Création d'environnements gazeux définies pour étudier les effets de l'hypoxie sur la C. elegans

L'objectif de l'expérience suivante est de mettre en place et de maintenir une chambre d'hypoxie en utilisant une méthode d'écoulement continu. Cela est réalisé en obtenant et en fabriquant les tubes, flacons et chambres nécessaires pour la procédure. Dans un deuxième temps, reliez le réservoir d'oxygène et sélectionnez le débit afin de créer le niveau d'hypoxie souhaité.

Hydratez le gaz en le faisant passer à travers un flacon à bulles rempli d'eau déionisée. Connectez le gaz hydraté à la chambre d'hypoxie et placez les échantillons d'essai dans la chambre afin de les exposer à des conditions hypoxiques. Les résultats obtenus montrent une létalité embryonnaire dépendante de Hi F1 en conditions d'hypoxie, basée sur l'observation de la viabilité jusqu'à l'âge adulte.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les boîtes à gants, réside dans sa facilité et son faible coût de fabrication en laboratoire, tout en permettant une concentration précise et reproductible de gaz dans la chambre environnementale. Bien que cette méthode permette d'étudier la réponse à l'hypoxie chez le nématode C. elegans, elle peut également être adaptée à d'autres systèmes, notamment des organismes modèles plus grands et des cultures cellulaires. De plus, elle peut être utilisée pour étudier d'autres gaz, tels que le dioxyde de carbone et le sulfure d'hydrogène.

Ce protocole montre comment construire une chambre d'hypoxie. Le gaz est stocké dans des bouteilles de gaz comprimé ayant des concentrations d'oxygène définies, et un détendeur à deux étages est fixé. Le gaz pénètre par le bas du tube de débit et sort par le haut à un débit correct.

Le gaz s'écoule ensuite dans l'ampoule à bulles, hydratant ainsi le gaz. Le gaz hydrogéné passe ensuite dans la chambre d'hypoxie par la vanne d'entrée, exposant les échantillons à l'hypoxie. Enfin, le gaz est évacué dans la pièce par un orifice d'évacuation percé dans la chambre.

Un cristallisoir en Pyrex ou une boîte de rangement pour flèches peut être utilisé comme corps de la chambre environnementale. Le volume du récipient doit être maintenu au minimum, et le matériau doit être imperméable aux gaz. Percez un trou sur un côté du récipient à l’aide d’un foret à pointe en carbone ou en diamant, puis insérez-y un raccord à emboîtement pour tuyau en plastique.

Mélangez l'époxy avant de l'appliquer sur la boîte et le raccord. Répétez ensuite la même procédure sur le côté opposé du récipient, avec le deuxième trou décalé par rapport au premier. Pour augmenter le mélange turbulent, utilisez un tube d'un huitième de pouce de diamètre extérieur, en FEP ou en nylon, pour relier les bouteilles de gaz comprimé à un dispositif de régulation de débit, tel qu'un débitmètre massique ou un rotamètre.

Les réservoirs de gaz doivent contenir des concentrations d'oxygène définies, équilibrées avec de l'azote, conformes à une norme certifiée pour la teneur en oxygène ou pour des conditions anoxiques. Pour l'azote pur, utilisez un régulateur à deux étages, le deuxième étage étant réglé à la pression souhaitée. Consultez les instructions du protocole écrit pour choisir un débit approprié.

Ensuite, reliez le tuyau du détendeur à deux étages au tube de débit qui contrôle le débit du gaz entrant dans la chambre. Les sorties du tube de débit sont reliées à une bouteille de lavage à gaz équipée d'un cylindre fritté contenant de l'eau distillée. Puis, reliez le tuyau situé de l'autre côté de la bouteille de lavage à l'un des raccords de la chambre environnementale.

Cela permettra d'hydrater le gaz entrant dans la chambre environnementale. Utilisez de la graisse à vide pour sceller la chambre. Ensuite, placez des poids sur le couvercle de la chambre afin d'assurer une étanchéité hermétique.

Tester l'étanchéité en retenant une petite quantité d'eau dans la paume d'une main gantée contre le raccord d'échappement des gaz de la chambre et en vérifiant la présence de bulles. Premièrement, générer des populations synchronisées de nématodes marins. Placer un à cent adultes de *C. elegans* dans une goutte de solution d'eau de Javel alcaline à la surface d'une boîte de milieu de culture pour nématodes non ensemencée.

Laisser la solution d'eau de Javel pénétrer dans la boîte après une période d'incubation d'au moins huit heures. Transférer les larves L1 synchronisées sur une boîte ensemencée avec des bactéries OP50 vivantes. En alternative, laisser les adultes GRA pondre des œufs sur la boîte pendant deux à trois heures afin de générer un groupe de vers qui se développeront de manière synchrone, ou prélever des larves L4 à partir d'une population mixte pour recueillir des embryons jeunes.

Au stade deux à quatre cellules, utilisez une lame de rasoir pour découper des adultes GR dans un petit volume d'eau, puis transférez les embryons à l'aide d'une pipette à bouche avant de placer les vers sur la boîte pour exposition à des conditions hypoxiques. Disposez un anneau de palmitate d'acide à 10 milligrammes par millilitre dans l'éthanol autour du bord des boîtes. Pour empêcher les vers de s'échapper de la surface de la boîte en gélose.

L'acide palmitique va précipiter hors de la solution. Lorsque l'éthanol s'évapore, il forme une barrière physique assurant l'uniformité ; veillez donc à remplacer l'eau dans le flacon de lavage à gaz avant l'exposition dans la chambre environnementale. Après avoir transféré les vers sur les boîtes, scellez les boîtes dans la chambre environnementale, démarrez le débit de gaz et maintenez l'exposition pendant la durée souhaitée pour le dosage.

Pour évaluer la viabilité des embryons jusqu'à l'âge adulte, laisser les vers se développer pendant 48 heures après le retour à l'air ambiant, moment auquel ils devraient être des larves de quatrième stade ou des adultes d'un jour. Noter la viabilité jusqu'au stade adulte. Pour visualiser les vers après une exposition hypoxique, transférer les vers dans une goutte de milieu M9 sur un coverslip carré de 22 millimètres et retourner celui-ci sur un tampon de 2 % d'agarose dans le milieu M9, si nécessaire.

25 millimolaire d'amol ou 10 millimolaire d'azoture de sodium peuvent être utilisés comme anesthésique. Alternativement, après exposition à l'hypoxie, la chambre environnementale transparente peut être placée directement sur la platine d'un microscope stéréoscopique. Deux vues sont montrées, dont une incluant l'ensemble du dispositif de flux gazeux.

L'autre avec seulement la chambre sur la platine du microscope. Faire croître des vers Bristol N2 sur quatre plaques de croissance de 10 centimètres de diamètre jusqu'à ce que la majorité des vers soient des adultes GR. Laver les vers dans un tube conique de 15 millilitres à l'aide d'une solution d'eau de Javel alcaline à une concentration de un à cinq, puis incuber avec agitation jusqu'à ce que les vers commencent à se désagréger.

Pas plus de cinq minutes. Laver les vers trois fois avec du M neuf en centrifugant à 1 500 ×g entre chaque lavage, sans plaque de rupture. Déposer les embryons blanchis sur huit plaques NGM de 150 millimètres et laisser les embryons se développer en larves L4 pendant environ 48 heures.

À 22 degrés Celsius, introduire les boîtes dans la chambre environnementale et les exposer à des conditions hypoxiques et anoxiques pendant quatre heures ou pendant la durée spécifiée par le protocole expérimental. Pour récolter les échantillons, retirer rapidement le couvercle de la chambre hypoxique. Prélever une boîte d'échantillons, refermer la chambre, noter l'heure et enregistrer les étapes.

Après avoir retiré les vers de l'hypoxie, ce processus complet doit prendre moins de deux minutes. Utilisez de l'eau distillée pour laver les vers sur un filtre en nylon, puis versez-les dans un tube conique de 15 millilitres étiqueté contenant 100 microlitres de SDS à 1 % et centrifugez. Les vers dans le SDS sont centrifugés dans une centrifugeuse de bureau à 1 500 × g pendant 15 à 20 secondes.

Avec précaution, utiliser un aspirateur pour éliminer la majeure partie du surnageant du tube, en laissant intact le culot de vers. À l’aide d’une pipette, transférer le culot de vers avec un volume prédéterminé de liquide dans un tube microcentrifuge de 1,5 µL étiqueté. Si l’échantillon doit être utilisé pour une électrophorèse SDS-PAGE, ce tube peut contenir un volume égal de colorant de charge pour protéines à deux fois la concentration ; fermer hermétiquement le tube et l’immerger dans de l’azote liquide.

Répétez jusqu'à ce que tous les échantillons aient été isolés. Suivez ces procédures pour les échantillons témoins d'air ambiant afin d'assurer la cohérence ; les échantillons peuvent être conservés à moins 20 degrés Celsius. Cette figure montre la viabilité des embryons exposés à 1000 parties par million d'oxygène, 5 000 parties par million d'oxygène et à la normoxie, environ 210 000 parties par million d'oxygène.

Les embryons sont exposés à chaque condition pendant 24 heures dans des chambres à flux d'oxygène continu. Les vers ont été transférés dans des conditions normoxiques et laissés se développer jusqu'au stade adulte pendant 48 heures, puis leur viabilité jusqu'au stade adulte a été évaluée. Après cette procédure, des échantillons peuvent être collectés pour des analyses ultérieures par immunoblot, QPCR ou des tests physiologiques tels que la durée de vie ou la production de progéniture.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière de mettre en place une chambre d'hypoxie à flux continu dans votre propre laboratoire.