Isolement et culture de cellules de crêtes neurales de tube neural embryonnaire murin

Prévoyez trois heures pour réaliser ce protocole. Une fois que vous êtes expérimenté, ce protocole devrait prendre entre une heure et demie et deux heures en fonction du nombre d’embryons disséqués. Ce protocole décrit comment prendre un embryon post-cort de 9,5 jours coupé au milieu du code de la plaque otique et de quatre pour isoler le tissu contenant le tube neural vagal. Découpage.

À Soo, les acariens 16 et 22 isoleront le tissu contenant le tube neural du tronc. La crête neurale vagale migre à partir du tube neural vagal. Alors que la crête neurale du tronc migre du tube neural du tronc, le tissu disséqué sera digéré enzymatiquement dans une solution de dys de collagénase, lavé dans l’espace et l’épiderme et le mésoderme non neuraux seront disséqués.

Le tube neural isolé sera lavé deux fois de plus, puis plaqué dans un milieu d’auto-renouvellement. Je suis Elise Graph du laboratoire Bosky de l’Université Vanderbilt. Aujourd’hui, je vais démontrer comment isoler la crête neurale du tube neural dans la culture explan.

Cette technique vous permettra d’étudier les caractéristiques de la crête neurale in vitro. Commençons. Commencez par diluer 100 microlitres d’un mg par mil de fibronectine dans 3,2 millilitres de DPBS stérile.

Placez suffisamment de solution de fibronectine de 30 microgrammes par millilitre pour couvrir le fond de chaque puits d’une plaque à quatre puits. Tapotez doucement les coins de la plaque à quatre puits pour vous assurer que chaque puits est uniformément couvert. Laissez la plaque reposer pendant que vous préparez et filtrez votre média.

L’assiette doit reposer au moins 15 minutes. Récupérez les réactifs suivants pour préparer votre milieu. Les milieux sont préparés dans une enceinte de biosécurité avant d’être utilisés.

Assurez-vous d’utiliser une technique stérile en tout temps. Retirez le nin en fibre du plat à quatre puits et laissez-le sécher avec le couvercle retiré à l’arrière de la hotte. Il faut environ 15 minutes pour que la fibre nin sèche.

Une fois la plaque sèche, ajoutez 500 microlitres de milieu auto-renouvelable à chacune. Bien placez la plaque de 37 degrés dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone immédiatement avant de commencer la dissection, mélangez 50 microlitres d’espace disque de collagénase dans cinq millilitres de DPBS. Assurez-vous d’ajouter toute la collagénase dispa pour assurer une digestion efficace.

Utilisez un filtre à seringue de 0,2 micron pour filtrer la solution de collagénase dispa dans trois puits d’une plaque à 12 puits. Chaque puits doit recevoir un tiers de la solution de cinq millilitres Pipette environ un millilitre de produit de lavage dans chacun des puits restants. Placez l’assiette sur de la glace jusqu’à ce que vous soyez prêt à digérer votre tissu isolé.

Ensuite, coupez l’embout d’une pointe de pipette P 20 juste en dessous du bord biseauté avec une lame de rasoir stérile. Trempez l’embout dans un produit de lavage afin de recueillir des embryons et des morceaux de tissu isolés. Ne collez pas aux pointes pendant le transfert entre les solutions.

Faites de même pour la pointe d’un P 1000 à partir d’un accouplement chronométré. Retirez l’utérus de la mère. Terminez la dissection dans un DPBS stérile.

Stérilisez vos outils de dissection en utilisant n’importe quelle méthode telle que la stérilisation thermique. Si le DPBS devient trouble, déplacez l’embryon avec la coupure P 1000 dans une boîte fraîche de DPBS stérile en commençant par le tissu coupé. Éloignez doucement le tissu utérin de la décidule.

Ensuite, retirez délicatement l’embryon de l’intérieur de la décidule. L’emplacement de l’embryon est indiqué ici par un dessin animé. Après avoir isolé un embryon post-coum de 9,5 jours, retirez délicatement le sac vitellin avec des aiguilles à insuline.

Si le génotypage est une partie nécessaire de votre protocole, lavez le sac vitellin et tout tissu embryonnaire restant dans du DPBS propre et stérile. Placez le tissu dans un tube de 1,5 millilitre et conservez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que vous soyez prêt à isoler l’ADN. Orientez-vous vers l’anatomie de l’embryon.

Vous allez couper au milieu du code PLA OTIC dans SOMITES quatre, 16 et 22. Vous devrez ajuster la mise au point de votre microscope afin de compter les somites. Effectuez la première coupe au milieu du code PLA otic.

Utilisez les aiguilles comme les lames de ciseaux sans endommager le reste du tube neural. Faites la deuxième coupe après avoir coupé quatre. Ensuite, coupez jusqu’à ce qu’il y en ait 15 et coupez immédiatement après.

Faites la coupe finale Après l’acarien 22 ou le dernier, l’acarien 22. Si le développement de l’embryon est plus précoce. Ce tissu contient le tube neural du tronc pour isoler le tissu contenant le tube neural vagal.

Coupez le cœur du tissu entre le plateau otique moyen et le quatrième acariens. Remarquez la différence de taille entre les morceaux de tissu isolés. La pièce contenant le tube neural vagal est plus large que l’autre.

Cette distinction physique vous permet de traiter les deux pièces ensemble. Utilisez la coupure P 20 pour transférer le tube neural à la collagénase dans l’espace. Le tissu restant peut être conservé pour le génotypage.

Comme indiqué précédemment, placez les morceaux de tissu isolés dans l’un des puits avec l’espace de la collagénase. Maintenant à température ambiante. Laissez reposer pendant 10 minutes.

Au cours de l’incubation de 10 minutes, vous pouvez commencer à disséquer l’embryon suivant. Après 10 minutes, retirez le tissu isolé de l’espace de la collagénase et lavez-le en pipetant de haut en bas dans un milieu de lavage, placez le tissu digéré dans DPBS. Voici à quoi devrait ressembler le tissu après la digestion.

L’étape suivante consiste à enlever le derme non neural et le mésoderme. Tout d’abord, le derme non neural est soulevé du tube neural. Ensuite, le mésoderme peut être retiré du tube neural.

Pour démontrer l’ablation du derme et du mésoderme non neuraux, nous nous concentrerons sur le tube neural vagal. Le même processus peut être fait avec le tube neural du tronc. Commencez par maintenir le tissu non neural avec une aiguille.

Utilisez l’autre pour retirer délicatement le derme non neural. Ensuite, retirez doucement les somites adjacents au tube neural pour éliminer les restes de tout tissu non neural. Itérez doucement avec la pointe de pipette P 20.

Lavez le tube neural deux fois avec un produit de lavage. Placez le tube neural dans un milieu d’auto-renouvellement, puis plaquez en un quatre préparé. Bien plat.

Placez la plaque à quatre puits dans une chambre d’hypoxie. Assurez-vous que la chambre est scellée. Fixez un analyseur d’oxygène et allumez la source de gaz mélangé.

Utilisez un mélange de 1 % d’oxygène, 6 % de dioxyde de carbone et 93 % d’azote. Chargez la chambre d’hypoxie jusqu’à ce qu’elle soit à 3 % d’oxygène. Éteignez le gaz mélangé et placez la chambre d’hypoxie à 37 degrés Celsius.

24 heures plus tard. Regardez l’explan du tube neural. Les cellules de la crête neurale doivent avoir migré à partir du tube neural délimité par la ligne continue pour éviter la contamination par du tissu de crête non neurale coupé autour de l’extérieur du tube neural avec une aiguille à insuline.

Ensuite, retirez le tube neural de l’explan et toutes les cellules de crête non neurale restantes. Remplacez le milieu par un milieu frais d’auto-renouvellement et remettez les plaques dans la chambre d’hypoxie. Chargez-le et placez-le à 37 degrés Celsius.

Après 24 heures de culture, la crête neurale migrera loin du tube neural. L’étendue de l’excroissance est indiquée par une ligne pointillée. Cette excroissance de la crête neurale, mise en évidence par des flèches, est pure à environ 96 % et les cellules expriment P 75, SOX 10 et Fox D trois.

Les expériences qui peuvent être menées avec ces cellules de crête cultivées comprennent, sans s’y limiter, les suivantes. Parfois, les cultures moins idéales ne produiront pas d’excroissances efficaces si cela se produit. Vérifiez les conditions hypoxiques, les concentrations de fibronectine et le temps pendant lequel le tissu a été digéré dans la collagénase DYS Space aujourd’hui, j’ai démontré les bases de la culture de la crête neurale à partir du tube neural.

Bonne chance dans vos expériences.