Création d'environnements gazeux définies pour étudier les effets de l'hypoxie sur la C. elegans

Le but de l’expérience suivante est de mettre en place et de maintenir une chambre d’hypoxie en utilisant une méthode à flux continu. Ceci est réalisé en obtenant et en fabriquant les tubes, les flacons et les chambres nécessaires à la procédure. Dans un deuxième temps, connectez le réservoir d’oxygène et sélectionnez le débit pour créer le niveau d’hypoxie souhaité.

Hydratez le gaz en le faisant passer dans une fiole à bulles remplie d’eau déminéralisée. Connectez le gaz hydraté à la chambre d’hypoxie et placez les échantillons de test dans la chambre pour les exposer à des conditions hypoxiques. On obtient des résultats qui montrent une létalité embryonnaire dépendante de Hi F1 en hypoxie sur la base de l’observation de la viabilité jusqu’à l’âge adulte.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les boîtes à gants, est qu’elle est facile et peu coûteuse à fabriquer en laboratoire et qu’elle fournit une concentration précise et reproductible des gaz dans la chambre environnementale. Bien que cette méthode donne un aperçu de la réponse hypoxique chez le nématode C elegance, elle peut également être adaptée à d’autres systèmes, y compris des organismes modèles plus grands et la culture cellulaire. De plus, il peut être utilisé pour étudier d’autres gaz, notamment le dioxyde de carbone et le sulfure d’hydrogène.

Ce protocole montre comment construire une chambre d’hypoxie. Le gaz est stocké dans des réservoirs de gaz comprimé avec des concentrations d’oxygène définies, et un régulateur à deux étages est fixé. Le gaz pénètre par le bas du tube d’écoulement et ressort par le haut au débit correct.

Le gaz s’écoule ensuite dans la fiole à bulles en hydratant le gaz. L’hydrogaz passe ensuite dans la chambre d’hypoxie au niveau de la soupape d’entrée, exposant les échantillons à l’hypoxie. Le gaz finit par s’échapper dans la pièce par un trou d’évacuation percé dans la chambre.

Un plat de cristallisation en Pyrex ou dans une boîte d’emballage en forme de flèche peut être utilisé comme corps de la chambre environnementale. Le volume du récipient doit être réduit au minimum et le matériau doit être imperméable aux gaz. Percez un trou sur un côté du récipient à l’aide d’une pointe en carbone ou en diamant, percez et ajustez-le avec un raccord cannelé en plastique.

Mélangez l’époxy avant l’application sur la boîte et le montage. Répétez ensuite la même procédure sur le côté opposé du récipient avec le deuxième trou décalé par rapport au premier. Pour augmenter le mélange turbulent, utilisez un tube d’un diamètre extérieur d’un huitième de pouce, en FEP ou en nylon pour connecter les réservoirs de gaz comprimé à un dispositif de contrôle de débit, tel qu’un régulateur de débit massique ou un compteur à rotor

Les réservoirs de gaz doivent avoir des concentrations d’oxygène définies équilibrées avec de l’azote qui constituent une norme certifiée pour la teneur en oxygène ou pour les conditions anoxiques. L’azote pur utilise un régulateur à deux étages avec le deuxième étage réglé à la pression souhaitée. Voir les instructions dans le protocole écrit pour sélectionner un débit approprié.

Connectez ensuite le tube du régulateur à deux étages au tube d’écoulement qui contrôle le débit de gaz entrant dans la chambre. Les sorties du tube d’écoulement sont reliées à une bouteille de lavage de gaz avec cylindre fritté contenant de l’eau distillée. Connectez ensuite le tube de l’autre côté de la bouteille de lavage à l’un des raccords de la chambre environnementale.

Cela hydratera le gaz entrant dans la chambre environnementale. Utilisez de la graisse sous vide pour sceller la chambre. Placez ensuite des poids sur le couvercle de la chambre pour assurer une étanchéité à l’air.

Testez l’étanchéité en tenant une petite quantité d’eau dans la paume d’une main gantée sur le raccord d’évacuation des gaz sur la chambre et en vérifiant s’il y a des bulles. Tout d’abord, générer des populations synchronisées d’Elgan de mer. Placez un à 100 GR adultes dans une goutte de solution d’eau de Javel alcaline à la surface d’une plaque de milieu de croissance de nématodes non ensemencée.

Laissez la solution d’eau de Javel être absorbée dans la plaque après une période d’incubation d’au moins huit heures. Transférez les larves synchronisées de L one dans des assiettes ensemencées avec des bactéries OP 50 vivantes. Vous pouvez également laisser les adultes de la GRA pondre des œufs sur la plaque pendant deux à trois heures pour générer un groupe de vers qui se développeront de manière synchrone ou choisir les larves L quatre d’une population mixte pour recueillir de jeunes embryons.

Au stade de deux à quatre cellules, utilisez une lame de rasoir pour hacher les adultes GR dans un petit volume d’eau, puis transférez les embryons à l’aide d’une pipette buccale avant de transférer les vers sur la plaque pour les exposer à des conditions hypoxiques. Placez un anneau de 10 milligrammes par millilitre d’acide palmitique dans de l’éthanol sur le bord des plaques. Pour éviter que les vers ne s’échappent de la surface de la plaque de gélose.

L’acide palmitique sortira de la solution. Au fur et à mesure que l’éthanol s’évapore en formant une barrière physique pour assurer l’uniformité, assurez-vous de remplacer l’eau dans la bouteille de lavage de gaz avant l’exposition dans la chambre environnementale. Après avoir transféré les vers sur les plaques, scellez les plaques dans la chambre environnementale, lancez le flux de gaz et maintenez l’exposition pendant le temps souhaité pour le dosage.

Pour la viabilité des embryons jusqu’à l’âge adulte, laissez les vers se développer 48 heures après le retour à l’air ambiant, moment auquel ils devraient être. Les larves du quatrième stade ou les adultes d’un jour obtiennent des résultats pour leur viabilité jusqu’à l’âge adulte. Pour visualiser l’exposition hypoxique des vers, transférez les vers dans une goutte de M neuf sur une lamelle carrée de 22 millimètres et renversez sur un tampon de 2 % aros dans M neuf si nécessaire.

25 millimolaires d’AMOL ou 10 millimolaires d’azoture de sodium peuvent être utilisés comme anesthésique. Alternativement, après l’exposition à l’hypoxie, la chambre environnementale transparente peut être placée directement sur la platine d’une lunette de dissection. Deux vues sont présentées, l’une, comprenant l’ensemble de la configuration du flux de gaz.

L’autre avec juste la chambre sur la platine du microscope. Cultivez Bristol N deux vers sur quatre plaques de croissance de 10 centimètres de haut jusqu’à ce que la majorité des vers soient des adultes GR. Lavez les vers dans un tube conique de 15 millilitres avec une solution d’eau de Javel alcaline d’un à cinq litres et incubez à rotation jusqu’à ce que les vers commencent à se dissoudre.

Pas plus de cinq minutes. Lavez les vers trois fois avec M neuf en tournant à 1 500 fois G entre chaque lavage sans casser la plaque. Les embryons blanchis sur 8 plaques NGM de 150 millimètres permettent aux embryons de se développer en larves L quatre pendant environ 48 heures.

À 22 degrés Celsius, déplacer les plaques dans la chambre environnementale et les exposer à des conditions hypoxiques et anoxiques pendant quatre heures ou pendant la durée spécifiée dans le plan expérimental. Pour prélever des échantillons, retirez rapidement le couvercle dans la chambre hypoxique. Prenez une plaque d’échantillon et refermez le temps de la chambre et notez les étapes.

Après avoir retiré les vers de l’hypoxie, l’ensemble de ce processus devrait prendre moins de deux minutes. Utilisez de l’eau distillée pour laver les vers sur un filtre en nylon, puis versez-les dans un tube conique étiqueté de 15 millilitres contenant 100 microlitres de centrifugeuse à 1 % de SDS. Les vers dans le SDS d’une centrifugeuse de bureau sont 1 500 fois G pendant 15 à 20 secondes.

Avec la pause, utilisez un aspirateur pour retirer la majeure partie du supinate du tube, en laissant la pastille de ver intacte. À l’aide d’une pipette, transférez la pastille de ver avec un volume de liquide prédéterminé dans un tube à déchets étiqueté de 1,5 micro. Si l’échantillon doit être utilisé pour la page SDS, ce tube peut contenir un volume égal de deux fois le colorant de charge de protéines, sceller le tube et l’immerger dans de l’azote liquide.

Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les échantillons aient été isolés. Suivez ces procédures pour les échantillons de contrôle de l’air de la maison pour la cohérence, les échantillons peuvent être conservés à moins 20 degrés Celsius. Ce chiffre montre la viabilité des embryons exposés à 1000 parties par million d’oxygène, 5 000 parties par million d’oxygène et la normoxie autour de 210 000 parties par million d’oxygène.

Les embryons sont exposés à chaque condition pendant 24 heures dans des chambres à oxygène à flux continu. Les vers ont été déplacés dans des conditions normoxiques, on leur a permis de se développer jusqu’à l’âge adulte pendant 48 heures, puis on les a évalués en fonction de leur viabilité jusqu’à l’âge adulte. À la suite de cette procédure, des échantillons peuvent être prélevés pour une analyse ultérieure par transfert Western QPCR ou des tests physiologiques tels que la durée de vie ou la production de descendance.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon de configurer une chambre d’hypoxie à flux continu dans votre propre laboratoire.