Name: En électroporations Ovo dembryons au stade de poulet 10 HH (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:29:01.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Découvrez l'électroporation in ovo chez l'embryon de poulet au stade HH 10 pour la manipulation génétique du tube neural. Cette technique permet d'étudier le développement du système nerveux central.

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La manipulation des œufs <ol><li> Les oeufs peuvent être conservés à 13 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine avant l&#39;incubation sans perte significative de viabilité (un refroidisseur de vin est idéal pour les petits à cet effet). </li><li> Avant l&#39;incubation, les oeufs permettent de se réchauffer à température ambiante, puis placer dans un incubateur humidifié de poulet mis à 37,8 ° C (100 ° F). </li><li> En général, nous électroporation d&#39;embryons d&#39;environ 48 heures après le début de l&#39;incubation, lorsque l&#39;embryon a atteint Hamburger et le stade de Hamilton 10. </li><li> Temps d&#39;incubation peut varier selon Hamburger désiré et le stade de Hamilton. La température est critique et écart par rapport à la température d&#39;incubation optimale va modifier le temps d&#39;incubation et la viabilité des embryons diminuer. </li><li> Durant l&#39;incubation, les œufs doivent être conservés sur leurs côtés pour que l&#39;embryon sera bien positionné pour l&#39;électroporation. L&#39;embryon va flotter au-dessus du jaune et il est utile de marquer le sommet de l&#39;œuf avec un crayon avant de fenêtrage afin que vous sachiez où couper. </li></ol> Préparation <ol><li> Chaud Leibovitz L-15 des médias à 37 ° C. Tirez capillaires en verre en aiguilles. Électrodes de position et micromanipulateur et connecter les électrodes au générateur d&#39;impulsions. </li></ol> Fenêtrage <ol><li> En utilisant une seringue avec une aiguille perce large, percer la coquille à la petite extrémité de l&#39;œuf. </li><li> Soulignant l&#39;aiguille attentivement vers le bas pour empêcher la perturbation du jaune, retirez environ 5ml d&#39;albumine. </li><li> Sceller le trou avec un petit morceau de ruban adhésif. </li><li> Couvrez le dessus de l&#39;œuf avec un autre morceau de ruban adhésif (environ 4x4 cm). </li><li> Avec des ciseaux courbes, et en prenant soin de ne pas perturber l&#39;embryon, découpez un trou juste assez grand pour fournir une fenêtre dans laquelle travailler. </li></ol> Facultatif: Pour visualiser le tube neural, injecter la solution d&#39;encre avec une aiguille de calibre 26 au-dessous de l&#39;embryon (insérer l&#39;aiguille dans l&#39;embryon de l&#39;extérieur de l&#39;anneau de sang). L&#39;encre de Chine doit être dilué 1:5 avec Tom Hanks ou comparables solution tamponnée stérile. Injection et l&#39;électroporation <ol><li> Pause de la pointe capillaire pour un diamètre désiré en utilisant une pince à épiler </li><li> En utilisant la pipette la bouche, charge le capillaire avec le colorant vert plasmidique / Fast. </li><li> Position de l&#39;embryon avec la tête vers vous et insérez l&#39;aiguille dans le tube neural à un angle faible. </li><li> Injecter la solution de plasmide dans le lumen du tube neural jusqu&#39;à ce colorant remplit tout l&#39;espace. </li></ol> Remarque: Soyez prudent de ne pas avoir plus de diamètre, puis la pointe du tube neural. En général, vous serez en mesure de dire si la taille de la pointe optimale a été obtenue par la facilité ou il est difficile de tirer de liquide dans le capillaire. S&#39;il ya une résistance extrême, l&#39;ouverture est probablement trop petit et la pointe doit être rompu à nouveau plus haut. S&#39;il ya peu ou aucune résistance, l&#39;ouverture est trop grande et une nouvelle aiguille doit être utilisé. <ol><li> Placer une ou deux gouttes de solution stérile L-15 médias sur l&#39;embryon. </li><li> Immédiatement placer les électrodes de chaque côté de l&#39;embryon, parallèlement à la fermeture du tube neural, et le pouls 5 fois à 10-24 volts pour 50 mseconds à intervalles de 1 seconde. Vous verrez des bulles à proximité des électrodes si cela a fonctionné correctement. </li><li> Retirez délicatement les électrodes, mettez 5 gouttes de L-15 sur le dessus de l&#39;embryon et le sceau de l&#39;œuf avec du ruban adhésif. Assurez-vous que l&#39;œuf est bien scellée, que le séchage est un contributeur majeur à la perte de l&#39;embryon après l&#39;électroporation. </li><li> Placez les oeufs dans l&#39;incubateur de retour, côté fenêtre vers le haut, et incuber jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent désirée H &amp; H étape. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Shocking%27+developments+in+chick+embryology%3A+electroporation+and+in+ovo+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Ce protocole fournit un guide étape par étape à l&#39;électroporation du tube neural d&#39;embryons de poulet HH10. En plus de montrer la technique, des lignes directrices pour le stockage et la manutention des oeufs est également fourni. Cette technique présente un large éventail d&#39;applications pour l&#39;analyse génétique et le coût aise et peu d&#39;expériences qui les rend possible pour de nombreux laboratoires.

<table><tbody><tr><td>Incubateur pour œufs de poulet</td><td></td><td></td><td>Humidifié, réglé à 37,80&amp;#x00B0;C (100 °F).</td></tr><tr><td>Générateur d'impulsions</td><td>Genetronics</td><td>BTX T820</td><td>Générateur d'ondes carrées ou équivalent</td></tr><tr><td>Électrodes</td><td></td><td></td><td>Nos électrodes étaient fabriquées à partir de fil de platine de 0,25 mm de diamètre, mesuraient 5 mm de long et étaient espacées de 1 mm</td></tr><tr><td>Câbles de connexion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loupe binoculaire</td><td></td><td></td><td>avec grande distance de travail</td></tr><tr><td>Capillaires en verre</td><td></td><td></td><td>et tireur de capillaires ou aiguilles en verre commerciales</td></tr><tr><td>Milieu Leibovitz&amp;rsquo;s L-15</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Œufs de poulet</td><td></td><td></td><td>fécondés</td></tr><tr><td>Ciseaux courbes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 10 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aiguille à large orifice</td><td></td><td></td><td>16-18G</td></tr><tr><td>Pipette buccale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Encre de Chine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue à insuline/seringue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADN plasmidique</td><td></td><td></td><td>&amp;#8805; 1&amp;#x03BC;g/&amp;#x03BC;l dans du tampon TE stérile ou du PBS 1X contenant 0,05 % de colorant Fast Green</td></tr></tbody></table>

en électroporations ovo d&#39;embryons au stade de poulet 10 hh

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Grande taille et du développement externe de l&#39;embryon de poulet ont longtemps fait un outil précieux dans l&#39;étude de la biologie du développement. Avec l&#39;avènement des techniques de biologie moléculaire, le poussin est devenu un système utile pour l&#39;étude de la régulation des gènes et leur fonction. Par électroporation constructions d&#39;ADN ou d&#39;ARN dans l&#39;embryon de poulet en développement, les gènes peuvent être exprimés ou renversé afin d&#39;analyser en fonction des gènes in vivo. De même, constructions rapporteurs peuvent être utilisées pour la cartographie de destin ou d&#39;examiner des éléments de gènes putatifs de régulation. Par rapport à des expériences similaires chez la souris, l&#39;électroporation chiches a l&#39;avantage d&#39;être rapide, facile et peu coûteux. Cette vidéo montre d&#39;abord comment faire une fenêtre dans la coquille de manipuler l&#39;embryon. Ensuite, l&#39;embryon est visualisé avec une solution diluée d&#39;encre de Chine injectée ci-dessous l&#39;embryon. Une aiguille de verre et une pipette sont utilisés pour injecter de l&#39;ADN et Fast colorant vert dans le tube neural de développement, puis des électrodes de platine sont placés parallèlement à l&#39;embryon et de courtes impulsions électriques sont administrés avec un générateur d&#39;impulsions. Enfin, l&#39;œuf est scellé avec du ruban adhésif et replacée dans un incubateur pour le développement ultérieur. En outre, la vidéo montre stockage des œufs et à la manipulation et discute les causes possibles de l&#39;électroporation d&#39;embryons suivantes perte.

Poussin dans l&#39;électroporation in ovo est une technique qui permet la manipulation génétique de l&#39;embryon aviaire. Les applications courantes de cette technique comprennent l&#39;analyse fonctionnelle des gènes et des éléments activateurs putatifs. Cette vidéo montre l&#39;électroporation du tube neural chez les embryons de poussins HH 10. Technique d&#39;injection et la manipulation correcte d&#39;œuf sont discutées.

En électroporations Ovo d&#39;embryons au stade de poulet 10 HH

La taille importante et le développement externe de l'embryon de poulet en ont fait, depuis longtemps, un outil précieux pour l'étude de la biologie du développement. Avec l'avènement de...

Le poussin constitue un bon système modèle car les embryons sont très faciles à manipuler, et leur grande taille les rend également plus faciles à utiliser que d'autres embryons. Les expériences d'électroporation chez le poussin permettent aussi de cribler un grand nombre de gènes en peu de temps. Bonjour, je suis Marissa Blank.Je suis étudiant diplômé dans le laboratoire de Kathy Millon au Département de génétique humaine de l'Université de Chicago. Aujourd'hui, je vais vous parler de la manière d'effectuer une électroporation chez l'embryon de poulet en ovo, et nous allons électroporer des embryons de poulet au stade de Hamburger et Hamilton 10, ce qui correspond à environ deux jours de développement embryonnaire chez le poulet. Cette procédure est réalisée couramment dans notre laboratoire, et généralement, nous étudions l'effet d'une surexpression ou d'une inhibition d'expression de gènes dans la moelle épinière, car nous nous intéressons aux gènes impliqués dans le développement du système nerveux central.Ainsi, la technique que je vais vous présenter aujourd'hui, l'électroporation in ovo, comprend plusieurs étapes. La première étape consistera à ouvrir une fenêtre dans l'œuf.

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Comment les réseaux neuronaux sont établis dans le cerveau embryonnaire est une question fondamentale en neurobiologie développementale. Ici, nous avons combiné une technique d'électroporation avec des outils génétiques nouvelles, comme Cre / Lox-plasmides et le système de transposition ADN PiggyBac médiation dans le cerveau postérieur aviaire à étiqueter interneurones dorsale et suivre leurs projections axonales et des cibles synaptiques à différents stades de développement.

Électroporation de la Rhombencéphale tracer des trajectoires axonales et cibles synaptiques dans l&#39;embryon de poulet

L’organe auditif médie l’audition. Nous présentons ici une méthode modifiée de micro-électroporation in ovo optimisée pour l’étude de la prolifération et de la différenciation des cellules progénitrices auditives dans l’organe auditif du poulet en développement.

Transfert de gènes dans l&#39;organe de poulet Auditory par<em&gt; Dans Ovo</em&gt; Micro-électroporation

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Dans Ovo Electroporation dans le Brainstem

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Préparation des cultures de neurones d&#39;embryons de drosophile Midgastrula scène

Découvrez l'électroporation in ovo chez l'embryon de poulet au stade HH 10 pour la manipulation génétique du tube neural. Cette technique permet d'étudier le développement du système nerveux central.

En électroporations Ovo d'embryons au stade de poulet 10 HH

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