Name: Création denvironnements gazeux définies pour étudier les effets de lhypoxie sur la C. elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Découvrez comment créer une chambre d'hypoxie à flux continu pour étudier les effets de l'oxygène sur C. elegans. Cette méthode permet de contrôler précisément les concentrations gazeuses et d'observer la létalité embryonnaire dépendante de HIF-1.

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Nous remercions les membres du laboratoire Miller pour la discussion et la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse de nouveau chercheur du Centre de choc Nathan d&#39;excellence dans la biologie fondamentale du vieillissement de DLM et le National Institutes of Health Award R00 AG030550 à DLM.

1. Construction de chambres de l&#39;environnement <ol><li> Sélectionnez le plus petit volume raisonnable de la chambre requis pour la portée de votre projet. Chambre doit être composée de gaz (O 2) un matériau imperméable. Plats en Pyrex de cristallisation, des boîtes Anaeropack ou de grandes boîtes en acrylique coulé (Ellard Instrumentation), peuvent être utilisés. Nous avons constaté que 9 mm 50 plaques peuvent tenir dans un plat de 100 x 50 cristallisation Kimex. Les plaques de verre peut être utilisé comme couvercles pour les plats en Pyrex de cristallisation. </li><li> Percez un trou dans la chambre choisie et monter avec un mâle en plastique à raccord Luer cannelé (Cole Parmer). Raccords peut être assurée par raccord de tuyau ou avec de l&#39;époxy. Installer un raccord similaire sur le côté opposé du récipient pour permettre au gaz de s&#39;écouler dans et hors de la chambre. Si possible, compenser les trous pour augmenter le mélange turbulent. </li><li> Obtenir des réservoirs de gaz comprimé avec définies concentrations de O 2 (en balance avec N 2) qui sont certifiés standard pour O 2 content ou, pour des conditions anoxiques, N 2 pur (&lt;10 ppm 2 O). Utilisez commutation automatique pour les organismes de réglementation à long terme des études pour éviter de perturber les niveaux d&#39;oxygène dans les chambres. </li><li> Réponse à l&#39;hypoxie organismique a été démontré que la température 15 à charge. En plaçant la chambre dans un incubateur, différentes températures puisse être maintenue. Températures au sein d&#39;un incubateur peut être inégale et, comme tel, il est prudent de faire usage de la température d&#39;un enregistreur de données de mesurer en permanence la température à l&#39;intérieur de la chambre. </li></ol> 2. Raccordement du gaz à la Chambre de l&#39;environnement <ol><li> Pour toutes les connexions, utiliser un huitième de pouce de diamètre extérieur tube relié par des connecteurs ou mousquetons soit raccords à compression. Tubulure doit être imperméable et non réactive avec O 2, tels que l&#39;éthylène-propylène fluoré (FEP) ou en nylon (Cole Parmer). Pour un schéma de l&#39;installation terminée, voir la figure 1. </li><li> Branchez le comréservoirs de gaz pressées à un dispositif de commande d&#39;écoulement, comme un régulateur de débit massique (Sierra Instruments) ou rotamètre (Aalborg). Faire en sorte que la pression en amont de la cuve est dans la gamme du dispositif d&#39;écoulement et les raccords flexibles cannelés. Deux-détendeurs sont généralement utilisés, avec la deuxième étape mis à la pression désirée [Voir la section trois pour la sélection du débit approprié] </li><li> Hydrater le gaz par barbotage dans l&#39;eau distillée en utilisant une bouteille de lavage de gaz avec bouteille fritte, puis directement dans l&#39;un des raccords sur la chambre de l&#39;environnement, laissant le deuxième raccord ouvert pour des gaz d&#39;échappement (voir Figure 1). Pour études à court terme, l&#39;hydratation de gaz protège contre le dessèchement de plaque, mais la surveillance d&#39;humidité peut être nécessaire pour études à long terme. </li><li> Graisse Dow Corning sous vide peut être utilisé pour sceller la chambre. Placer des poids sur le couvercle de la chambre afin d&#39;assurer un joint étanche à l&#39;air. Pour confirmer un joint étanche et un débit adéquat, tenir une petite piscine d&#39;eau dans la paume de ynotre main gantée pour le montage sur la chambre et de vérifier les bulles. </li></ol> 3. Sélection Débit <ol><li> En supposant un mélange parfait, il ya un échange de gaz de 90% de l&#39;atmosphère gazeuse à chaque fois le volume de la chambre est remplacé (loi de Fick). Par exemple, dans une chambre de 100 cc avec un débit de 100 cc / min, l&#39;air de la maison d&#39;origine dans la chambre sera remplacé par 90% de votre gaz désiré après 1 minute, et asymptotiquement vers un échange complet de 90% chaque minute par la suite. </li><li> Des débits plus élevés et les plus petits contenants atteindrez votre concentration d&#39;oxygène souhaitée plus rapidement. Pour 100 x 50 Kimex conteneurs (400 cc), un débit de 120 cc / min atteindra échange 99,9% en 10 minutes (3 échanges). Ce débit est adapté à la plupart des conditions d&#39;oxygène. A notre connaissance il n&#39;y a pas eu d&#39;enquête systématique de la façon dont le taux de variation de concentration en O 2 influe sur la réponse en C. elegans. </li></ol><ol><li> Worms exposés à des conditions hypoxiques couramment s&#39;échapper de la surface de plaques de gélose. Pour éviter cela, placez une bague d&#39;acide palmitique (10 mg / ml dans l&#39;éthanol) autour du bord des plaques. L&#39;acide palmitique sortira de la solution lors de l&#39;évaporation d&#39;éthanol, formant une barrière physique. Barrières acide palmitique n&#39;affectent pas le taux de ponte, la fécondité ou la durée de vie en C. elegans 16,17. Terriers ne se produisent plus fréquemment dans des conditions hypoxiques, si d&#39;autres mesures préventives ne sont généralement pas nécessaire. </li><li><ol><li> Générer des populations synchronisées par le blanchissement des adultes gravides dans une petite goutte de l&#39;eau de Javel non ensemencés alcaline sur les nématodes de croissance des médias (NGM) plaques 18. Contrairement à des protocoles standard de l&#39;hypochlorite de grande lots de blanchiment, choisissez 1-100 animaux dans une goutte d&#39;eau de Javel sur la surface d&#39;une plaque NGM, puis laisser l&#39;eau de Javel à absorber dans la plaque <sup&gt; 18. Après au moins 12 heures, transférer les larves L1 synchronisée à des plaques ensemencées avec des bactéries vivantes OP50. Alternativement, on peut permettre à des adultes gravides à pondre des oeufs sur la plaque pendant 2-3 heures afin de générer un groupe de vers qui se développera de façon synchrone ou ramasser larves L4 d&#39;une population mixte. </li><li> Évitez d&#39;exposer les embryons blanchis à l&#39;hypoxie, car cela peut réduire la viabilité 13. Pour recueillir des embryons jeunes (2-4 cellules), les adultes gravides peuvent être coupés dans un petit volume d&#39;eau avec une lame de rasoir et d&#39;embryons déménagé à plaques par pipette bouche pour l&#39;exposition subséquente à l&#39;hypoxie. </li></ol></li><li> Sceller les plaques dans la chambre de l&#39;environnement. Les animaux témoins doivent être conservés dans des conditions de normoxie (air de la maison) à la même température que les vers traités. Il n&#39;y a aucune différence observable entre les échantillons laissés dans la maison de l&#39;air et ceux maintenus dans une chambre identique à air de la maison qui coule sur eux. Initier flux de gaz et de maintenir l&#39;exposition pour le temps désiré. Pour assurer l&#39;uniformité dans la rampe, assurez-vous deremplacer l&#39;eau dans la bouteille de gaz de lavage avant l&#39;exposition. </li><li> Pour la survie des embryons de dosage, de permettre aux vers de se développer pour 48 h après le retour à l&#39;air ambiant, à quel point ils devraient être le quatrième stade larvaire / jour, un adulte. Score à la survie, la censure des vers qui ne peuvent pas être pris en compte. </li><li> Pour visualiser les animaux exposés à l&#39;hypoxie, déplacez vers une baisse de M9 sur un 22 mm 2 lamelle, et renverser sur un coussin de 2% d&#39;agarose dans M9 18. Si nécessaire, le lévamisole (25 mm) ou l&#39;azoture de sodium (10 mM) peut être utilisé comme anesthésique. L&#39;azoture de sodium et le lévamisole peut confondre certaines observations dues à la toxicité et doivent être utilisées judicieusement 19. </li></ol> 5. Récolte rapide de l&#39;hypoxie-exposées Worms (Exemple: Préparation des échantillons pour HIF-1 Analyse de l&#39;Ouest) Beaucoup induite par l&#39;hypoxie effets sont rapidement inversés lors du retour à l&#39;air ambiant, y compris la reprise de la production d&#39;œufs 12, la phosphorylation d&#39;épitopes mitotiquesdans l&#39;embryogenèse 13 et la dégradation de la protéine HIF-1 9,20. L&#39;isolement rapide des animaux exposés à une hypoxie est nécessaire pour obtenir des effets reproductibles dans ces conditions. Avec cette configuration, les animaux peuvent être récoltés et congelés dans l&#39;azote liquide en moins de deux minutes. Tandis que les chambres à gants hypoxie case Autoriser pour la manipulation des échantillons dans des conditions anoxiques, leur coût et de praticité pour d&#39;autres conditions que l&#39;anoxie limitent leur utilité. <ol><li> Cultiver Bristol vers N2 sur 4 à 10 cm en forte croissance (HG) plaques jusqu&#39;à ce que la majorité des vers sont adultes gravides 18. Laver vers un tube de 15 ml conique contenant une solution de blanchiment alcalin et 01:05 incuber avec la rotation jusque vers commencent à se dissoudre, pas plus de 5 minutes 9. Laver les vers à trois reprises avec M9, le filage bas à 1500 xg entre chaque lavage sans freinage. </li><li> Embryons de plaques décolorées SUR DES 8 150 plaques NGM mm et permettent de développer de larves L4 (~ 48 heures pour Bristol N2 à 22 ° C).Déplacez plaques aux chambres environnementales et exposer à hypoxique (1.000 ppm, 5,000 ppm) et anoxiques (N2) des conditions pour les 4 heures. Les temps d&#39;exposition varie en fonction de la conception expérimentale. Bien que l&#39;exposition à l&#39;hypoxie a un effet immédiat sur ​​le taux de ponte, deux embryons de cellules meurent après 16-18 heures d&#39;exposition 12. Avec cette configuration chambre de l&#39;hypoxie, la limite inférieure de l&#39;exposition est limitée par le taux de change atmosphère nécessaire pour atteindre l&#39;équilibre. </li><li> Étiqueter un tube de 1,5 ml de micro et un tube de 15 ml conique pour chaque échantillon expérimental. Worms exposés à une hypoxie sont plus susceptibles de s&#39;en tenir aux côtés du tube lors de la récolte. Pour éviter cela, placer 100 ul de dodécylsulfate de sodium à 1% (SDS) dans chaque tube 15 ml conique. Si SDS inhibe les applications en aval, la sérum albumine bovine (BSA) peut être utilisé pour empêcher de coller. L&#39;utilisation systématique de la SDD ou BSA ne semble pas avoir une différence apparente. Ajouter 50 ul de 2x chargement protéines colorant (4% SDS, 10% de 2-mercaptoéthanol et untrace de bleu de bromophénol dans le glycérol 30% (p / v)) pour le tube de 1,5 ml de micro. Avoir un Dewar d&#39;azote liquide prêt. </li><li> Temps des étapes après avoir enlevé les vers de l&#39;hypoxie et l&#39;enregistrement. Retirez le couvercle de la chambre hypoxique, prendre une plaque échantillon, et refermer la chambre. Utiliser de l&#39;eau distillée pour se laver les vers sur un filtre en nylon, puis versez-le dans le tube 15 ml conique. Faites tourner les vers le bas dans une centrifugeuse de bureau à 1500 xg pendant 15-20 secondes avec frein. </li><li> Utilisez un aspirateur pour enlever la plupart du surnageant du tube, laissant le culot à vis sans fin intacte. </li><li> Avec une pipette, déplacez le culot à vis sans fin dans 50 ul de la tube de 1,5 ml de micro. Scellez le tube et le plonger dans l&#39;azote liquide. </li><li> Répétez jusqu&#39;à ce que tous les échantillons ont été isolés. Suivez ces procédures pour les échantillons de contrôle internes de l&#39;air pour la cohérence. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Effets de l&#39;hypoxie organismales peut être vuen examinant la viabilité à l&#39;âge adulte de C. elegans (Figure 2). Les embryons pondus par type sauvage Bristol (N2) et HIF-1 (IA04) mutants de délétion sont tous de survivre dans l&#39;air des maisons concentrations de O 2 (210.000 ppm 2 O). N 2 vers sont capables de s&#39;adapter et de survivre à l&#39;âge adulte en 5000 ppm 2 O, tandis que HIF-1 embryons ne sont pas viables. Cela montre que HIF-1 est indispensable pour s&#39;adapter à l&#39;évolution des niveaux d&#39;oxygène disponible dans l&#39;environnement 10. Ni N2, ni HIF-1 les animaux peuvent survivre à l&#39;exposition à 1000 ppm O 2. Visualisation ver directement dans l&#39;hypoxie est réalisable avec l&#39;utilisation d&#39;un microscope à dissection et récipient transparent (Figure 3). En plaçant directement la chambre de l&#39;hypoxie sur la portée de dissection, il n&#39;est pas nécessaire d&#39;enlever les vers de l&#39;hypoxie d&#39;observer les réactions des organismes. La portée peut être équipé d&#39;illumation fluorescence (comme dans la figure 3 </strong&gt;), élargissant ainsi les types d&#39;observations dans l&#39;hypoxie qui sont possibles. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig1.jpg" /> Figure 1. Exemple de l&#39;hypoxie chambre. Direction du débit de gaz est indiqué par des flèches. Le gaz est stocké dans des réservoirs de gaz comprimé avec définies concentrations de O 2 (1) et un régulateur à deux étages est attaché (2). Le gaz pénètre dans la partie inférieure du tube d&#39;écoulement (3), sortant du haut au débit correcte. Gaz s&#39;écoule ensuite dans le ballon bulle (4), hydratant le gaz (assurer une connexion correcte de la fiole à bulles par observation de bulles). Gaz hydratée passe ensuite dans la chambre de l&#39;hypoxie à la soupape d&#39;admission (5), d&#39;exposer les échantillons à l&#39;hypoxie. Le gaz, enfin, des évents dans la pièce à travers un trou d&#39;échappement percé dans la chambre. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig2.jpg" /> Figure 2. La viabilité des embryons exposés à 1000 ppm 2 O, O ppm 5000 <sub&gt; 2 et normoxie (~ 210 000 ppm 2 O). Les embryons ont été exposés à chacune des conditions d&#39;oxygène que les embryons pendant 24 heures en continu chambres débit de l&#39;oxygène. Worms ont été transférés à des conditions normoxiques, a permis de développer à l&#39;âge adulte pendant 48 heures, puis a marqué pour la viabilité à l&#39;âge adulte. n&gt; 50, N = 5. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig3.jpg" /> Figure 3. Visualisation de C. elegans dans l&#39;hypoxie à la microscopie. Worms sont exposés à une hypoxie en utilisant les méthodes décrites. La chambre transparente de l&#39;environnement (construit avec un plat en pyrex de cristallisation et la plaque de verre) est placé directement sur la scène d&#39;un microscope à dissection. Deux points de vue sont présentés, l&#39;un incluant le flux de gaz toute mise en place, l&#39;autre avec juste la chambre sur la platine du microscope.

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<li>Nystul, T. G., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide-induced+suspended+animation+protects+against+hypoxic+damage+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide-induced suspended animation protects against hypoxic damage in Caenorhabditis elegans.</a> PNAS. 101, 9133-9136 (2004).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Cette méthode présente une stratégie pour construire un environnement hypoxique qui permet pour les environnements avec des concentrations précises d&#39;oxygène pour être maintenus dans le laboratoire. Ces chambres offrent une méthode simple pour exposer les organismes à certains de faibles concentrations de O 2 et le suivi des sorties moléculaires et physiologiques. La chambre de l&#39;environnement décrit est assemblé par le laboratoire au lieu de commerce achetés et peut donc être modifié pour s&#39;adapt...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Tubes (FEP et PTFE) </td><td> Cole Parmer Tygon </td><td> YO-95821-00 (1/8 &quot;BCS) 06605-27 (1/16 x 1/8 &quot;PTFE) &#39;R-3603 </td></tr><tr><td> Raccords à compression </td><td> Seattle Fluid Systems </td><td> 06363-58 (M. coupleur 1/16 &quot;) 06363-62 (F coupleur 1/16 &quot;) 06363-60 (M. coupleur 1/8 &quot;) 06363-61 (F coupleur 1/8 &quot;) </td></tr><tr><td> Le tube d&#39;injection </td><td> Aalborg </td><td> PMR3-010073 (sortie 3) PMR1-013520 (1 sortie) </td></tr><tr><td> Régulateur de débit massique </td><td> Sierra Instruments </td><td> 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (messe Trak) C100L-JJ-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) </td></tr><tr><td> Réservoir de gaz comprimé </td><td> Airgas </td><td> Fabriqué à l&#39;ordre &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Mâle en plastique aux raccords Luer cannelés </td><td> Cole Parmer </td><td> 45505-41 (série 500 1/16 &quot;) </td></tr><tr><td> Cast boîtes acryliques </td><td> Ellard Instrumentation </td><td> Fait sur commande </td></tr><tr><td> Accessoires de tuyauterie (en laiton ou en acier inoxydable) </td><td> Seattle Fluid Systems </td><td> B-402-1 (1/4 &quot;écrou) B-200-3 (1/8 &quot;Té) B-400-ensemble (1/4 &quot;embouts) B-QM2-B1-200 (QC corps QM) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 &quot;mâle conn) </td></tr><tr><td> Graisse Dow Corning sous vide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273554 </td></tr><tr><td> Boîte de AnaeroPack </td><td> Société Misubishi Gas Chemical </td><td> R684004 (0,4 litre) R685025 (2,5 litre) R685070 (7,0 litre) </td></tr><tr><td> Bouteille de gaz de lavage Pyrex </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CLS31770500C (500 ml) CLS31770250C (250 ml) CLS31770125C (125 ml) &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> L&#39;acide palmitique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0500 </td></tr><tr><td> De chèvre anti-IgG de souris-peroxydase de raifort </td><td> Southern Biotechnology Associates </td><td> 1032-1005 </td></tr><tr><td> SuperSignal Ouest substrat Chemiluminsecent Pico </td><td> Pierce Chemical </td><td> 34077 </td></tr><tr><td> 100 x 50 plats de cristallisation de verre </td><td> Kimax Kimble </td><td> 23000 </td></tr></tbody></table>

création d&#39;environnements gazeux définies pour étudier les effets de l&#39;hypoxie sur la<em&gt; c. elegans</em

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

L&#39;oxygène est essentiel pour tous les métazoaires à survivre, à une exception près connue 1. Diminution de la disponibilité d&#39;O 2 (hypoxie) peuvent survenir pendant les états de la maladie, le développement normal ou changements des conditions environnementales 2-5. Comprendre les voies de signalisation cellulaires qui sont impliqués dans la réponse à l&#39;hypoxie pourrait fournir un nouvel éclairage sur les stratégies de traitement pour diverses pathologies humaines, de course à un cancer. Cet objectif a été entravée, du moins en partie, par des difficultés techniques associées à l&#39;exposition hypoxique contrôlée dans des organismes modèles génétiquement dociles. Les nématode Caenorhabditis elegans est idéalement adapté comme un organisme modèle pour l&#39;étude de la réponse hypoxique, comme il est facile de culture et de manipuler génétiquement. En outre, il est possible d&#39;étudier les réponses cellulaires à hypoxiques spécifiques concentrations d&#39;O 2 sans effets confondants depuis C. elegans obtenir O 2 (et d&#39;autres gaz) par diffusion, par opposition à un système respiratoire facilitée 6. Facteurs connus pour être impliqués dans la réponse à l&#39;hypoxie sont conservées dans C. elegans. La réponse réelle à l&#39;hypoxie dépend de la concentration spécifique de O 2 qui est disponible. Dans C. elegans, l&#39;exposition à l&#39;hypoxie modérée provoque une réponse transcriptionnelle médiée en grande partie par HIF-1, les très conservées facteur de transcription hypoxia-inducible 6-9. C. elegans embryons exigent HIF-1 à survivre dans 5,000-20,000 ppm O 2 7,10 . L&#39;hypoxie est un terme général pour &quot;inférieure à la normale O 2&quot;. Normoxie (normal O 2) peut aussi être difficile à définir. On considère généralement l&#39;air ambiant, qui est 210 000 ppm 2 O à la normoxie. Toutefois, il a été démontré que C. elegans a une préférence comportementale pour concentrations d&#39;O 2 à partir de 5-12% (50,000-120,000 ppm 2 O) 11. Dans larvae et les adultes, HIF-1 agit pour prévenir l&#39;hypoxie induite par la diapause en 5000 ppm 2 O 12. Toutefois, HIF-1 ne joue pas un rôle dans la réponse à de faibles concentrations de O 2 (anoxie, une définition opérationnelle &lt;10 ppm 2 O) 13. En anoxie, C. elegans entre dans un état ​​d&#39;animation suspendue réversible dans laquelle toutes les activités observables au microscope cesse 10. Le fait que différentes réponses physiologiques se produisent dans des conditions différentes met en évidence l&#39;importance d&#39;avoir un contrôle expérimental sur la concentration de O 2 hypoxique. Ici, nous présentons une méthode pour la construction et la mise en œuvre des chambres de l&#39;environnement qui produisent fiables et reproductibles des conditions hypoxiques avec des concentrations définies de O 2. La méthode des flux continuel assure l&#39;équilibration rapide de la chambre et augmente la stabilité du système. En outre, la transparence et laaccessibilité des chambres permettre une visualisation directe des animaux étant exposées à l&#39;hypoxie. Nous avons en outre démontrer une méthode efficace de la récolte C. échantillons elegans rapidement après une exposition à l&#39;hypoxie, ce qui est nécessaire pour observer un grand nombre des changements rapidement inversée qui se produisent dans 10,14 hypoxie. Cette méthode fournit une fondation de base qui peut être facilement modifié pour les besoins de chaque laboratoire, y compris des systèmes modèles différents et une variété de gaz.

Cet article détaille comment utiliser à flux continu chambres hypoxie pour générer des atmosphères avec des concentrations définies de O<sub&gt; 2</sub&gt; Pour comprendre les réponses biologiques à une diminution de O<sub&gt; 2</sub&gt;. Ce système est facile à installer et à entretenir, et suffisamment souple pour convenir à un large éventail de O<sub&gt; 2</sub&gt; Les concentrations et les systèmes modèles

Création d&#39;environnements gazeux définies pour étudier les effets de l&#39;hypoxie sur la<em&gt; C. elegans</em

L'oxygène est essentiel à la survie de tous les métazoaires, à une exception connue près1. Une diminution de la disponibilité en O2 (hypoxie) peut survenir lors d'états pathologiques, ...

L'objectif de l'expérience suivante est de mettre en place et de maintenir une chambre d'hypoxie en utilisant une méthode à flux continu. Cela est réalisé en obtenant et en fabriquant les tubes, flacons et chambres nécessaires pour la procédure. Dans un deuxième temps, reliez le réservoir d'oxygène et sélectionnez le débit pour créer le niveau d'hypoxie souhaité.Hydratez le gaz en le faisant passer à travers un flacon à bulles rempli d'eau déionisée. Connectez le gaz hydraté à la chambre d'hypoxie et placez les échantillons d'essai dans la chambre afin de les exposer à des conditions hypoxiques. Les résultats obtenus montrent une létalité embryonnaire dépendante de Hi F1 en conditions d'hypoxie, basée sur l'observation de la viabilité jusqu'à l'âge adulte.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les boîtes à gants, réside dans sa facilité et son faible coût de fabrication en laboratoire, tout en permettant une concentration précise et reproductible de gaz dans la chambre environnementale. Bien que cette méthode permette d'étudier la réponse à l'hypoxie chez le nématode C. elegans, elle peut également être adaptée à d'autres systèmes, notamment des organismes modèles plus grands et des cultures cellulaires. De plus, elle peut être utilisée pour étudier d'autres gaz, tels que le dioxyde de carbone et le sulfure d'hydrogène.Ce protocole montre comment construire une chambre d'hypoxie. Le gaz est stocké dans des bouteilles de gaz comprimé ayant des concentrations d'oxygène définies, et un détendeur à deux étages est fixé. Le gaz pénètre par le bas du tube de débit et sort par le haut à un débit correct.Le gaz s'écoule ensuite dans l'ampoule à bulles, hydratant ainsi le gaz. Le gaz hydrogène passe ensuite dans la chambre d'hypoxie par la vanne d'entrée, exposant les échantillons à l'hypoxie. Enfin, le gaz est évacué dans la pièce par un orifice d'évacuation percé dans la chambre.Un cristallisoir en Pyrex ou une boîte Arrow peut servir de corps à la chambre environnementale. Le volume du récipient doit être maintenu au minimum, et le matériau doit être imperméable aux gaz. Percez un trou sur un côté du récipient à l’aide d’un foret à pointe en carbone ou en diamant, puis insérez-y un raccord conique en plastique pour tuyau. Mélangez l'époxy avant de l'appliquer sur la boîte et les raccords. Répétez ensuite la même procédure sur le côté opposé du récipient, avec le deuxième trou décalé par rapport au premier. Pour augmenter le mélange turbulent, utilisez un tube d'un huitième de pouce de diamètre extérieur, en FEP ou en nylon, pour relier les bouteilles de gaz comprimé à un dispositif de régulation de débit, tel qu'un débitmètre massique ou un rotamètre.Les réservoirs de gaz doivent contenir des concentrations d'oxygène définies, équilibrées avec de l'azote, conformes à une norme certifiée pour la teneur en oxygène ou pour des conditions anoxiques. Pour l'azote pur, utilisez un détendeur à deux étages avec le deuxième étage réglé à la pression souhaitée. Consultez les instructions du protocole écrit pour choisir un débit approprié.Ensuite, reliez le tuyau du détendeur à deux étages au tube de débit qui contrôle le débit du gaz entrant dans la chambre. Les sorties du tube de débit sont reliées à une bouteille de lavage à gaz équipée d'un cylindre fritté contenant de l'eau distillée. Puis, reliez le tuyau situé de l'autre côté de la bouteille de lavage à l'un des raccords de la chambre environnementale.Cela permettra d'hydrater le gaz entrant dans la chambre environnementale. Utilisez de la graisse à vide pour sceller la chambre. Ensuite, placez des poids sur le couvercle de la chambre afin d'assurer une étanchéité hermétique.Tester l'étanchéité en tenant une petite quantité d'eau dans la paume d'une main gantée contre le raccord d'évacuation des gaz de la chambre et en vérifiant la présence de bulles. Premièrement, générer des populations synchronisées de sea Elgan. Placer un à 100 adultes GR dans une goutte de solution d'eau de Javel alcaline à la surface d'une boîte de milieu de croissance pour nématodes non ensemencée.Laisser la solution d'eau de Javel pénétrer dans la boîte après une période d'incubation d'au moins huit heures. Transférer les larves L1 synchronisées sur une boîte ensemencée avec des bactéries OP50 vivantes. En alternative, laisser les adultes GRA pondre des œufs sur la boîte pendant deux à trois heures afin de générer un groupe de vers qui se développeront de manière synchrone, ou prélever des larves L4 à partir d'une population mixte pour recueillir des embryons jeunes.Au stade deux à quatre cellules, utilisez une lame de rasoir pour découper des adultes GR dans un petit volume d'eau, puis transférez les embryons à l'aide d'une pipette à bouche avant de placer les vers sur la boîte pour exposition à des conditions hypoxiques. Disposez un anneau de palmitate d'acide à 10 milligrammes par millilitre dans l'éthanol autour du bord des boîtes. Pour empêcher les vers de s'échapper de la surface de la boîte en gélose.L'acide palmitique va précipiter hors de la solution. Lorsque l'éthanol s'évapore, il forme une barrière physique assurant l'uniformité ; veillez donc à remplacer l'eau dans le flacon de lavage à gaz avant l'exposition dans la chambre environnementale. Après avoir transféré les vers sur les boîtes, scellez les boîtes dans la chambre environnementale, démarrez le débit de gaz et maintenez l'exposition pendant la durée souhaitée pour le dosage.Pour évaluer la viabilité des embryons jusqu'à l'âge adulte, laisser les vers se développer 48 heures après le retour à l'air ambiant, moment auquel ils devraient être des larves de quatrième stade ou des adultes d'un jour. Évaluer la viabilité jusqu'au stade adulte. Pour visualiser les vers après une exposition hypoxique, transférer les vers dans une goutte de milieu M9 sur un coverslip carré de 22 millimètres et retourner celui-ci sur un coussin de 2 % d'agarose dans le milieu M9, si nécessaire.25 millimolaire d'amol ou 10 millimolaire d'azoture de sodium peuvent être utilisés comme anesthésique. Alternativement, après exposition à l'hypoxie, la chambre environnementale transparente peut être placée directement sur la platine d'un microscope stéréoscopique. Deux vues sont montrées, dont une incluant l'ensemble du dispositif de flux gazeux.L'autre avec seulement la chambre sur la platine du microscope. Faire croître des vers Bristol N2 sur quatre plaques de culture de 10 centimètres de diamètre jusqu'à ce que la majorité des vers soient des adultes GR. Laver les vers dans un tube conique de 15 millilitres à l'aide d'une solution d'eau de Javel alcaline à 1:5 et incuber sous agitation jusqu'à ce que les vers commencent à se désagréger.Pas plus de cinq minutes. Laver les vers trois fois avec du M neuf en centrifugeant à 1 500 ×g entre chaque lavage, sans plaque de rupture. Déposer les embryons blanchis sur huit plaques NGM de 150 millimètres et laisser les embryons se développer en larves L4 pendant environ 48 heures.À 22 degrés Celsius, transférez les boîtes dans la chambre environnementale et exposez-les à des conditions hypoxiques et anoxiques pendant quatre heures ou pendant la durée spécifiée par le protocole expérimental. Pour récolter les échantillons, retirez rapidement le couvercle de la chambre hypoxique. Prélevez une boîte d'échantillons, refermez immédiatement la chambre, notez l'heure et enregistrez les étapes.Après avoir retiré les vers de l'hypoxie, ce processus complet doit prendre moins de deux minutes. Utilisez de l'eau distillée pour laver les vers sur un filtre en nylon, puis versez-les dans un tube conique de 15 millilitres étiqueté contenant 100 microlitres de SDS à 1 % et centrifugez. Les vers dans le SDS sont centrifugés dans une centrifugeuse de bureau à 1 500 × g pendant 15 à 20 secondes.Avec précaution, utiliser un aspirateur pour éliminer la majeure partie du surnageant du tube, en laissant intact le culot de vers. À l’aide d’une pipette, transférer le culot de vers avec un volume prédéterminé de liquide dans un tube microcentrifuge de 1,5 µL étiqueté. Si l’échantillon doit être utilisé pour une électrophorèse SDS-PAGE, ce tube peut contenir un volume égal de colorant de charge pour protéines à deux fois la concentration ; fermer hermétiquement le tube et l’immerger dans de l’azote liquide.Répétez jusqu'à ce que tous les échantillons aient été isolés. Suivez ces procédures pour les échantillons témoins d'air ambiant afin d'assurer la cohérence ; les échantillons peuvent être conservés à moins 20 degrés Celsius. Cette figure montre la viabilité des embryons exposés à 1000 parties par million d'oxygène, 5 000 parties par million d'oxygène et à la normoxie, environ 210 000 parties par million d'oxygène.Les embryons sont exposés à chaque condition pendant 24 heures dans des chambres à flux d'oxygène continu. Les vers ont été transférés dans des conditions normoxiques et laissés se développer jusqu'au stade adulte pendant 48 heures, puis leur viabilité à l'âge adulte a été évaluée. Après cette procédure, des échantillons peuvent être collectés pour des analyses ultérieures par Western blot, QPCR ou des tests physiologiques tels que la détermination de la durée de vie ou de la production de progéniture.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière de mettre en place une chambre d'hypoxie à flux continu dans votre propre laboratoire.

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L&#39;utilisation de la microscopie à Time Lapse Visualisez anoxie induite Suspended Animation en<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryons

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Un modèle anoxie-faim pour ischémie / reperfusion dans<em&gt; C. elegans</em

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