Un protocole pour l'identification des interactions protéine-protéine Basé sur

L'objectif général de l'expérience suivante est d'identifier les protéines interagissant spécifiquement avec une protéine cible donnée dans des extraits cellulaires contenant des protéines solubles et membranaires. Tout d'abord, réalisez un marquage métabolique complet des cellules de chlamydomonas avec de l'azote 14 et de l'azote 15, puis préparez des lysats cellulaires contenant ou ne contenant pas une TP. Une étape facultative de réticulation permet de stabiliser les interactions transitoires entre protéines. Ensuite, séparez les lysats cellulaires en fractions, enrichies en protéines insolubles et membranaires, à partir desquelles la protéine cible et ses partenaires d'interaction spécifiques seront isolées.

Une protéine témoin et des protéines contaminantes sont immunoprécipitées et éludées. Mélangez ensuite les protéines immunoprécipitées, digérez-les en triple et analysez-les par LC-MS/MS. Les résultats permettent de distinguer les partenaires d'interaction vrais des faux en montrant des rapports de peptides différents entre l'azote 14 et l'azote 15 pour les protéines interagissant spécifiquement avec la protéine cible, contrairement aux rapports égaux observés pour l'azote.

14 rapports azote 15 peptides pour la protéine cible, la protéine contrôle et les protéines contaminantes. La méthode de choix pour analyser les interactions protéine-protéine consiste à immunoprécipiter directement la protéine d'intérêt avec ses partenaires d'interaction à partir d'extraits cellulaires où elles sont toutes deux présentes dans leur conformation et à leurs concentrations natives.

Cependant, lorsqu'on procède ainsi, des protéines contaminantes sont également précipitées, principalement parce qu'elles interagissent avec les anticorps, car les spectromètres de masse modernes sont extrêmement sensibles. Ils identifieront sans ambiguïté les protéines contaminantes, rendant ainsi impossible la distinction entre contaminants et véritables partenaires d'interaction. Ce problème est résolu par la technique présentée ici, qui repose sur un marquage métabolique par 15 N, une immunoprécipitation dont l'affinité est modulée ici par l'état A TP, et une spectrométrie de masse quantitative.

La technique sera démontrée par Stefan SCH Malinger, doctorant senior dans mon laboratoire. Après avoir marqué les cellules pendant 10 générations, transférez deux aliquotes de cellules de chlamydomonas marquées respectivement à l'azote 14 et à l'azote 15 dans des tubes 4G SA, récoltez-les par centrifugation, resuspendez les culots dans deux millilitres de tampon de lyse glacé, puis transférez les suspensions dans des tubes Falcon de 15 millilitres. Récupérez les cellules restantes avec un millilitre supplémentaire de tampon de lyse chacun, ajouté à chaque échantillon. Ajoutez 50 microlitres d'inhibiteur de protéase 25 x et 12,5 microlitres de chlorure de magnésium un molaire, puis soniquez les échantillons quatre fois pendant 20 secondes sur glace, avec des pauses de 22 secondes entre chaque cycle pour permettre le refroidissement.

Préparez quatre coussins de saccharose de six millilitres dans des tubes à paroi mince SW 41 TI. Déposez soigneusement le volume total des lysats cellulaires sur les coussins de saccharose. Équilibrez avec le tampon de lyse et centrifugez pour séparer les complexes protéiques solubles des membranes.

Transférez les complexes protéiques solubles situés au sommet du gradient dans quatre tubes Falcon de 15 millilitres, en veillant à ne pas transférer de parties du coussin de saccharose. Ajoutez ensuite du Triton X-100 à 10 % à chaque échantillon pour obtenir une concentration finale de 0,5 %, mélangez soigneusement, puis ajoutez du tampon de lyse jusqu'à un volume total de sept millilitres.

Pour les analyses par électrophorèse SDS-PAGE et immunobuvardage. Mettre de côté 70 microlitres de chaque extrait cellulaire soluble dans un nouveau tube conique de 1,5 millilitre et ajouter 70 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS 2X. Ensuite, éliminer les coussins de saccharose des tubes à paroi mince SW 41 TI et ajouter trois millilitres de tampon de lyse à chaque culot.

Ajouter un millilitre de Triton X-100 à 10 % pour obtenir une concentration finale de 2 %. Après dissolution de chaque culot par sonication, ajouter le tampon de lyse pour un volume total de cinq millilitres et centrifuger. Comme précédemment, récupérer les fractions supérieures des complexes de protéines membranaires dans des tubes Falcon de 15 millilitres. Ajouter le tampon de lyse contenant 2 % de Triton X-100 pour un volume final de sept millilitres.

Utilisez 70 microlitres de ces échantillons pour les analyses par électrophorèse SDS et par immunotransfert. Équilibrez d'abord la protéine couplée à l'anticorps. Ajoutez des billes séro avec deux lavages de quatre millilitres de tampon de lyse, diluez à huit millilitres et aliquotez.

Un millilitre de la suspension à chacun des huit tubes Falcon de 15 millilitres contenant des complexes protéiques solubles ou membranaires provenant de cellules marquées à l'azote 14 et à l'azote 15, en présence ou en absence de TP, incuber pendant deux heures à quatre degrés Celsius sur un rouleau à tubes afin de précipiter les complexes protéiques. Récupérer les billes par centrifugation, jeter les surnageants en laissant un petit volume de liquide au-dessus des billes pour éviter la contamination par des protéines adhérant aux parois en plastique. Transférer les échantillons dans de nouveaux tubes coniques de 1,5 millilitre afin de récupérer toutes les billes restantes dans les tubes Falcon. Ajouter 0,8 millilitre supplémentaire de tampon de lyse contenant 0,1 % de Triton à chacun, vortexer doucement, puis centrifuger et transférer le tampon avec les billes résiduelles vers les tubes Eppendorf. Après plusieurs étapes de lavage, centrifuger les échantillons pendant 15 secondes à 16 100 × g et à quatre degrés Celsius.

Retirez d'abord les surnageants de l'échantillon à l'aide d'une pipette classique. Ensuite, éliminez complètement tout surnageant résiduel à l’aide d'une seringue Hamilton de 50 microlitres. Ajoutez 100 microlitres de tampon d'élution fraîchement préparé à chaque échantillon et incubez dans un mélangeur thermique à 800 tr/min, puis centrifugez les échantillons pendant 15 secondes à 16 100 ×g et à 25 degrés Celsius.

Transférez maintenant chaque surnageant dans un tube neuf à l’aide d’une seringue Hamilton propre de 50 microlitres. Ajoutez également 50 microlitres de tampon d’élution aux billes, en suivant le même protocole que pour les échantillons précédents, puis rassemblez les élutions respectives. N’oubliez pas de conserver 30 microlitres de tous les EIT des échantillons pour les analyses par électrophorèse SDS et par immunoblot.

Combinez maintenant les précipités éludés provenant des protéines solubles et membranaires marquées à l'azote 14 et à l'azote 15, traités ou non avec de l'ATP. Ensuite, effectuez la réduction, l'alkylation et la digestion initiale en milieu d'urée concentrée comme décrit dans le manuscrit accompagnant. Puis, procédez à une digestion en trois étapes sur roue rotative pendant au moins 16 heures.

À 37 degrés Celsius. Faire tomber en pellet les billes de tripsine par une centrifugation de cinq minutes à 16 100 ×g et à 4 degrés Celsius. Transférer les surnageants dans des tubes Eppendorf neufs de deux millilitres.

Lavez les anciens tubes avec 50 microlitres de bicarbonate d'ammonium 20 millimolaire, 0,5 % d'acide acétique, puis rassemblez-les avec les premiers surnageants. Afin de préparer des embouts C18 maison pour le désalinage des échantillons, découpez deux disques dans un matériau C18 emcor à l’aide d’une aiguille de seringue et insérez-les dans un embout de pipette de 200 microlitres. Percez ensuite des trous dans les couvercles de quatre tubes einor de deux millilitres et insérez-y les embouts. Préconditionnez les embouts C18 avec 50 microlitres de solution B, centrifugez pendant trois minutes à 800 ×g et à 25 degrés Celsius.

Ensuite, équilibrer les embouts de type C 18 avec 100 microlitres de solution, par une centrifugation de trois minutes à 800 G et à 25 degrés Celsius. Répéter cette étape d'équilibration une fois supplémentaire. Puis charger 100 microlitres des surnageants d'échantillons provenant des digestions triptyques sur les embouts de type C 18, et centrifuger pendant trois minutes à 800 G et à 25 degrés Celsius.

Répétez le chargement sur la colonne pour une application complète des surnageants d'échantillon. Après lavage des embouts de phase C18, éluez les peptides tryptiques dans un nouveau tube Eppendorf de 1,5 millilitre avec 50 microlitres de solution B, puis centrifugez pendant trois minutes à 800 ×g et 25 °C. Répétez l'étape d'élution une fois, puis séchez complètement les peptides dans un évaporateur SpeedVac.

Suspendez les peptides séchés dans 20 microlitres de solution A et incubez pendant au moins une heure sur de la glace, en interrompant par deux incubations de 15 minutes dans un bain sonique, puis centrifugez pendant 20 minutes à 16 100 ×g et à 4 degrés Celsius, et appliquez Senna à nano C-M-S-M-S HSP 70. On sait que les protéines de choc thermique interagissent avec des co-chaperonnes spécifiques et des substrats uniquement en l'absence d'ATP ; dans ces extraits cellulaires marqués à l'azote 14, hs P 70 B et CGE un sont presque exclusivement localisés dans la fraction soluble, indépendamment de l'état de l'ATP. En revanche, CF un bêta est localisé dans les fractions soluble et enrichie en membrane.

Étant donné que la sonication cisaille une partie de CF une bêta de la membrane située sur l'ATP synthétase, elle sert de témoin de chargement pour les deux fractions. Des quantités similaires de HSP 70 B ont été précipitées à l’aide d’anticorps anti-HSP 70 B à partir d’extraits solubles marqués à l’azote 14 et à l’azote 15, indépendamment de l’état en ATP. En revanche, de faibles niveaux de protéine HSP 70 B ont été précipités à partir des fractions membranaires, avec des quantités légèrement plus élevées provenant des fractions membranaires appauvries en ATP par rapport aux fractions membranaires riches en ATP, comme prévu par l’affinité de CGE E une pour hs.

P 70 B dépend du contexte. Aucune CGE n'a été co-précipitée avec HS P 70 B dans des fractions solubles ou membranaires riches en TP. Les quantités de protéine CGE co-précipitées avec HS P 70 B à partir de fractions solubles et membranaires appauvries en TP corrélaient quantitativement avec la quantité de HSP 70 B précipitée. L'interaction de CGE avec HS P 70 B uniquement à l'état A DP est également observée lors de l'analyse par spectrométrie de masse.

Dans cette expérience, des précipités ont été préparés à partir de mélanges d'extraits marqués à l'azote 14 ne contenant pas de TP et d'extraits marqués à l'azote 15 contenant un TP. Alors que les formes marquées lourde et légère du peptide HSP70B ont été détectées à des intensités égales, seule la forme marquée légère du peptide CGE1 provenant des extraits appauvris en TP a été détectée. Les mêmes peptides issus du précipité anti-HSP70DDB, obtenu à partir de mélanges d'extraits cellulaires solubles marqués de façon réciproque, sont montrés ici. En conséquence, seule la forme marquée lourde du peptide CGE1 dans des extraits appauvris en TP a été détectée, ainsi que les peptides HSP70B marqués à la fois en forme légère et lourde.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon réaliser une expérience de co-immunoprécipitation avec la préparation d'échantillons pour une analyse par spectrométrie de masse. N'oubliez pas que les contaminations par des protéines humaines, en particulier la kératine, perturberont vos mesures de spectrométrie de masse, et que des précautions de sécurité telles que le port de gants, un environnement propre et l'utilisation de zones de qualité LCMS sont donc essentielles lors de la réalisation de cette procédure.