîtes n'ont pas été complètement solidifiées, le gel est très fragile. Faites attention à ne pas briser le gel lors de la manipulation des boîtes. Scellez les boîtes carrées avec du paraforme et placez-les dans l'incubateur.Une fois les colonies apparues, utilisez une pipette de 200 microlitres avec des embouts coupés. Pour prélever des colonies dans une hotte stérile, sélectionnez simplement des colonies isolées et aspirez une colonie verte. Veillez à ne pas inclure de cellules provenant de colonies voisines.Transférez les cellules dans deux millilitres de milieu liquide contenant le sélectionneur. Dans une plaque de 24 puits, mélangez en pipetant plusieurs fois de haut en bas. Après avoir sélectionné 24 ou 48 colonies par transformation, scellez les plaques avec du film parafilm et transférez-les dans l’incubateur.Après une semaine, transférez 100 microlitres de chaque puits dans deux millilitres de milieu SW frais avec sélection. Dans une plaque de 24 puits, faites croître pendant sept jours supplémentaires. Les lignées cellulaires survivantes peuvent alors être utilisées pour des études ultérieures lors de la transformation par cinq microgrammes d'ADN linéarisé.À l’aide de ce protocole, 20 à 60 colonies par boîte de transformation devraient apparaître après deux à trois semaines. Environ 80 % des colonies prélevées ont été sélectionnées positivement par résistance aux antibiotiques en milieu liquide et ont été utilisées dans les études ultérieures suite à cette procédure.D'autres méthodes, telles que la PCR ou le Southern blot, peuvent ensuite être réalisées afin de vérifier le nombre et l'emplacement de l'insertion du gène tronche après son développement. Cette technique a permis aux chercheurs des domaines de l'horloge circadienne et du cycle cellulaire de comprendre les composants complexes et les comportements de leurs systèmes respectifs dans ce nouvel organisme modèle, Austria Caucus. Tori, après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer des lignées transgéniques d'Austria caucus.

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