L'analyse in vitro de PDZ-dépendants complexes macromoléculaires CFTR de signalisation

L'objectif général de cette procédure est de reconstituer in vitro un complexe macromoléculaire de signalisation dépendant d'un domaine PDZ de la régulation de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique, ou CFTR. Pour ce faire, des protéines de fusion recombinantes marquées sont exprimées dans des bactéries et purifiées. Ensuite, des lysats cellulaires sont obtenus à partir de cultures exprimant CFTR ou des protéines interagissant avec CFTR.

Ensuite, le CFTR et les protéines de liaison sont combinés in vitro afin d'assembler le complexe macromoléculaire de signalisation contenant le CFTR. Une immunotransfert est ensuite réalisée, ce qui démontre la formation de complexes macromoléculaires de CFTR, puis évaluée par immunotransfert. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que nous pouvons détecter directement et visualiser la formation d'un complexe macromoléculaire individuel riche en protéines contenant le CFTR.

Ainsi, cette méthode peut fournir des informations sur la formation du complexe macromoléculaire contenant le CT R. Elle peut également être appliquée à l'assemblage de complexes non protéiques n'impliquant pas le CFTR, tels que le complexe de signalisation macromoléculaire sex C deux. Très récemment, en utilisant cette même méthode, nous avons démontré que notre chémorécepteur CXCR deux formait physiquement un complexe protéique avec l'effecteur en aval.

PRC bêta trois médie le nerf sauvage un dans les neutrophiles en utilisant la PCR. Amplifiez l'ADN qui code pour les 50 à 100 derniers acides aminés contenant les motifs PDZ au niveau du terminus C. Pour le transporteur CAMP, MRP quatre et le domaine PDZ un du facteur régulateur de l'échangeur sodium-hydrogène ou N-H-E-R-F.

Ensuite, cloner les quatre produits de PCR RP dans PGE X quatre T un afin de générer des protéines de fusion GST, et le domaine PDZ un de N-H-E-R-F dans PET 30. Pour produire des protéines de fusion hiss s, transformer les bactéries par choc thermique. Dans un milieu SOC, en utilisant une souche de e coli déficiente en protéase, faire croître la culture toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur agité contenant 50 millilitres de milieu LB additionné des antibiotiques appropriés pour le vecteur.

Le lendemain, diluez la culture d’un facteur de 1 à 10 dans 500 millilitres de milieu Luria-Bertani, puis incubez de nouveau la culture sous agitation à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Induisez la transcription de la protéine recombinante avec 0,5 à 1 millimolaire d’IPTG pendant quatre heures à 30 degrés Celsius.

Après l'incubation, transférez les cultures dans des tubes de centrifugation de 250 millilitres et récupérez les cellules par centrifugation à 8 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, jetez le surnageant et ajoutez 20 millilitres de tampon au saccharose contenant de la lysozyme. Ajoutez 1 milligramme par millilitre de 0,2 % de Triton X-100 et des inhibiteurs de protéases pour lyser les cellules, puis transférez la suspension bactérienne dans un tube de centrifugation propre de 50 millilitres.

Mélanger sur un agitateur rotatif pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifuger à 20 000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, le surnageant sera clair et un culot insoluble apparaîtra au fond du tube.

Prélevez le surnageant clair dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ensuite, ajoutez un millilitre de la résine appropriée au surnageant. Les billes aéroportées sont suspendues sous forme de suspension à 50 % dans un tampon de sucrose contenant du glutathion.

Les billes aéro doivent être utilisées pour les protéines de fusion GST et les billes talon pour les protéines de fusion hiss S. Mélanger pendant quatre heures à quatre degrés Celsius sur un agitateur rotatif. Ensuite, centrifuger les billes à 800 ×g pendant deux minutes.

Ensuite, lavez-les par resuspension en les suspendant dans 15 millilitres de PBS et mélangez-les sur un agitateur rotatif pendant deux minutes. Enfin, éliminez le surnageant. Répétez l'étape six fois après le sixième lavage.

Pour éluer la protéine des billes, ajouter deux millilitres du tampon d'élution approprié pour chaque millilitre de billes et mélanger pendant 10 minutes à température ambiante. Verser l'ensemble de la protéine éluite avec les billes dans une colonne et recueillir l'écoulement en sortie comme protéine éluite. Ensuite, transférer la protéine UD dans un tube de dialyse.

Dialysez les protéines éluées contre deux litres de PBS en agitant à quatre degrés Celsius. Renouvelez le PBS toutes les quatre heures pendant quatre fois après la dialyse. Concentrez la protéine à 0,5 à un millilitre.

À l'aide d'un filtre à centrifugation avec une coupure de 10 000 mégadaltons, aliquoter l'échantillon en portions de 200 microlitres chacune. Conserver l'une d'elles pour analyse et placer les autres à moins 80 degrés Celsius pour stockage.

Déterminez la concentration en protéines par la méthode de Bradford. Évaluez la qualité des protéines par électrophorèse SDS-PAGE en utilisant des standards de BSAS. Si l'intégrité de la protéine n'est pas satisfaisante, des procédures de purification secondaires telles que la filtration sur gel ou l'échange d'ions peuvent être utilisées.

Les cellules HEK 293 exprimant le CFTR sauvage marqué par un flag devraient être cultivées comme décrit dans le document accompagnant. Retirez le milieu des cellules et rincez avec du PBS. Ensuite, pour lyser les cellules, ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse par boîte de culture de 60 millimètres et agitez doucement les lysats cellulaires pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

Transférez les lysats dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuse. Ensuite, pour éliminer les protéines insolubles, centrifugez à 16 000 ×g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et récupérez les surnageants. Déterminez la concentration en protéines par le dosage de Bradford afin d'assembler in vitro les complexes macromoléculaires contenant la CFTR.

Commencez par combiner 20 microgrammes de la protéine de fusion purifiée G-S-T-M-R-P quatre, contenant les 50 acides aminés C-terminaux, et des quantités croissantes allant de zéro à 40 microgrammes de la protéine de fusion purifiée hiss S PD zk un, dans 200 microlitres de tampon de lyse, dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Mélangez les deux protéines sur un agitateur rotatif à 22 degrés Celsius pendant une à deux heures. Ensuite, ajoutez 20 microlitres d'une suspension à 50 % de billes de glutathion au mélange protéique et continuez à mélanger pendant une heure supplémentaire.

Cette étape est également appelée liaison par paire, au cours de laquelle le G-S-T-M-R-P quatre CT 50 se lie à SPD zk un. Pendant ce temps, préparez les lysats de cellules HEK 2 93 surexprimant le CFTR de type sauvage marqué par un drapeau (flag), comme décrit dans la section précédente de la vidéo, après l'étape de liaison par paire. Lavez le complexe deux fois avec du tampon de lyse span à 800 ×g pendant une minute pour chaque lavage, puis aspirez soigneusement le surnageant après chaque lavage.

Prenez garde de ne pas aspirer les billes du fond. Ajoutez les lysats de cellules HT K 2 93 aux billes et mélangez délicatement sur un mélangeur rotatif à quatre degrés Celsius pendant trois heures ou toute la nuit après l'incubation. Lavez les billes trois fois avec du tampon de lyse, en effectuant une centrifugation après chaque lavage comme précédemment, après le dernier lavage.

Pour éluer les protéines, ajouter 30 microlitres de tampon d'échantillonnage 5 x et incuber au bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, centrifuger à 5 000 ×g pendant une minute afin de précipiter les billes. Puis, charger tout l'éluat sur un gel SDS-PAGE de 4 à 15 % et faire migrer à 200 volts jusqu'à l'extrémité du gel. Transférer ensuite les bandes protéiques sur une membrane PVDF pendant 1,5 heure à 60 volts à l'aide d'un appareil de transfert BioRad.

Une fois le transfert terminé, bloquez la membrane dans du TBS tween contenant 5 % de lait écrémé pendant une heure. Poursuivez par le western blot selon les instructions décrites dans le document accompagnant afin de visualiser les protéines interagissant avec la CFTR. Le complexe macromoléculaire de signalisation contenant la C-F-T-R a été assemblé in vitro selon la méthode décrite dans cette vidéo, comme illustré dans cette représentation schématique.

Un complexe macromoléculaire s'est formé entre les 50 acides aminés de l'extrémité C-terminale de Mr.RRP quatre PD zk un et la protéine CFTR complète afin de déterminer la dépendance en dose de la formation de ce complexe macromoléculaire. Des quantités croissantes de la protéine intermédiaire PD ZK un ont été ajoutées, comme indiqué ici. Le complexe a augmenté de manière dépendante de la dose, suggérant que la protéine intermédiaire PD ZK un médiait l'interaction entre CCF TR et Mr.Rrp quatre.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de ne pas faire bouillir les échantillons du complexe micro-moléculaire contenant le FTR préparés pour le western blot, car l'agrégation du FTR est un problème courant. Au lieu de cela, les échantillons doivent être chauffés à 37 degrés pendant 10 à 15 minutes avant d'être chargés sur le gel, selon cette procédure. D'autres méthodes, comme la co-précipitation, peuvent être réalisées afin d'évaluer les complexes endogènes de CFTR dans des cellules telles que les cellules des voies respiratoires, les cellules épithéliales et les cellules épithéliales intestinales.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment assembler in vitro un complexe de signalisation macromoléculaire dépendant de la PTC et de la CFDR.