Name: Un protocole pour lidentification des interactions protéine-protéine Basé sur 15 N marquage métabolique, immunoprécipitation, la spectrométrie de masse quantitative et daffinité de modulation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Découvrez une méthode QUICK optimisée pour identifier les interactions protéine-protéine spécifiques en utilisant le marquage métabolique 15N, l'immunoprécipitation et la spectrométrie de masse quantitative sur Chlamydomonas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous tenons à remercier Olivier Vallon pour l&#39;antisérum contre CF1β. Ce travail a été soutenu par la Société Max Planck et des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) et le Bundesministerium für Bildung und Forschung (biologie des systèmes Forsys Initiative, GoFORSYS projet).

<ol><li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+a+macromolecular+complex%3A+the+toolkit+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li>
<li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction%3A+mass+spectrometry-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).</li>
<li>Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitations+revisited%3A+an+update+on+experimental+concepts+and+their+implementation+for+sensitive+interactome+investigations+of+endogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).</li>
<li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+%28QUICK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li>
<li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+recipe+for+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+%28SILAC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).</a> Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).</li>
<li>Heide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+and+cross-linking+to+Chlamydomonas+reveals+the+presence+of+vesicle-inducing+protein+in+plastids+1+in+a+common+complex+with+chloroplast+HSP90C%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C.</a> Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).</li>
<li>Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+roles+of+molecular+chaperones+in+Chlamydomonas+and+Volvox%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox.</a> International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).</li>
<li>Mayer, M. P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones%3A+cellular+functions+and+molecular+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism.</a> Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).</li>
<li>Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chloroplastic+GrpE+homolog+of+Chlamydomonas%3A+two+isoforms+generated+by+differential+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing.</a> The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).</li>
<li>Willmund, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEAT+SHOCK+PROTEIN+90C+is+a+bona+fide+Hsp90+that+interacts+with+plastidic+HSP70B+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).</li>
<li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarris%2C+EH+%22The+Chlamydomonas+Sourcebook%3A+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use%22">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use</a>. , Elsevier, Academic Press. San Diego, CA. (2008).</li>
<li>Mortensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSQuant%2C+an+open+source+platform+for+mass+spectrometry-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics.</a> J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).</li>
<li>M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Shotgun+Proteomics+Using+a+Uniform+15N-Labeled+Standard+to+Monitor+Proteome+Dynamics+in+Time+Course+Experiments+Reveals+New+Insights+into+the+Heat+Stress+Response+of+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Bukau, B., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp70+and+Hsp60+chaperone+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.</a> Cell. 92, 351-366 (1998).</li>
<li>Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp90+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp90 chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons récemment introduit deux améliorations à l&#39;approche RAPIDE: une étape de réticulation pour la capture transitoires interactions protéine-protéine (QUICK-X), et une précipitation de contrôle pour normaliser les efficacités des précipitations inégales 6. Nous présentons ici un protocole contenant deux autres améliorations de QUICK: tout d&#39;abord, nous remplaçons SILAC 5 pour 15 N marquage métabolique. Les avantages sont que 15 N marquage métabolique est beaucoup moins cher que SILAC, si 15 N est fourni sous forme de sel inorganique simple. En outre, avec 15 N métabolique étiquetage RAPIDE peut être appliqué à des organismes prototrophes pour tous les acides aminés, comme la plupart des plantes, les champignons et les bactéries. Et enfin, l&#39;arginine-à-proline interconversion inhérent à 5,6 SILAC ne pose pas de problème pour la quantification de 15 N peptides marqués. Exemples d&#39;outils appropriés pour l&#39;évaluation quantitative de la protéomique N 15 données sont 12 MSQUANT ou jeOMIQS 13. Deuxièmement, on introduit une modulation d&#39;affinité en tant que moyen pour réduire spécifiquement la quantité de protéines qui interagissent avec une protéine cible dans un échantillon donné par rapport à l&#39;autre. Les avantages de cette approche est qu&#39;elle contourne la construction de mutants knock-down, qui, pour certains systèmes modèles sont difficiles à produire ou ne peut pas être généré du tout dans le cas de protéines cibles essentielles. En outre, elle permet d&#39;éviter des interprétations erronées causées par l&#39;expression différentielle des protéines potentiellement se produisant en réponse à la cellule de frappe vers le bas d&#39;une protéine cible: si d&#39;autres protéines sont régulés à la baisse et ainsi une réaction croisée avec l&#39;antisérum utilisé pour l&#39;immunoprécipitation, ils sont interprétés comme de véritables partenaires d&#39;interaction de la protéine cible. Enfin, l&#39;affinité de modulation supprime la nécessité de trouver un bon anticorps-antigène au rapport. Bien que nous appliquons notre protocole de Chlamydomonas reinhardtii comme organisme modèle, Il peut facilement être adapté à tout autre organisme qui peut être cultivée en culture cellulaire et est capable d&#39;utiliser d&#39;ammonium ou de nitrate comme source d&#39;azote. Modulation de l&#39;affinité des complexes protéiques par l&#39;ATP / ADP peut être directement appliquée à d&#39;autres chaperons dont l&#39;interaction avec des substrats et des protéines de cohorte dépend de l&#39;état ATP, comme les GroEL/HSP60/Cpn60 ou HSP90 systèmes chaperon 14,15, ou à tout autre système où affinités de liaison sont modulés par l&#39;ATP. Affinity modulation devrait aussi fonctionner pour les cas où les affinités entre les interactions entre protéines sont altérés par des médicaments spécifiques, comme la geldanamycine radicicol ou dans le cas de systèmes de HSP90 15. Une limitation claire de notre protocole est qu&#39;il nécessite purifié par affinité des anticorps dirigés contre une protéine cible connue pour être sensible à un traitement spécifique / médicament qui module son affinité pour les protéines partenaires. Par conséquent, il n&#39;existe pas de méthode à haut débit.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Proteína Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (diméthyl pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> Stockez desséchée à -20 ° C, se dissolvent directement avant utilisation </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la protéase (complet, sans EDTA) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (adénosine-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> La créatine phosphate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> Créatine phosphokinase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP dithiobis [succinimidyl propionate] </td><td> Sientific Thermo </td><td> 22585 </td><td> Stockez desséchée à 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 Cl </td><td> Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (endoprotéinase Lys-C) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Perles trypsine (trypsine immobilisée Poroszyme) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Mélanger vigoureusement juste avant d&#39;utiliser </td></tr><tr><td> Disque Empore mm 18 C 47 </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

un protocole pour l&#39;identification des interactions protéine-protéine basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; n marquage métabolique, immunoprécipitation, la spectrométrie de masse quantitative et d&#39;affinité de modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Interactions protéine-protéine sont fondamentales pour de nombreux processus biologiques dans la cellule. Par conséquent, leur caractérisation joue un rôle important dans la recherche actuelle et une multitude de méthodes pour leur enquête est disponible 1. Interactions protéine-protéine sont souvent hautement dynamique et peut dépendre de la localisation subcellulaire, modifications post-traductionnelles des protéines et de l&#39;environnement local 2. Par conséquent, ils devraient être étudiés dans leur environnement naturel, pour lesquels les approches de co-immunoprécipitation sont la méthode de choix 3. Partenaires d&#39;interaction co-précipités sont identifiés soit par immunoblot dans une approche ciblée, ou par spectrométrie de masse (LC-MS/MS) d&#39;une manière non ciblée. Cette dernière stratégie est souvent affectée par un grand nombre de fausses découvertes positives, provient principalement de la forte sensibilité des spectromètres de masse modernes confiance détecter des traces de protéines précipitant non spécifique. Un recent approche pour résoudre ce problème est basée sur l&#39;idée que des quantités réduites de partenaires d&#39;interaction spécifiques sera co-précipité avec une protéine cible donnée dont la concentration cellulaire est réduite par l&#39;ARNi, tandis que les quantités de protéines non spécifique de précipitation devraient pas être affectés. Cette approche, appelée RAPIDE pour immunoprécipitation quantitative Combiné avec Knockdown 4, emploie étiquetage des isotopes stables d&#39;acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC) 5 et MS pour quantifier les quantités de protéines immunoprécipitées à partir de souches de type sauvage et knock-down. Protéines présentes dans un rapport de 1:1 peut être considéré comme contaminants, enrichie en ces précipités du type sauvage comme partenaires d&#39;interaction spécifique de la protéine cible. Bien que novateur, QUICK porte certaines limites: d&#39;une part, SILAC est très coûteux et limité pour les organismes qui, idéalement, sont auxotrophes pour l&#39;arginine et / ou la lysine. Des résultats d&#39;interconversion De plus, lorsque l&#39;arginine lourde est alimenté, l&#39;arginine-à-proline dans additional de masse se déplace pour chaque proline dans un peptide et dilue un peu lourd avec de l&#39;arginine lumière, ce qui en fait une quantification plus fastidieux et moins précis 5,6. D&#39;autre part, RAPIDE nécessite que des anticorps sont titrés de manière à ne pas se saturer avec la protéine cible dans des extraits de mutants knock-down. Ici, nous introduisons un protocole modifié QUICK qui surmonte les limitations mentionnées ci-dessus en remplaçant de QUICK SILAC pour l&#39;étiquetage 15 N métabolique et en remplaçant l&#39;ARNi médiée par le knock-down pour la modulation de l&#39;affinité interactions protéine-protéine. Nous démontrons l&#39;applicabilité de ce protocole en utilisant les algue verte unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii comme organisme modèle et le chaperon hsp70B chloroplaste de 7 protéine cible (figure 1). HSP70s sont connus pour interagir avec certains co-chaperons et des substrats que dans l&#39;état ADP 8. Nous exploitons cette propriété comme un moyen de vérifier le spécifiqueinteraction de hsp70B avec son facteur d&#39;échange des nucléotides CGE1 9.

Nous présentons une variante de l&#39;RAPIDE (immunoprécipitation quantitative Combiné avec Knockdown) approche qui a déjà été introduite pour distinguer entre les vraies et les fausses interactions protéine-protéine. Notre approche est basée sur<sup&gt; 15N</sup&gt; Marquage métabolique, la modulation des affinités interactions protéine-protéine par la présence / absence d&#39;ATP, immunoprécipitation et spectrométrie de masse quantitative.

Un protocole pour l&#39;identification des interactions protéine-protéine Basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; N marquage métabolique, immunoprécipitation, la spectrométrie de masse quantitative et d&#39;affinité de modulation

Les interactions protéine-protéine sont fondamentales pour de nombreux processus biologiques au sein de la cellule. Par conséquent, leur caractérisation joue un rôle important dans ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'identifier les protéines interagissant spécifiquement avec une protéine cible donnée dans des extraits cellulaires contenant des protéines solubles et membranaires. Tout d'abord, réalisez un marquage métabolique complet des cellules de chlamydomonas avec de l'azote 14 et de l'azote 15, puis préparez des lysats cellulaires contenant ou ne contenant pas une TP. Une étape facultative de réticulation permet de stabiliser les interactions transitoires entre protéines. Ensuite, séparez les lysats cellulaires en fractions, enrichies en protéines insolubles et membranaires, à partir desquelles la protéine cible et ses partenaires d'interaction spécifiques seront isolées.Une protéine témoin et des protéines contaminantes sont immunoprécipitées et éludées. Mélangez ensuite les protéines immunoprécipitées, digérez-les en triple et analysez-les par LC-MS/MS. Les résultats permettent de distinguer les partenaires d'interaction vrais des faux en montrant des rapports de peptides différents entre l'azote 14 et l'azote 15 pour les protéines interagissant spécifiquement avec la protéine cible, contrairement aux rapports égaux observés pour l'azote.14 rapports azote 15 peptides pour la protéine cible, la protéine contrôle et les protéines contaminantes. La méthode de choix pour analyser les interactions protéine-protéine consiste à immunoprécipiter directement la protéine d'intérêt avec ses partenaires d'interaction à partir d'extraits cellulaires où elles sont toutes deux présentes dans leur conformation et à leurs concentrations natives.Cependant, lorsqu'on procède ainsi, des protéines contaminantes sont également précipitées, principalement parce qu'elles interagissent avec les anticorps, car les spectromètres de masse modernes sont extrêmement sensibles. Ils identifieront sans ambiguïté les protéines contaminantes, rendant ainsi impossible la distinction entre contaminants et véritables partenaires d'interaction. Ce problème est résolu par la technique présentée ici, qui repose sur un marquage métabolique par 15 N, une immunoprécipitation dont l'affinité est modulée ici par l'état A TP, et une spectrométrie de masse quantitative.La technique sera démontrée par Stefan SCH Malinger, doctorant senior dans mon laboratoire. Après avoir marqué les cellules pendant 10 générations, transférez deux aliquotes de cellules de chlamydomonas marquées respectivement à l'azote 14 et à l'azote 15 dans des tubes 4G SA, récoltez-les par centrifugation, resuspendez les culots dans deux millilitres de tampon de lyse glacé, puis transférez les suspensions dans des tubes Falcon de 15 millilitres. Récupérez les cellules restantes avec un millilitre supplémentaire de tampon de lyse chacun, ajouté à chaque échantillon. Ajoutez 50 microlitres d'inhibiteur de protéase 25 x et 12,5 microlitres de chlorure de magnésium un molaire, puis soniquez les échantillons quatre fois pendant 20 secondes sur glace, avec des pauses de 22 secondes entre chaque cycle pour permettre le refroidissement.Préparez quatre coussins de saccharose de six millilitres dans des tubes à paroi mince SW 41 TI. Déposez soigneusement le volume total des lysats cellulaires sur les coussins de saccharose. Équilibrez avec le tampon de lyse et centrifugez pour séparer les complexes protéiques solubles des membranes.Transférez les complexes protéiques solubles situés au sommet du gradient dans quatre tubes Falcon de 15 millilitres, en veillant à ne pas transférer de parties du coussin de saccharose. Ajoutez ensuite du Triton X-100 à 10 % à chaque échantillon pour obtenir une concentration finale de 0,5 %, mélangez soigneusement, puis ajoutez du tampon de lyse jusqu'à un volume total de sept millilitres.Pour les analyses par électrophorèse SDS-PAGE et immunobuvardage. Mettre de côté 70 microlitres de chaque extrait cellulaire soluble dans un nouveau tube conique de 1,5 millilitre et ajouter 70 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS 2X. Ensuite, éliminer les coussins de saccharose des tubes à paroi mince SW 41 TI et ajouter trois millilitres de tampon de lyse à chaque culot.Ajouter un millilitre de Triton X-100 à 10 % pour obtenir une concentration finale de 2 %. Après dissolution de chaque culot par sonication, ajouter le tampon de lyse pour un volume total de cinq millilitres et centrifuger. Comme précédemment, récupérer les fractions supérieures des complexes de protéines membranaires dans des tubes Falcon de 15 millilitres. Ajouter le tampon de lyse contenant 2 % de Triton X-100 pour un volume final de sept millilitres.Utilisez 70 microlitres de ces échantillons pour les analyses par électrophorèse SDS et par immunotransfert. Équilibrez d'abord la protéine couplée à l'anticorps. Ajoutez des billes séro avec deux lavages de quatre millilitres de tampon de lyse, diluez à huit millilitres et aliquotez.Un millilitre de la suspension à chacun des huit tubes Falcon de 15 millilitres contenant des complexes protéiques solubles ou membranaires provenant de cellules marquées à l'azote 14 et à l'azote 15, en présence ou en absence de TP, incuber pendant deux heures à quatre degrés Celsius sur un rouleau à tubes afin de précipiter les complexes protéiques. Récupérer les billes par centrifugation, jeter les surnageants en laissant un petit volume de liquide au-dessus des billes pour éviter la contamination par des protéines adhérant aux parois en plastique. Transférer les échantillons dans de nouveaux tubes coniques de 1,5 millilitre afin de récupérer toutes les billes restantes dans les tubes Falcon. Ajouter 0,8 millilitre supplémentaire de tampon de lyse contenant 0,1 % de Triton à chacun, vortexer doucement, puis centrifuger et transférer le tampon avec les billes résiduelles vers les tubes Eppendorf. Après plusieurs étapes de lavage, centrifuger les échantillons pendant 15 secondes à 16 100 × g et à quatre degrés Celsius.Retirez d'abord les surnageants de l'échantillon à l'aide d'une pipette classique. Ensuite, éliminez complètement tout surnageant résiduel à l’aide d'une seringue Hamilton de 50 microlitres. Ajoutez 100 microlitres de tampon d'élution fraîchement préparé à chaque échantillon et incubez dans un mélangeur thermique à 800 tr/min, puis centrifugez les échantillons pendant 15 secondes à 16 100 ×g et à 25 degrés Celsius.Transférez maintenant chaque surnageant dans un tube neuf à l’aide d’une seringue Hamilton propre de 50 microlitres. Ajoutez également 50 microlitres de tampon d’élution aux billes, en suivant le même protocole que pour les échantillons précédents, puis rassemblez les élutions respectives. N’oubliez pas de conserver 30 microlitres de tous les EIT des échantillons pour les analyses par électrophorèse SDS et par immunoblot.Combinez maintenant les précipités éludés provenant des protéines solubles et membranaires marquées à l'azote 14 et à l'azote 15, traités ou non avec de l'ATP. Ensuite, effectuez la réduction, l'alkylation et la digestion initiale en milieu d'urée concentrée comme décrit dans le manuscrit accompagnant. Puis, procédez à une digestion en trois étapes sur roue rotative pendant au moins 16 heures.À 37 degrés Celsius. Faire tomber en pellet les billes de tripsine par une centrifugation de cinq minutes à 16 100 ×g et à 4 degrés Celsius. Transférer les surnageants dans des tubes Eppendorf neufs de deux millilitres.Lavez les anciens tubes avec 50 microlitres de bicarbonate d'ammonium 20 millimolaire, 0,5 % d'acide acétique, puis rassemblez-les avec les premiers surnageants. Afin de préparer des embouts C18 maison pour le désalinage des échantillons, découpez deux disques dans un matériau C18 emcor à l’aide d’une aiguille de seringue et insérez-les dans un embout de pipette de 200 microlitres. Percez ensuite des trous dans les couvercles de quatre tubes einor de deux millilitres et insérez-y les embouts. Préconditionnez les embouts C18 avec 50 microlitres de solution B, centrifugez pendant trois minutes à 800 ×g et à 25 degrés Celsius.Ensuite, équilibrer les embouts de type C 18 avec 100 microlitres de solution, par une centrifugation de trois minutes à 800 G et à 25 degrés Celsius. Répéter cette étape d'équilibration une fois supplémentaire. Puis charger 100 microlitres des surnageants d'échantillons provenant des digestions triptyques sur les embouts de type C 18, et centrifuger pendant trois minutes à 800 G et à 25 degrés Celsius.Répétez le chargement sur la colonne pour une application complète des surnageants d'échantillon. Après lavage des embouts de phase C18, éluez les peptides tryptiques dans un nouveau tube Eppendorf de 1,5 millilitre avec 50 microlitres de solution B, puis centrifugez pendant trois minutes à 800 ×g et 25 °C. Répétez l'étape d'élution une fois, puis séchez complètement les peptides dans un évaporateur SpeedVac.Suspendez les peptides séchés dans 20 microlitres de solution A et incubez pendant au moins une heure sur de la glace, en interrompant par deux incubations de 15 minutes dans un bain sonique, puis centrifugez pendant 20 minutes à 16 100 ×g et à 4 degrés Celsius, et appliquez Senna à nano C-M-S-M-S HSP 70. On sait que les protéines de choc thermique interagissent avec des co-chaperonnes spécifiques et des substrats uniquement en l'absence d'ATP ; dans ces extraits cellulaires marqués à l'azote 14, hs P 70 B et CGE un sont presque exclusivement localisés dans la fraction soluble, indépendamment de l'état de l'ATP. En revanche, CF un bêta est localisé dans les fractions soluble et enrichie en membrane.Étant donné que la sonication cisaille une partie de CF une bêta de la membrane située sur l'ATP synthétase, elle sert de témoin de chargement pour les deux fractions. Des quantités similaires de HSP 70 B ont été précipitées à l’aide d’anticorps anti-HSP 70 B à partir d’extraits solubles marqués à l’azote 14 et à l’azote 15, indépendamment de l’état en ATP. En revanche, de faibles niveaux de protéine HSP 70 B ont été précipités à partir des fractions membranaires, avec des quantités légèrement plus élevées provenant des fractions membranaires appauvries en ATP par rapport aux fractions membranaires riches en ATP, comme prévu par l’affinité de CGE E une pour hs.P 70 B dépend du contexte. Aucune CGE n'a été co-précipitée avec HS P 70 B dans des fractions solubles ou membranaires riches en TP. Les quantités de protéine CGE co-précipitées avec HS P 70 B à partir de fractions solubles et membranaires appauvries en TP corrélaient quantitativement avec la quantité de HSP 70 B précipitée. L'interaction de CGE avec HS P 70 B uniquement à l'état A DP est également observée lors de l'analyse par spectrométrie de masse.Dans cette expérience, des précipités ont été préparés à partir de mélanges d'extraits marqués à l'azote 14 ne contenant pas de TP et d'extraits marqués à l'azote 15 contenant un TP. Alors que les formes marquées lourde et légère du peptide HSP70B ont été détectées à des intensités égales, seule la forme marquée légère du peptide CGE1 provenant des extraits appauvris en TP a été détectée. Les mêmes peptides issus du précipité anti-HSP70DDB, obtenu à partir de mélanges d'extraits cellulaires solubles marqués de façon réciproque, sont montrés ici. En conséquence, seule la forme marquée lourde du peptide CGE1 dans des extraits appauvris en TP a été détectée, ainsi que les peptides HSP70B marqués à la fois en forme légère et lourde.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon réaliser une expérience de co-immunoprécipitation avec la préparation d'échantillons pour une analyse par spectrométrie de masse. N'oubliez pas que les contaminations par des protéines humaines, en particulier la kératine, perturberont vos mesures de spectrométrie de masse, et que des précautions de sécurité telles que le port de gants, un environnement propre et l'utilisation de zones de qualité LCMS sont donc essentielles lors de la réalisation de cette procédure.

a-protocol-for-identification-protein-protein-interactions-based-on

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Expériences d'immunoprécipitation SILAC représentent un puissant moyen de découvrir de nouvelles interactions protéine: protéine. En permettant la quantification relative exacte de l'abondance de la protéine à la fois le contrôle et les échantillons de test, les interactions véritables peut être facilement distinguée de contaminants expérimentales, et les interactions de faible affinité préservée grâce à l'utilisation de conditions de tampon moins rigoureuses.

Identification des protéines d&#39;interaction partenaires dans les cellules de mammifères à l&#39;aide SILAC-immunoprécipitation quantitatives en protéomique

Nous décrivons ici les protocoles pour perturber les cellules de mammifères par fraisage à l'état solide à une température cryogénique, produire un extrait de cellule à partir de la poudre cellulaire résultante, et isoler des complexes de protéines d'intérêt par capture par affinité sur anticorps couplé micrométriques billes paramagnétiques.

Protein Complex Affinity Capture à partir de cellules de mammifères Cryomilled

Nous avons établi un procédé pour la purification des protéines d'interaction co-régulation utilisant le système LC-MS / MS.

Une protéine Méthode de préparation pour le haut-débit Identification des protéines interagissant avec un cofacteur nucléaire utilisant LC-MS / MS Analysis

Nous présentons un protocole visant à quantifier avec précision les protéines avec étiquetage isobare, vaste fractionnement, outils bioinformatiques et mesures de contrôle de la qualité en combinaison avec la chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse à haute résolution.

Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel

Nous fournissons un protocole étape par étape pour split-BioID, une analyse de fragments-complémentation protéique basée sur la technique de marquage proximité BioID. Activé sur l’interaction de deux protéines donnés, elle permet l’analyse protéomique de complexes protéiques contextuelle dans leur environnement cellulaire native. La méthode est simple, rentable et ne nécessite que le matériel de laboratoire standard.

Split-BioID — L’analyse protéomique des Complexes de protéines spécifiques au contexte dans leur environnement natif cellulaire

Les interactions protéine-protéine et protéine-métabolite sont indispensables pour toutes les fonctions cellulaires. Ici, les auteurs décrivent un protocole qui permet une analyse parallèle de ces interactions avec une protéine de choix. Notre protocole a été optimisé pour les cultures de cellules végétales et combine purification d’affinité avec la protéine basé sur la spectrométrie de masse et de la détection de métabolite.

2 en 1 : en une seule étape de Purification d’affinité pour l’analyse parallèle de protéine-protéine et protéine-métabolite Complexes

Ici, nous présentons un protocole pour une technique de digestion on-membrane pour la préparation des échantillons pour la spectrométrie de masse. Cette technique facilite l'analyse pratique des interactions protéines-protéines.

Évaluation des interactions protéines-protéines à l'aide d'une technique de digestion on-Membrane

Ce protocole se concentre sur l'identification des protéines qui se lient aux phosphates inositol ou phosphoinositides. Il utilise la chromatographie d'affinité avec les phosphates d'inositol biotinylated ou les phosphoinositides qui sont immobilisés par l'intermédiaire de streptavidin à l'agarose ou des perles magnétiques. Les protéines de liaison du phosphate d'inositol ou du phosphoinositide sont identifiées par le ballonnement occidental ou la spectrométrie de masse.

Identification du phosphate d'inositol ou du phosphoinositide Protéines interactatrices par chromatographie d'affinité couplée à la fente occidentale ou à la spectrométrie de masse

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) utilise la cytométrie du débit pour détecter sensible les différences dans l'abondance des interactions protéines-protéines ciblées entre deux échantillons. QMI peut être effectué en utilisant une petite quantité de biomatériau, ne nécessite pas d'étiquettes génétiquement modifiées, et peut être adapté pour tout réseau d'interaction protéique précédemment défini.

Quantification de la dynamique du réseau d'interaction des protéines à l'aide de la co-immunoprécipitation multiplexée

Décrit est un workflow protéomique pour identifier des partenaires d'interaction de protéine d'une fraction subcellulaire nucléaire utilisant l'enrichissement d'immunoaffinité d'une protéine donnée d'intérêt et de la spectrométrie de masse sans étiquette. Le flux de travail comprend la fractionnement subcellulaire, l'immunoprécipitation, la préparation de l'échantillon assisté par filtre, le nettoyage hors ligne, la spectrométrie de masse et un pipeline de bioinformatique en aval.

Flux de spectrométrie de masse d'immunoprécipitation sans étiquette pour le profilage de l'interaction nucléaire à grande échelle

Ici, nous présentons un protocole permettant la capture et l’identification d’interactions protéine-protéine spécifiques à une maladie à partir de cellules et de tissus natifs à l’aide de sondes chimiques et de spectrométrie de masse. Les ensembles de données d’interaction qui en résultent sont analysés par le biais d’une plate-forme Web dédiée pour révéler les dysfonctionnements dynamiques du réseau et les altérations des voies liées à la maladie.

Cartographie des interactions protéine-protéine dysfonctionnelles dans la maladie

Découvrez une méthode QUICK optimisée pour identifier les interactions protéine-protéine spécifiques en utilisant le marquage métabolique 15N, l'immunoprécipitation et la spectrométrie de masse quantitative sur Chlamydomonas.

Un protocole pour lidentification des interactions protéine-protéine Basé sur 15 N marquage métabolique, immunoprécipitation, la spectrométrie de masse quantitative et daffinité de modulation (Vidéo) | JoVE Journal

Un protocole pour l'identification des interactions protéine-protéine Basé sur

Explorer plus de vidéos