Name: Purification de vacuoles agent pathogène à partir Legionella Infectées par les phagocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Apprenez à purifier les vacuoles contenant Legionella à partir de phagocytes infectés par homogénéisation, séparation immuno-magnétique et centrifugation en gradient de densité. Cette méthode améliore la pureté pour étudier les mécanismes pathogènes.

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Recherche dans notre laboratoire a été soutenu par l&#39;Institut Max von Pettenkofer, Ludwig-Maximilians-Universität de Munich, de la recherche allemande (DFG, HI 1511/3-1) et le Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) «Génomique des infections médicales&quot; initiative ( 0315834C).

1. Préparatifs pour l&#39;isolement LCV <ol><li> Streak à Legionella pneumophila produire DsRed-Express 13,14 à partir de stocks de glycérol sur gélose CYE avec 5 pg / ml de chloramphenicol (Cam) quatre jours avant l&#39;isolement LCV. Incuber les bactéries à 37 ° C. </li><li> Semences à 1 x 10 7 D. discoideum produire GFP-calnexine ou RAW264.7 macrophages murins dans 75 cm de culture tissulaire 2 flacons une infection jour avant. Utilisez 10 ml HL5 moyenne avec 20 pg / ml G418 pour D. discoideum et incuber les amibes à 23 ° C. Pour utiliser les macrophages RAW264.7 10 ml du milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de FCS (inactivé par la chaleur) et de la glutamine à 1%, et la croissance des cellules à 37 ° C et 5% de CO 2. Utilisez au moins trois 75 cm 2 flacons par l&#39;infection et l&#39;échantillon (minimum 6 x 10 7 cellules). </li><li> Inoculer une culture de nuit avec L. pneumophila de la plaque de CYE. Prenez un tube à essai 15 ml avec 3 ml AYE moyenneset 5 pg / ml de came. Inoculer avec 100 ul d&#39;une suspension bactérienne pour obtenir une 600nm OD de 0,1. Incuber la culture de la nuit sur une roue de rotation tête à 37 ° C pendant 21-22 h. </li></ol> 2. LCV isolement <ol><li> Changer le support de D. cellules discoideum pour enlever l&#39;antibiotique, ce qui nuirait à la suite d&#39;une infection. </li><li> Mesurer la DO de la culture de la nuit. Bactéries devrait avoir atteint leur infectivité pic à 600 nm une densité optique de ≥ 3, qui correspond à 2 x 10 9 bactéries par ml. </li><li> Infecter les cellules en ajoutant environ 500 pi de la L. pneumophila culture d&#39;une nuit aux cellules en croissance dans 10 ml HL5 moyennes (D. discoideum) ou 10 ml de RPMI 1640 (macrophages). Cela correspond à une multiplicité d&#39;infection (MOI) de 50. Par la suite, l&#39;infection est synchronisé par centrifugation des bactéries sur les cellules à 500 g pendant 10 min. La centrifugation est suiviepar une incubation de la D. discoideum cellules à 25 ° C et les macrophages RAW264.7 à 37 ° C et 5% de CO 2, respectivement. L&#39;infection de temps une h comprend l&#39;étape de centrifugation. </li><li> Après l&#39;infection éliminer le milieu et laver les cellules une fois pour éliminer les bactéries extracellulaires. Utiliser le tampon Sorc glacée pour D. discoideum et PBS glacé pour RAW264.7 macrophages. Ajouter 3 ml de tampon HS, complétées par des inhibiteurs de la protéase (Roche) dans chaque flacon et de recueillir les cellules en utilisant un grattoir à cellules. Piscine des échantillons correspondants dans un tube à essai de 15 ml. </li><li> Pour homogénéisation de l&#39;échantillon de 3 mL en plastique des seringues Luer-Lock et la bille en acier inoxydable homogénéisateur. Assurez-vous que vous travaillez sur de la glace. Avant de commencer, lavez l&#39;homogénéisateur à billes avec de l&#39;eau distillée, afin d&#39;éviter toute contamination du détergent et rincez avec de la glace HS tampon froid pour se débarrasser des bulles d&#39;air. Utilisez la boule de 8 um de dédouanement. </li><li> Remplissez le premier 3 mL dans le und seringue de le monter sur ee homogénéisateur. Appuyez sur l&#39;échantillon avant et en arrière neuf fois à travers l&#39;homogénéisateur. Échanger les seringues après pour éviter toute contamination avec du matériel non-homogénéisé. Recueillir et mettre en commun l&#39;échantillon homogénéisé dans un tube à essai de 15 ml et de prendre un échantillon de 150 microlitres par analyse microscopique. Avant de procéder à un échantillon différent démontons et laver l&#39;homogénéisateur à billes. </li><li> Bloquer l&#39;homogénat avec 2% de CS ou FCS pendant 30 min sur un agitateur de la glace ou sur une roue de tête de filage (10-20 min) à 4 ° C. </li><li> Après le blocage d&#39;utiliser un anticorps purifiés par affinité primaire contre SIDC (dilution 1:3000) ou contre tout autre marqueur bactérienne exclusivement la liaison à la membrane LCV. Vortex la solution d&#39;anticorps avant de l&#39;ajouter à l&#39;homogénat. Incuber l&#39;échantillon pendant 1 heure sur un agitateur de la glace ou sur une roue de tête de filage (10-20 min) à 4 ° C. </li><li> Dans le même temps, préparer le gradient Histodenz. Utilisation d&#39;un tube à essai de 15 ml par gradient et trois 75 cm 2 flacons d&#39;un échantillon. Sapiner, ajouter 5,75 ml de Histodenz 35% sur le tube, et le second, ajouter prudemment 5,75 ml de solution Histodenz 10% sur le dessus. Ensuite posez avec soin les tubes horizontalement pendant 1 heure. </li><li> Après une incubation de l&#39;homogénat avec le réactif de blocage et de l&#39;anticorps primaire, centrifuger à 600 xg pendant 15 min à 4 ° C pour obtenir un culot de l&#39;échantillon. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1,5 ml de tampon HS. Transférer les échantillons dans un nouveau tube de 15 ml de test et de prendre un échantillon de 40 ul pour une analyse microscopique plus tard. </li><li> Incuber le culot avec l&#39;anticorps secondaire - MACS de chèvre anti-IgG de lapin microbilles (dilution 1:25) - pour 30 min sur un agitateur à 4 ° C. Dans le même temps, mettre les colonnes sur le support magnétique MACS et les équilibrer avec 0,5 mL de tampon HS. </li><li> Ensuite, appliquer les échantillons à la colonne. Recueillir 150 pi de l&#39;écoulement continu pour l&#39;analyse microscopique ultérieure. Laver la colonne trois fois avec 0,5 mL de tampon HS. </li><li> Supprimez les colonnes de til l&#39;aimant et les véhicules utilitaires légers avec éluat de 0,5 mL de tampon par HS immédiate gicler. Prenez un échantillon de 20 ul pour l&#39;analyse microscopique. L&#39;étape de purification par immuno-séparation magnétique est prévu de céder pour 1 × 10 7 infectées D. cellules discoideum environ 1 × 10 6 véhicules utilitaires légers, qui sont intactes environ sept fois enrichis dans l&#39;éluat par rapport à la 13 accréditives. </li><li> Placer les tubes de gradient Histodenz revenir à une position verticale et soigneuse au chargement de l&#39;éluat sur le dessus. Centrifuger les tubes à 3350 × g pendant 1 h à 4 ° C. </li><li> Après centrifugation prendre fractions de 1,5 mL à partir du bas du tube à essai en utilisant une longue pipette Pasteur en verre. Recueillir total huit fractions, chacune de la partie inférieure du tube. Pas de calques visibles sont observées dans le gradient continu Histodenz. Le rendement le plus élevé de véhicules utilitaires est généralement prévu dans la fraction 4 à un ratio de ~ 2 × 10 5 véhicules utilitaires intactes par 1 × 10 7 àinfectés amibes 13. Des quantités mineures de véhicules utilitaires sont également présents dans les fractions 3 et 5, respectivement. Ainsi, le rendement global de véhicules utilitaires légers purifiés est d&#39;environ 1 × 10 6 véhicules utilitaires intactes par 6 × 10 7 infectées D. cellules discoideum 13. La récupération de véhicules utilitaires peuvent être réalisées à température ambiante (RT), et les véhicules utilitaires semblent stables pendant plusieurs heures. </li></ol> 3. Analyse microscopique des échantillons prélevés <ol><li> Préparer un 24 bien à fond plat plaque de culture tissulaire avec de la poly-L-lysine lamelles recouvertes. </li><li> Introduire à la pipette à chaque échantillon prélevé lors de la purification et 150 LCV ul de chaque fraction de gradient de densité dans la plaque de 24 puits. Ajouter 0,5 mL de tampon HS à chaque puits pour diluer la concentration élevée Histodenz. Ensuite, centrifuger la plaque à 600 × g pendant 10 min à 4 ° C. Retirez délicatement le surnageant et fixer les échantillons avec du paraformaldéhyde 4% (PFA) pendant 20 min à température ambiante. Après fixation laver les échantillons à deux reprises. Nouse Sorc pour D. discoideum et PBS pour RAW264.7 macrophages. </li><li><ol class="lalpha"><li> Montez les échantillons provenant de la GFP-calnexine exprimant D. discoideum, prises à différentes étapes lors de l&#39;isolement LCV, directement sur ​​verre diapositives à l&#39;aide Vectashield par exemple. </li><li> Incuber les échantillons à partir des macrophages, des prises RAW264.7 à différentes étapes lors de l&#39;isolement LCV, avec une solution de blocage (1% de BSA dans du PBS) pendant 10 min à température ambiante. Utilisez un anticorps anti-SIDC primaire pour colorer les véhicules utilitaires et incuber pendant 1h dans une chambre humide à température ambiante (purifiée par affinité de lapin anti-SIDC; 1:1000 dans le tampon de blocage). Par la suite, se laver les échantillons trois fois avec du PBS. Incuber avec un anticorps secondaire (par exemple anti-lapin Cy5; 1:200 dans une solution de blocage) pendant 30 min dans une chambre humide et sombre à la température ambiante. Enfin, se laver les échantillons trois fois avec du PBS et les monter sur des diapositives à l&#39;aide de verre par exemple Vectashield. </li></ol></li><li> Morphologie, l&#39;intégrité et la quantité des véhicules utilitaires légers isolés à partir de la GFP-calnexine exprimer D. DIScoideum ou de macrophages RAW264.7 sont analysés par un microscope à fluorescence équipé des filtres adéquats. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs La qualité et le rendement de la purification par immuno-TR affinité de séparation et de centrifugation en gradient de densité peut être suivie par microscopie de fluorescence (fig. 1). Un aperçu des échantillons prélevés au cours de l&#39;isolement LCV de D. discoideu m ou des macrophages est montré (Fig. 2). L&#39;homogénat de L. pneumophila-infectés par le phagocytes montre VU intactes, mais aussi beaucoup de débris cellulaires et les bactéries extracellulaires. Après la granulation de l&#39;échantillon, l&#39;image est similaire à l&#39;homogénat, parfois un peu plus dense. Depuis VU intactes devrait s&#39;en tenir à la colonne, le flux continu contient principalement des bactéries extracellulaires et les débris cellulaires. Après élution de l&#39;échantillon de la colonne, l&#39;éluat contient VU intactes en grandes quantités. Dans nos mains, le LCV Purificati<html> sur qui semble être plus efficace pour D. discoideum que pour les macrophages. Dans D. discoideum les vacuoles des agents pathogènes apparaissent plus rond et le rendement des véhicules utilitaires isolées de plus de 10 fois plus élevé comparativement à macrophages (Fig. 3). Dans les macrophages intactes PFV colorées avec des anticorps différents semblent également plus de forme irrégulière. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig1.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble schématique de l&#39;isolement LCV. A) L&#39;isolement des véhicules utilitaires par immuno-séparation magnétique en utilisant un anticorps purifiés par affinité contre le SIDC protéine effectrice bactérienne, la localisation exclusivement à la membrane LCV. Un MACS secondaire micro-billes couplé anticorps et un aimant sont utilisés pour isoler véhicules utilitaires à partir des débris cellulaires. B) Après véhicules utilitaires de séparation immuno-magnétique sont en outre purifié par centrifugation Histodenz gradient de densité. VU sont enrichis dans la fraction 4. upload/4118/4118fig2.jpg &quot;/&gt; Les échantillons Figure 2. Recueillies lors de la purification LCV. Images de homogénat, granulés, en écoulement continu et éluat de D. discoideum ou les macrophages sont représentés. Les échantillons montrent L. pneumophila produire DsRed-Express (en rouge) dans D. discoideum produire GFP-calnexine signal (vert, panneau supérieur) ou dans les macrophages colorées avec un anticorps anti-SIDC (cyan, panneau inférieur). Bars, 10 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig3.jpg" /> Figure 3. Purifiée véhicules utilitaires à partir de D. discoideum ou les macrophages. Les échantillons montrent fraction correspondant à 4 après centrifugation Histodenz gradient de densité de L. pneumophila produire DsRed-Express (en rouge) dans (A) D. discoideum produire GFP-calnexine signal (vert) ou (B) dans les macrophages colorées avec un anticorps anti-SIDC (cyan). Bars, 10 um.

<ol><li>Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+spp.+outdoors%3A+colonization%2C+communication+and+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).</li>
<li>Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot%2FIcm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS ONE. 6, e17638(2011).</li>
<li>Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anchors+for+effectors%3A+subversion+of+phospho-inositide+lipids+by+Legionella%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella.</a> Front Microbiol. 2, 91(2011).</li>
<li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li>
<li>Kima, P. E., Dunn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+calnexin+expression+on+phagosomes+to+isolate+Leishmania+parasitophorous+vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles.</a> Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).</li>
<li>Lührmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).</li>
<li>Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+Mycobacterium+and+the+macrophage+analyzed+by+two-dimensional+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).</li>
<li>Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+Rhodococcus+equi-containing+vacuoles+is+arrested+after+completion+of+the+early+endosome+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage.</a> Traffic. 6, 635-653 (2005).</li>
<li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages%3A+Y.+pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).</li>
<li>Shevchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+Legionella-containing+phagosomes+isolated+from+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium.</a> Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).</li>
<li>Brombacher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab1+guanine+nucleotide+exchange+factor+SidM+is+a+major+phosphatidylinositol+4-phosphate-binding+effector+protein+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila.</a> J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).</li>
<li>Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Legionella-containing+vacuoles+by+immuno-magnetic+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3(2010).</li>
<li>Urwyler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Legionella+vacuoles+purified+by+magnetic+immunoseparation+reveals+secretory+and+endosomal+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases.</a> Traffic. 10, 76-87 (2009).</li>
<li>Mampel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planktonic+replication+is+essential+for+biofilm+formation+by+Legionella+pneumophila+in+a+complex+medium+under+static+and+dynamic+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Contrairement aux méthodes déjà publiées, ce protocole est basé sur deux étapes, d&#39;abord la séparation des véhicules utilitaires par une approche immuno-magnétique, et la seconde, la purification de véhicules utilitaires par centrifugation en gradient de densité. L&#39;isolement LCV peut être facilement suivie par microscopie à fluorescence, soit quand les bactéries marquées par fluorescence et GFP-cellules productrices ou coloration anticorps est utilisé. Le protocole décrit ici est un simple, straight-forward méth...

purification de vacuoles agent pathogène à partir<em&gt; legionella</em&gt; infectées par les phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Le pathogène opportuniste Legionella pneumophila est une bactérie résistante aux amibes, qui reproduit également dans les macrophages alvéolaires causant ainsi la pneumonie sévère &quot;la maladie du légionnaire&quot; 1. Dans les phagocytes protozoaires et les mammifères, L. pneumophila emploie un mécanisme conservé pour former un particulier, la réplication permissive compartiment, la &quot;Legionella contenant vacuole&quot; (LCV). La formation exige que le LCV bactérienne Icm / Dot système de sécrétion de type IV (T4SS), qui translocation jusqu&#39;à 275 &quot;effecteurs&quot; protéines dans les cellules hôtes. Les effecteurs de manipuler protéines de l&#39;hôte ainsi que des lipides et de communiquer avec sécrétoire, organites endosomes et mitochondrial 2-4. La formation de véhicules utilitaires légers représente un processus complexe, robuste et redondant, ce qui est difficile à saisir d&#39;une manière réductionniste. Une approche intégrative est nécessaire pour complètement comprendre la formation des LCV, y compris une analyse globale de la trajectoireles interactions de facteurs fibrinogène-hôtes et de leurs dynamiques temporelles et spatiales. Comme une première étape vers cet objectif, véhicules utilitaires intactes sont purifiés et analysés par la protéomique et la lipidomique. La composition et la formation de micro-organismes pathogènes contenant des vacuoles a été étudié par analyse protéomique par chromatographie en phase liquide ou 2-D électrophorèse sur gel couplée à la spectrométrie de masse. Vacuoles isolées soit de la discoideum sol social amibe Dictyostelium ou phagocytes de mammifères nourrissait Leishmania 5, 6 Listeria, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, 9 ou Salmonella Legionella spp. 10. Cependant, les protocoles de purification utilisées dans ces études sont longues et fastidieuse, car elles nécessitent par exemple la microscopie électronique pour analyser la morphologie des LCV, l&#39;intégrité et la pureté. En outre, ces protocoles ne pas exploiter les caractéristiques spécifiques de la vacuole pathogène pour enenrichissement par. La méthode présentée ici permet de surmonter ces limitations en utilisant D. discoideum production d&#39;un marqueur fluorescent TR et en ciblant la protéine bactérienne SIDC effecteur, qui sélectivement ancres à la membrane par TR se lier à la phosphatidylinositol-4-phosphate (PtdIns (4) P) 3,11. VU sont enrichis dans une première étape par immuno-magnétique de séparation en utilisant un anticorps purifié par affinité primaire contre SIDC et un anticorps secondaire couplé à des billes magnétiques, suivie d&#39;une deuxième étape d&#39;une centrifugation en gradient de densité classique Histodenz 12,13 (fig. 1) . Une étude du protéome de véhicules utilitaires légers isolés de D. discoideum a révélé plus de 560 protéines de la cellule hôte, y compris les protéines associées à des vésicules phagocytaires, les mitochondries, ER et appareil de Golgi, ainsi que plusieurs GTPases qui n&#39;ont pas été impliqués dans la formation avant le 13 LCV. VU enrichi et purifié avec leprotocole décrit ici peut être encore analysés par microscopie (immunofluorescence, microscopie électronique), des méthodes biochimiques (Western blot) et des approches protéomiques ou lipodimique.

Cet article décrit une méthode pour l&#39;isolement et la purification de intacts<em&gt; Legionella</em&gt; Contenant des vacuoles (VU) de l&#39;amibe et les macrophages. Le protocole en deux étapes comprend l&#39;enrichissement TR par immuno-magnétique séparation utilisant un anticorps dirigé contre un marqueur bactérien TR et la purification en outre par centrifugation en gradient de densité.

Purification de vacuoles agent pathogène à partir<em&gt; Legionella</em&gt; Infectées par les phagocytes

Le pathogène opportuniste Legionella pneumophila est une bactérie résistante aux amibes, qui se réplique également dans les macrophages alvéolaires, provoquant ainsi la forme grave de...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'isoler des VAE ou des LCD contenant des légionelles intactes à partir de phagocytes infectés. Cette isolation est réalisée en homogénéisant d'abord les phagocytes infectés à l'aide d'un homogénéisateur à billes en acier inoxydable. Dans une deuxième étape, l'homogénat est incubé avec un anticorps primaire ciblant spécifiquement une protéine effectrice bactérienne localisée dans la membrane du VCL, puis incubé avec un anticorps secondaire couplé à des billes magnétiques.Ensuite, les anticorps marqués par lc contre sont retenus par un champ magnétique, puis lavés et mis en évidence. En fin de compte, les LCD enrichis magnétiquement peuvent être purifiés davantage par une centrifugation en gradient de densité.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans le fait que les caractéristiques moléculaires spécifiques aux compartiments des parasites infectés peuvent être exploitées pour purifier des bactéries pathogènes intactes. Quatre jours avant l'isolement du LCV, ensemencer en stries sur des géloses CYE contenant du charbon actif et de l'extrait de levure des stocks glycérolés de Legionella pneumophila producteur de DS red express, en présence de cinq microgrammes par millilitre de chloramphénicol, et incuber les bactéries à 37 degrés Celsius. Un jour avant l'infection, cultiver Calnexin GFP producteur de Dictyostelium discoideum à une concentration de 1 × 10⁷ cellules dans des flacons de culture tissulaire de 75 cm², en ajoutant 10 millilitres de milieu HL5 avec G418, et incuber les amibes à 23 degrés Celsius. Le jour de l'expérience, ensemencer un tube à essai de 15 millilitres contenant 3 millilitres de milieu YE et 5 microgrammes par millilitre de chloramphénicol avec environ 100 microlitres d'une suspension de L. pneumophila.Pour obtenir une densité optique à 600 nanomètres de 0,1, incuber la culture de la veille sur une roue rotative à 37 degrés Celsius pendant 21 à 22 heures avant de commencer l'isolement. Tout d'abord, changer le milieu des cellules dedis qadium afin d'éliminer l'antibiotique. Mesurer ensuite la densité optique de la culture de L pneumophila diluée d'un à dix fois de la veille, qui devrait être d'environ 0,3.Ensuite, transférez environ 500 microlitres de la suspension de L. pneumophila dans chaque flacon pour infecter les cellules de D. discoïdes. Synchronisez l'infection en centrifugeant les bactéries sur les cellules pendant 10 minutes à 500 × g et à 25 degrés Celsius, puis incubez les cellules de D. discoïdes pendant une heure à 25 degrés Celsius. Après l'infection.Retirez le milieu et lavez l'amibe une fois avec du tampon C froid. Pour éliminer toute bactérie extracellulaire, ajoutez trois millilitres de tampon HS supplémenté en inhibiteurs de protéases dans chaque flacon, puis utilisez un grattoir à cellules pour recueillir les cellules. L'homogénéisation des cellules infectées est la partie la plus délicate de la procédure.Le succès dépend d’un homogénéisateur à billes en acier inoxydable parfaitement propre, de la taille d’exclusion correcte de l’homogénéisateur à billes, d’un nombre impair de va-et-vient et de la quantité de pression appliquée. Après avoir regroupé les échantillons correspondants dans un tube à essai de 15 millilitres, lavez un homogénéisateur à billes en acier inoxydable équipé d’une bille avec un jeu de huit micromètres à l’eau distillée, puis rincez l’homogénéisateur avec du tampon hs glacé. Remplissez ensuite une seringue en plastique de trois millilitres à verrouillage LOR avec le premier aliquot de trois millilitres de la solution cellulaire et fixez la seringue sur l’homogénéisateur.Appuyez sur l'échantillon en avant et en arrière neuf fois à travers l'homogénéisateur, puis recueillez l'échantillon homogénéisé dans un nouveau tube à essai de 15 millilitres. Jetez la seringue utilisée et fixez-en une nouvelle. Après avoir regroupé l'ensemble de l'échantillon homogénéisé, transférez 150 microlitres d'Eloqua dans un tube einor pour une analyse ultérieure.Ensuite, bloquer l'homogénat avec 2 % de sérum de veau pendant 30 minutes sur de la glace, en agitant. Après blocage, vortexer, ajouter un anticorps primaire dirigé contre un marqueur bactérien qui se lie exclusivement à la membrane du vacuole contenant Legionella (LCV), puis incuber l'échantillon avec l'anticorps sur de la glice, en agitant, pendant une heure. Entre-temps, ajouter 5,75 millilitres d'une solution histo den à 35 % dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.Recouvrez soigneusement 5,75 millilitres d'une solution de histo den à 10 %, puis placez les tubes horizontalement pendant une heure à température ambiante. Ensuite, centrifugez l'homogénat bloqué et traité par anticorps pendant 15 minutes à 600 ×g et à 4 degrés Celsius. Après avoir éliminé le surnageant, resuspendez le culot dans 1,5 millilitre de tampon HS, puis transférez l'échantillon dans un nouveau tube à essai de 15 millilitres.Ensuite, vortexez l'anticorps secondaire, puis incubez l'homogénat avec l'anticorps secondaire et placez l'échantillon sur de la glace dans un agitateur rotatif pendant 30 minutes. Pendant ce temps, placez la colonne appropriée sur le support magnétique Max et équilibrez la colonne avec un demi-millilitre de tampon HS. Après 30 minutes, appliquez l'échantillon sur la colonne et rincez la colonne trois fois avec du tampon HS.Ensuite, retirez la colonne de l'aimant et éluez les acides nucléiques avec 0,5 millilitre de tampon HS en plongeant immédiatement.Maintenant, remettez lentement les tubes à gradient d'histodensité en position verticale et déposez délicatement l'éluat en surface. Faites centrifuger les tubes pendant une heure à 3 350 × g et à quatre degrés Celsius. Enfin, utilisez une pipette Pasteur en verre longue pour recueillir huit fractions de 1,5 millilitre chacune à partir du fond de chaque tube de 15 millilitres, puis placez les aliquotes dans des tubes Eppendorf.Transférez 150 microlitres de chaque fraction de gradient de densité continue dans des tubes EPI DPH pour une analyse ultérieure. Commencez par placer des lamelles revêtues de poly-L-lysine dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 24 puits à fond plat. Ajustez les échantillons mis de côté pendant l'isolement des VCL dans les puits et ajoutez 0,5 millilitre de tampon HS pour diluer la forte concentration de centrifugeuse à extrémités histologiques.Placer la plaque de 24 puits pendant 10 minutes à 600 × g et à 4 degrés Celsius. Retirer soigneusement le surnageant, puis fixer les échantillons avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 20 minutes à température ambiante. Après la fixation, laver les échantillons deux fois avec du PBS, puis monter les échantillons sur des lames de verre avec le milieu de montage approprié. Enfin, analyser les échantillons au microscope à fluorescence équipé des filtres adéquats.Cette première figure montre un aperçu représentatif des échantillons recueillis lors de l'isolement du LCV à partir de dsco, de dium ou de macrophages âgés. L'homogénat de phagocytes infectés par L. pneumophila contient des lc intacts, mais également beaucoup de débris cellulaires et de bactéries extracellulaires après centrifugation.La solution cellulaire. Le contenu de l'échantillon de réserve est similaire à celui de l'homogénat, bien qu'il soit parfois un peu plus dense, comme observé ici. Le flux traversant la colonne magnétique contient principalement des bactéries extracellulaires et des débris cellulaires, car les cellules intègres lc vs.Doit rester fixé sur la colonne après élution de l'échantillon de la colonne. L'éluat contient de grandes quantités de lc intact par rapport à après une centrifugation de densité histodens.La purification des LCV semble être plus efficace pour le dsco dium que pour les macrophages contenant du dsco dium. Les VAE du pathogène apparaissent plus rondes et le rendement des LCV isolées est plus de 10 fois supérieur par rapport aux macrophages, dans les macrophages intacts lc vs. Colorés avec différents anticorps, elles apparaissent également de manière plus irrégulière après la procédure de risque.D'autres méthodes, telles que la protéomique ou la microscopie par immunofluorescence, peuvent être réalisées afin de caractériser en détail les composants cellulaires hôtes et bactériens des IST.

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Research

Recherche

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