Name: Échantillonnage humaines Peptidome salive autochtones laide dune sonde dultrafiltration Lollipop-Like: Simplifier et améliorer la détection des peptides pour spectrométrie de masse clinique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Découvrez l'échantillonnage du peptidome salivaire humain à l'aide d'une sonde d'ultrafiltration en forme de sucette (LLUF) pour la spectrométrie de masse NanoLC-LTQ. Cette méthode simplifie la détection des peptides à faible abondance sans digestion protéique.

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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous avons constaté que de nombreux fragments peptidiques existent dans la salive humaine non digérée. Ces fragments peptidiques sont des dérivés de diverses formes de protéines riches en proline, l&#39;actine, alpha amylase, globine alpha 1, bêta globine, histain 1, la kératine 1, la mucine 7, récepteur d&#39;immunoglobuline polymérique, satherin, S100A9. Il pourrait y avoir de nombreux facteurs qui contribuent à la production de peptides avec des sites de clivage indéterminées. Par exemple, certains fragments peptidiq...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Membranes en polyéthersulfone </td><td> Pall Corporation </td><td></td><td> 30 kDa MWCO </td></tr><tr><td> Tube Téflon éthylène-propylène fluoré </td><td> Upchurch Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bleu dextran </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nano LC système </td><td> Eksigent </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Colonne C18 piège </td><td> Agilent </td><td> 5065-9913 </td><td></td></tr><tr><td> Spectromètre de masse LTQ linéaire ions piège </td><td> Thermo Fisher </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sorcerer 2 </td><td> Sage-N Research </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Acétonitrile 0,1% d&#39;acide formique </td><td> JT Baker </td><td> 9832-03 </td><td> LC / MS de qualité </td></tr><tr><td> De l&#39;eau-de 0,1% d&#39;acide formique </td><td> JT Baker </td><td> 9834-03 </td><td> LC / MS de qualité </td></tr></tbody></table>

Échantillonnage humaines peptidome salive autochtones l&#39;aide d&#39;une sonde d&#39;ultrafiltration lollipop-like: simplifier et améliorer la détection des peptides pour spectrométrie de masse clinique

Sampling Human Indigenous Saliva Peptidome Using a Lollipop-Like Ultrafiltration Probe: Simplify and Enhance Peptide Detection for Clinical Mass Spectrometry

Bien que la salive humaine protéome et peptidome ont été révélés 1-2 ils ont été identifiés à partir de majorly digestion trypsique de protéines de la salive. Identification des peptidome indigène de la salive humaine sans digestion préalable avec des enzymes exogènes devient impératif, puisque peptides natifs dans la salive humaine fournir des valeurs possibles pour le diagnostic de la maladie, prédire l&#39;évolution de la maladie, et le suivi de l&#39;efficacité thérapeutique. D&#39;échantillonnage approprié est une étape critique pour l&#39;amélioration de l&#39;identification de la salive humaine peptidome indigène. Les méthodes traditionnelles d&#39;échantillonnage salive humaine impliquant centrifugation pour éliminer les débris 3-4 peut-être trop de temps pour être applicable pour une utilisation clinique. En outre, l&#39;enlèvement des débris par centrifugation peut être incapable de nettoyer la plupart des agents pathogènes infectées et éliminer les protéines d&#39;abondance élevés qui entravent souvent l&#39;identification des peptidome faible abondance. Les approches conventionnelles protéomiques qui pritiellement utiliser électrophorèse sur gel bidimensionnelle (2-DE) des gels de conjugaison avec la digestion dans le gel sont capables d&#39;identifier plusieurs protéines salivaires 5-6. Cependant, cette approche n&#39;est généralement pas suffisamment sensibles pour détecter des peptides ou protéines de faible abondance. Chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) à base de protéomique est une alternative qui permet d&#39;identifier des protéines sans l&#39;accord préalable 2-DE séparation. Bien que cette approche offre une plus grande sensibilité, il a généralement besoin d&#39;échantillon avant de pré-fractionnement 7 et pré-digestion avec la trypsine, ce qui rend difficile pour un usage clinique. Pour contourner l&#39;obstacle en spectrométrie de masse en raison de la préparation des échantillons, nous avons développé une technique appelée ultrafiltration capillaire (CUF) sondes 8-11. Les données de notre laboratoire ont démontré que les sondes du CUF sont capables de capturer des protéines in vivo à partir des micro-environnements différents chez les animaux d&#39;une manière dynamique et minimalement invasive 8 -11. Pas de centrifugation est nécessaire, car une pression négative est créée par un simple retrait de la seringue lors de la collecte de l&#39;échantillon. Les sondes du CUF combinés avec LC-MS ont réussi à identifier des protéines tryptique-digérés 8-11. Dans cette étude, nous avons amélioré la technique d&#39;échantillonnage d&#39;ultrafiltration en créant une sucette en forme de l&#39;ultrafiltration (LLUF) sonde qui peut facilement se glisser dans la cavité buccale humaine. L&#39;analyse directe par LC-MS, sans digestion par la trypsine ont montré que la salive humaine contient localement des fragments peptidiques de nombreux dérivés de protéines différentes. L&#39;échantillonnage de salive avec des sondes LLUF éviter une centrifugation mais efficacement éliminé de nombreuses protéines abondance grandes et hautes. Nos résultats de spectrométrie de masse a démontré que de nombreux peptides de faible abondance est devenue détectable après filtrage des plus grosses protéines avec des sondes LLUF. Détection des peptides de faible abondance de salive était indépendante de la séparation des échantillons en plusieurs étapes avec la chromatographie. Pour l&#39;application clinique, les sondes LLUF incorporerd avec LC-MS pourrait être utilisé à l&#39;avenir pour surveiller la progression de la maladie de la salive.

Considérant la salive d&#39;échantillonnage pour l&#39;application clinique future, une sucette en forme de l&#39;ultrafiltration (LLUF) sonde a été fabriquée pour s&#39;adapter à la cavité buccale humaine. Une analyse directe de la salive non digérés par NanoLC-spectrométrie de masse LTQ a démontré la capacité de sondes LLUF pour éliminer les protéines et les protéines de grandes abondance élevés, et de faire peu abondantes peptides plus détectable.

Échantillonnage humaines Peptidome salive autochtones l&#39;aide d&#39;une sonde d&#39;ultrafiltration Lollipop-Like: Simplifier et améliorer la détection des peptides pour spectrométrie de masse clinique

Bien que le protéome et le peptidome de la salive humaine aient été révélés 1-2, ils ont été principalement identifiés à partir de digestions tryptiques de protéines salivaires. L'identification...

Cette étude du peptidome de la salive utilise une sonde de filtration ultrafinescente en forme de sucette, suivie d'une analyse directe par spectrométrie de masse nano LC LTQ. Tout d'abord, assemblez la sonde LLUF en utilisant une membrane de téléphone cellulaire en polyéther et un tube en éthylène-propylène. Ensuite, recueillez des échantillons de salive auprès de volontaires et traitez-les à l’aide de la sonde LLUF afin de prélever la salive.Ensuite, passez directement à la spectrométrie de masse nano LC-LTQ et analysez les données provenant d'échantillons de salive avec et sans traitement par la sonde LLUF. En définitive, le peptidome salivaire peut être obtenu en analysant les données LC-MS-MS et en comparant les peptides identifiés entre les deux échantillons. Cette approche, qui utilise une sonde de filtration ultrafine en forme de sucette couplée à une analyse directe par spectrométrie de masse nano LC-LTQ, présente des avantages clés par rapport à d'autres méthodes, telles que la digestion des protéines salivaires en peptides.Suivi d'une analyse par spectrométrie de masse, le LUF PRO simplifie et purifie la salive et améliore également la dictée MS des peptides dans la salive entière à des fins cliniques. Utilisez de la colle époxy pour sceller les membranes en polyéther de téléphone portable sur les bords des palettes triangulaires en polypropylène. Ensuite, fixez un tube en téflon fluoré à l'éthylène propylène à la sortie cylindrique d'un triangle.Stérilisez les sondes en polypropylène avec de l'alcool à 70 % pendant la nuit pour évaluer l'étanchéité adéquate, puis immergez les sondes LLUF dans une solution de dextran bleu à 50 milligrammes par millilitre pendant deux heures. Confirmez l'absence de dextran bleu dans les échantillons recueillis.Recrutez des volontaires sains âgés de 20 à 40 ans. Après un rinçage buccal à l’eau, demandez au sujet d’expectorer des échantillons de salive totale dans un récipient refroidi par de la glace. Rassemblez tous les échantillons et conservez-les sur de la glace.Immédiatement après le prélèvement, se rendre dans une pièce à quatre degrés Celsius avec 200 microlitres de salive pour l'échantillonnage à l'aide de sondes LLUF. Imprégner ensuite la membrane en polyéther d'un téléphone cellulaire de salive humaine dans une boîte de culture. Créer une pression négative en tirant sur une seringue afin de simuler un processus d'ultrafiltration pour le prélèvement à partir de la salive.Ensuite, déterminez les concentrations en protéines. Préparez un microgramme par microlitre des échantillons protéiques de salive pour l'analyse par spectrométrie de masse en nano LC. Pour l'analyse des échantillons, nous utilisons une nano LC Exigent couplée en ligne à un spectromètre de masse Finnegan LTQ. Chargez d'abord cinq microlitres des échantillons de salive non digérés sur la colonne de piégeage du système de nano LC à l'aide du système d'échantillonnage automatique.Après une étape de lavage, actionnez le commutateur et appliquez un gradient linéaire de 0 à 50 % de tampon B vers le piège et la colonne de séparation C 18. En utilisant le mode dépendant des données d'Excalibur, recueillez les spectres ms ms des quatre ions MS les plus intenses présentant une intensité supérieure à 1 × 10⁴. Pour chaque échantillon, effectuez des analyses en double de trois préparations distinctes différentes.Ensuite, importez le fichier de données dans le système Sequester Sorcerer Two et sélectionnez une recherche contre une base de données protéique humaine appropriée de NCBI en utilisant une spécificité non enzymatique. Après la recherche Sequester, les résultats sont automatiquement filtrés, validés et affichés dans Peptide Prophet et Protein Prophet selon les résultats de Sequester. Peptide Prophet estime une probabilité complète, le score P, indiquant que l'attribution d'un peptide est correcte ou incorrecte, et identifie également des informations supplémentaires sur chaque séquence peptidique.Le profit protéique calcule un score de probabilité allant de zéro à un pour chaque protéine en se basant sur les peptides attribués aux spectres Ms.Ms. Cette section détermine la capacité des sondes LLUF à éliminer les bactéries orales pour la culture de détection bactérienne, en prélevant des échantillons de salive avant et après la collecte avec les sondes LLUF sur des géloses en spirale pour un test de bactéries aérobies. Utilisez des géloses LB en spirale sans antibiotique à 37 degrés Celsius pendant un jour et, pour les bactéries anaérobies, utilisez un système de génération de gaz pour la culture.L'échantillonnage sur bouillon BRU, plages hélicoïdales en conditions anaérobies à 37 degrés Celsius pendant un jour. La fabrication de sucettes, comme les dispositifs de filtration ultrafine, facilite l'échantillonnage de la salive dans un environnement oral imité. Dans ce système, une membrane de téléphone cellulaire en polyéther chargée négativement, avec une coupure de poids moléculaire à 30 kilodaltons, est collée sur une palette en polypropylène et positionnée devant la sonde LLUF pour éliminer les protéines plus grandes présentes dans la salive.Afin de simuler l'environnement buccal humain, une éponge est imprégnée de salive à l'aide d'une seringue. La salive est filtrée et recueillie par le tube connecté. La comparaison des chromatogrammes CL de la salive avant et après l'échantillonnage par LLUF a permis l'identification de peptides salivaires indigènes par spectrométrie de masse nano LC-MS-MS.Étant donné que ces chromatogrammes différentiels sont obtenus sans digestion chimique ou enzymatique, ils simplifient la préparation des échantillons à des fins cliniques. Dans cet échantillon. Après l'élucidation par LLUF des différentes compositions protéiques, 131 peptides ont été identifiés dans la salive non digérée.Ces peptides sont des fragments dérivés de diverses protéines riches en proline. Actin, alpha amylase, alpha one globin, beta globin, his sustain one, kératine, une mucine, le récepteur polymérique d'immunoglobuline, la sérine et S 100. A 9 26 peptides uniques identifiés dans la salive après filtration avec des sondes LLUF sont principalement des fragments dérivés de diverses protéines riches en proline.Ce peptide dérivé de l'amylase alpha a été détecté exclusivement dans un échantillon de salive non collecté à l'aide de sondes LLUF, illustrant la capacité des sondes LLUF à éliminer les protéines de grande taille. Le plus intrigant étant qu'après élimination des protéines de plus grande taille, plusieurs peptides séquencés étaient détectables dans la salive prélevée avec les sondes LLUF, notamment des peptides présentant des extrémités C riches en proline qui ont été identifiés dans les échantillons après filtration ultra-rapide à l'aide de sondes LLUF. Vous devriez maintenant bien comprendre comment utiliser A-L-L-L-L-U-F PRO pour la salive simple en vue d'une analyse de masse.Une analyse plus rigoureuse est très importante pour collecter la salive de manière simple et dans des conditions constantes. Une fois maîtrisée, je crois que cette technique peut être correctement réalisée en moins de trois heures. Cette méthode, utilisant une sonde de filtration ultrafine semblable à un sucette, couplée à une analyse en chaîne spectrale directe par nano-LC-MS/MS, facilite les applications cliniques des biomarqueurs dans le diagnostic des maladies humaines.

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Échantillonnage humaines Peptidome salive autochtones laide dune sonde dultrafiltration Lollipop-Like: Simplifier et améliorer la détection des peptides pour spectrométrie de masse clinique (Vidéo) | JoVE Journal

Échantillonnage humaines Peptidome salive autochtones l'aide d'une sonde d'ultrafiltration Lollipop-Like: Simplifier et améliorer la détection des peptides pour spectrométrie de masse clinique

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