Un protocole pour l'identification des interactions protéine-protéine Basé sur ¹⁵ N marquage métabolique, immunoprécipitation, la spectrométrie de masse quantitative et d'affinité de modulation

L’objectif général de l’expérience suivante est d’identifier des protéines qui interagissent spécifiquement avec une protéine cible donnée dans des extraits cellulaires contenant des protéines solubles et membranaires. Tout d’abord, réaliser un marquage métabolique complet des cellules de chlamydomonas avec de l’azote 14 et de l’azote 15 et générer des lysats cellulaires contenant ou non un TP. Une étape de réticulation facultative aide à stabiliser les interactions protéiques transitoires. Ensuite, séparez les lysats cellulaires en fractions, en protéines insolubles et membranaires enrichies à partir desquelles la protéine cible, ses partenaires d’interaction spécifiques.

Une protéine de contrôle et des protéines contaminantes sont immunoprécipitées et évoquées. Maintenant, mélangez les protéines immunoprécipitées et digérez-les trois fois et analysez-les par LCMS en tandem. Les résultats ont permis de distinguer les vrais et les faux partenaires d’interaction en montrant différents ratios d’azote, 14 d’azote et 15 peptides pour les protéines interagissant spécifiquement avec la protéine cible et un azote égal.

14 rapports azotés 15 peptides pour la protéine cible, la protéine de contrôle et les protéines contaminantes. La méthode de choix pour l’analyse des interactions protéine-protéine consiste à immunoprécipiter la protéine de choix directement avec son interaction. Partenaires d’extraits cellulaires où les deux se produisent à leur confirmation et concentrations natives.

Cependant, ce faisant, les protéines contaminantes sont également précipitées, principalement parce qu’elles interagissent avec les anticorps utilisés car les spectromètres de masse modernes sont extrêmement sensibles. Ils identifieront également sans équivoque les protéines contaminantes et il est donc impossible de distinguer la faute des véritables partenaires d’interaction. Ce problème est surmonté par la technique présentée ici, qui est basée sur le marquage métabolique 15 N, la modulation d’affinité de l’immunoprécipitation, ici médiée par l’état A TP et la spectrométrie de masse quantitative.

La technique sera présentée par Stefan SCH Malinger, qui est doctorant senior dans mon laboratoire. Après avoir marqué les cellules sur 10 générations, transférez deux aliquotes de cellules de chlamydomonas marquées à l’azote 14 et à l’azote 15 dans des tubes 4G SA, récoltez par centrifugation Resus, suspendez les granulés dans deux millilitres de tampon de lyse glacé et transférez les suspensions dans des tubes Falcon de 15 millilitres collectez les cellules restantes avec un millilitre supplémentaire de tampon de lyse chacun pour chaque Eloqua. Ajoutez 50 microlitres de 25 x inhibiteurs de protéase et 12,5 microlitres d’échantillons de chlorure de magnésium sonicate d’une molaire quatre fois 20 secondes sur de la glace pour une cellule complète ISIS avec 22e pauses entre les deux pour le refroidissement.

Préparez quatre coussins de saccharose de six millilitres dans des tubes à paroi mince SW 41 TI. Posez soigneusement tout le volume des lysats cellulaires sur les coussinets de saccharose. Équilibre avec lyse, tampon et centrifugeuse pour séparer les complexes protéiques solubles des membranes.

Transférez les complexes protéiques solubles du haut du gradient dans quatre tubes de faucon de 15 millilitres. Assurez-vous d’éviter de transférer des parties du coussin de saccharose. Ensuite, dans chaque échantillon, ajoutez 10 % Triton X 100 à une concentration finale de 0,5 % Mélangez soigneusement et ajoutez un tampon de lyse à un volume total de sept millilitres.

Pour la page FDS et les analyses immuno-sanguines. Réservez 70 microlitres de chaque extrait cellulaire soluble dans un tube conique frais de 1,5 millilitre et ajoutez 70 microlitres de deux tampons d’échantillon XSDS. Ensuite, jetez les coussinets de saccharose des tubes à paroi mince SW 41 TI et ajoutez trois millilitres de tampon de lyse à chaque pastille.

Ajouter un millilitre de 10 % de tritton X 100 à une concentration finale de 2 %Après avoir dissous chaque pastille par sonication, ajouter un tampon de lyse à un volume total de cinq millilitres et centrifuger. Comme précédemment, récoltez les fractions supérieures des complexes de protéines membranaires dans des tubes de faucon de 15 millilitres. Ajouter un tampon de lyse contenant 2 % de tritton X 100 à un volume final de sept millilitres.

Utilisez 70 microlitres de ces échantillons pour les analyses de la page FDS et immuno-sanguines. Tout d’abord, équilibrez la protéine couplée aux anticorps. Une perle sérique avec deux lavages de quatre millilitres de tampon de lyse diluée à huit millilitres et aliquote.

Un millilitre de suspension à chacun des huit tubes de faucon de 15 millilitres contenant des complexes protéiques solubles ou membranaires d’un TP rempli et d’un TP appauvri en azote 14 et d’un azote 15 marqués à l’azote 15 incubent pendant deux heures à quatre degrés Celsius sur un rouleau tubulaire pour précipiter les complexes protéiques granulés les billes par centrifugation, Jetez les surnageants, en laissant un petit volume de liquide sur les billes pour éviter la contamination par les protéines adhérant aux parois en plastique. Transférez les échantillons dans des tubes coniques frais de 1,5 millilitre pour recueillir toutes les billes restantes dans les tubes de faucon. Ajoutez encore 0,8 millilitre de tampon de lyse contenant 0,1 % de tritton à chaque vortex, centrifugez doucement et transférez le tampon avec les billes résiduelles dans les tubes einor Après plusieurs étapes de lavage, centrifugez les échantillons pendant 15 secondes à 16, 100 fois G et quatre degrés Celsius.

Retirez d’abord les surnageants de l’échantillon à l’aide d’une pipette normale. Ensuite, retirez complètement tout surnageant restant avec la seringue Hamilton de 50 microlitres. À chaque échantillon, ajoutez 100 microlitres de tampon d’élution fraîchement préparé et incubez dans un mélangeur thermique à 800 tr/min centrifuger les échantillons pendant 15 secondes à 16, 100 fois G et 25 degrés Celsius.

Transférez maintenant chaque surnageant dans un tube frais à l’aide d’une seringue Hamilton propre de 50 microlitres. Ajoutez également 50 microlitres de tampon d’élution au processus de perles comme pour les échantillons précédents et regroupez les élastes respectifs. N’oubliez pas de réserver 30 microlitres de tous les échantillons d’IET pour les analyses de FDS et d’immuno-sang.

Combinez maintenant les précipités éludés des protéines solubles et membranaires marquées à l’azote 14 et à l’azote 15 traitées plus et moins A TP. Ensuite, effectuez une alkylation de réduction et une digestion initiale à haute teneur en urée, comme décrit dans le manuscrit ci-joint. Procéder à un triptyque de synthèse sur une roue de rotation pendant au moins 16 heures.

À 37 degrés Celsius. Granulez les billes de tripsin avec une centrifugation de cinq minutes à 16, 100 fois G et quatre degrés Celsius. Transférez les surnageants dans des tubes frais de deux millilitres d’eau.

Lavez les anciens tubes avec 50 microlitres de bicarbonate d’ammonium à 20 millimolaires, d’acide acétique à 0,5 % et faites la piscine avec les premiers surnageants. Afin de préparer des pointes C 18 maison pour le dessalage des échantillons, découpez deux disques dans du matériau emcor C 18 avec une aiguille de seringue et insérez-les dans une pointe de pipette de 200 microlitres. Ensuite, percez des trous dans les couvercles de quatre tubes einor de deux millilitres et insérez les pointes, préconditionnez les pointes de l’étage C 18 avec 50 microlitres de solution B centrifugeuse pendant trois minutes à 800 G et 25 degrés Celsius.

Ensuite, équilibrez les pointes de l’étage C 18 avec 100 microlitres de solution, une centrifugeuse pendant trois minutes à 800 G et 25 degrés Celsius. Répétez cette étape d’équilibrage une fois de plus. Procéder au chargement de 100 microlitres des surnageants d’échantillons issus des digestions triptyques sur la centrifugeuse à pointes de l’étage C 18 pendant trois minutes à 800 G et 25 degrés Celsius.

Répétez le chargement de la colonne pour une application complète des surnageants de l’échantillon. Après avoir lavé les pointes de l’étage C 18, éluez les peptides tryptiques dans un tube einor frais de 1,5 millilitre avec 50 microlitres de solution B centrifugeuse pendant trois minutes à 800 G et 25 degrés Celsius. Répétez l’étape élucienne une fois, puis séchez les peptides jusqu’à ce qu’ils soient terminés dans un VAC reus rapide.

Suspendre les peptides séchés dans 20 microlitres de solution A et incuber pendant au moins une heure sur de la glace, interrompue par deux incubations de 15 minutes dans une centrifugeuse à bain de sonicate pendant 20 minutes à 16, 100 fois G et quatre degrés Celsius et appliquer Senna sur le nano C-M-S-M-S HSP 70. Les protéines de choc thermique ne sont connues pour interagir avec des chaperons et des substrats spécifiques qu’en l’absence d’un TP dans ces extraits cellulaires marqués à l’azote 14 hs P 70 B et CGE un sont presque exclusivement localisés à la fraction soluble indépendante de l’état A TP. En revanche, CF 1 bêta est localisé à la fois dans les fractions solubles et enrichies sur membrane.

Étant donné que la sonication cisaille une partie de CF un bêta de la membrane située A TP Synthes, elle sert de contrôle de charge pour les deux fractions. Des quantités similaires de H HSP 70 B ont été précipitées avec les anticorps anti HSP 70 B provenant d’extraits solubles marqués à l’azote 14 et à l’azote 15 indépendamment de l’état A TP. En revanche, de faibles niveaux de protéine HS P 70 B ont précipité à partir de fractions membranaires, avec des quantités légèrement plus importantes provenant d’une fraction membranaire appauvrie en TP par rapport à des fractions remplies de TP comme affinité attendue de CGE E un pour hs.

P 70 B dépend du contexte. Aucune CGE n’a été précipitée avec HS P 70 B.In une quantité de TP de fractions solubles ou membranaires. Les quantités de protéine CGE one coprécipitées avec HS P 70 B à partir d’une fraction soluble appauvrie en TP et d’une fraction membranaire appauvrie en TP sont corrélées quantitativement avec la quantité de HSP 70 B précipitée.

Dans cette expérience, des précipités ont été préparés pour des mélanges d’azote 14 extraits marqués dépourvus de TP et d’azote, 15 extraits marqués contenant un PT. Alors que les formes marquées lourdes et légères du peptide HS P 70 B ont été détectées à des intensités égales, seule la forme marquée légère du peptide CGE un à partir des extraits appauvris en A TP a été détectée. Les mêmes peptides du précipité anti HS P 70 D DB dérivés de mélanges d’extraits cellulaires solubles mutuellement marqués sont présentés ici. En conséquence, seule la forme marquée lourde du peptide EGC 1 dans un extrait appauvri en TP a été détectée, ainsi que les peptides HSP 70 B marqués légers et lourds.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne impression sur la façon de réaliser une expérience de précipitation de pays avec préparation d’échantillon pour l’analyse par spectrométrie de masse. N’oubliez pas que les contaminations par des protéines humaines, en particulier de la kératine, perturberont vos mesures de prophylaxie dans le spectromètre de masse et que les précautions de sécurité telles que les gants, l’environnement propre et les régions de qualité LCMS sont cruciales lors de l’exécution de cette procédure.