Microdialyse d'éthanol au cours de l'éthanol détermination opérant auto-administration et d'éthanol par chromatographie en phase gazeuse

L’objectif global de cette procédure est de surveiller les niveaux d’éthanol dans le dialysat cérébral pendant une séance d’auto-administration d’éthanol. Afin de comparer cette mesure aux comportements d’auto-administration synchrone, cela est accompli en implantant d’abord chirurgicalement un guide de microdialyse, une canule et un boulon d’attache, puis en entraînant des rats à s’auto-administrer de l’éthanol de manière opérante. La deuxième étape consiste à habituer les rats à la longe de l’étage de tête afin qu’elle n’entrave pas l’auto-administration de l’éthanol pendant la microdialyse.

Ensuite, la microdialyse est réalisée lors d’une séance d’auto-administration d’éthanol au cours de laquelle une partie du dialate est préparée pour l’analyse de l’éthanol. Ensuite, les échantillons de dialate sont analysés pour déterminer la concentration d’éthanol à l’aide d’un chromatographe en phase gazeuse avec détection par ionisation de flamme. En fin de compte, les résultats obtenus montrent l’évolution temporelle de l’éthanol atteignant la région cérébrale d’intérêt lors d’une séance d’auto-administration d’éthanol.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la ponction de la queue ou de la veine saphène est que cette procédure est peu perturbatrice au moment de la collecte de l’échantillon et permet de mesurer le médicament au fil du temps dans la région du cerveau d’intérêt pendant que l’animal effectue une tâche comportementale. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car elle nécessite un certain nombre de compétences spécialisées, dont beaucoup ne peuvent être acquises que par une pratique ou une expérience répétée. Jeffrey Dilley, assistant de recherche de premier cycle dans notre laboratoire, fera également la démonstration de la procédure.

Toutes les procédures pour les animaux présentées sont approuvées par le comité institutionnel de l’Université du Texas sur le soin et l’utilisation des animaux et suivent tous les guides pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. L’Université du Texas à Austin est un établissement accrédité par l’ALAC, des rats longs Evans bien manipulés qui ont été implantés chirurgicalement avec une canule de calibre 21 au-dessus de la région cérébrale d’intérêt sont utilisés pour ces expériences de microdialyse comportementale. Tous les animaux doivent recevoir au moins une semaine de soins post-chirurgicaux et de récupération et être en bonne santé avant de commencer les procédures suivantes.

Placez le rat dans une chambre opérante de med associates, équipée d’un levier rétractable lichter et d’un tube basculant, et entraînez-le à appuyer sur le levier pour accéder à une solution à 10 % de saccharose. Une fois que le rat est entraîné à réagir à la solution de saccharose, commencez-la selon un programme d’entraînement approprié au cours duquel de l’éthanol est progressivement ajouté à la solution au cours de plusieurs séances d’abreuvement la nuit précédant l’avant-dernière séance opérante. Après avoir anesthésié l’animal et vérifié le niveau de sédation, fixez le ressort de la longe au boulon de la tête du rat pour l’habituer à l’appareil qui se compose d’un levier de contrepoids, d’un bras, d’une longe pivotante, d’un ressort et d’un support d’anneaux.

Laissez le rat passer la nuit dans la salle d’opération de sa cage domestique avec ad lido, de la nourriture et de l’eau, puis terminez la séance d’entraînement du lendemain avec la longe et l’équipement d’accompagnement en place la veille de l’expérience de microdialyse. Après avoir anesthésié le rat avec du fluor, vérifiez la sédation en effectuant un pincement des orteils et insérez une sonde de microdialyse perfusée de liquide céphalo-rachidien artificiel. Fixez la sonde de manière appropriée, puis ajustez le débit de la sonde à 0,2 microlitre par minute.

Placez le rat dans sa cage domestique dans la salle opératoire pour passer la nuit avec tout l’équipement de dialyse en place et ajoutez-y de la nourriture, de la nourriture et de l’eau. Le lendemain de l’insertion de la sonde, au moins deux heures avant le début de l’expérience, augmentez le débit de la sonde à son débit de travail. À l’aide d’une seringue Hamilton, vérifiez que le débit de la sonde est constant et qu’il correspond à au moins 90 % du débit réglé.

Si vous évaluez les neurotransmetteurs dans les échantillons de dialyse, prélevez des échantillons pendant toutes les phases de l’expérience. Commencez par prélever des échantillons de dialyse pendant que l’animal est dans sa cage d’origine. Stockez les échantillons de manière appropriée pour une analyse ultérieure.

Transférez soigneusement le rat dans la chambre opérante et démarrez le programme opérant qui contrôle la chambre. Continuez à prélever des échantillons pendant que le rat attend que le levier s’étende dans la chambre deux échantillons avant que le levier ne se déploie. Commencez à prélever une partie de chaque échantillon de dialysat pour l’analyse de l’éthanol en pipetant une aliquote appropriée de dialysat dans un flacon en verre de deux millilitres et en scellant le flacon avec un septum hermétique, une pipette et en scellant rapidement les échantillons d’éthanol.

Comme l’éthanol est volatil et que le volume de l’échantillon est petit, une préparation incohérente ou lente de l’échantillon entraînera des résultats inexacts. Conservez le reste pour l’analyse des neurotransmetteurs. La période de consommation de 20 minutes commence après que le programme informatique de Med Associates a déployé le levier dans la chambre et que le rat l’a appuyé pour accéder à une bouteille de solution à boire.

Continuez à prélever des échantillons tout au long de la période de boisson après la période de boisson, le programme informatique rétracte la bouteille de la chambre. Gardez l’animal dans la chambre pendant une période supplémentaire de 20 minutes après l’abreuvement à la fin de l’expérience de microdialyse. Après avoir anesthésié le rat, retirez la sonde.

Si l’animal n’est pas immédiatement euthanasié sans cruauté, remplacez l’obtérateur pour assurer la visualisation du trajet de la sonde. Collectez le cerveau dans les trois jours suivant l’expérience. Analysez les échantillons ainsi que les étalons d’éthanol externes à l’aide d’un chromatographe en phase gazeuse avec un détecteur à ionisation de flamme, d’un échantillonneur automatique d’espace de tête, chauffé à 50 degrés Celsius, et d’une colonne capillaire avec de l’hélium comme phase mobile.

Pour l’enregistrement et l’analyse des chromatogrammes, utilisez un logiciel de poste de travail de chromatographie pour préparer le système à l’analyse de l’éthanol. Utilisez un bain-marie à recirculation pour chauffer la plaque d’échantillonnage automatique et ouvrir les réservoirs d’air et d’hydrogène. Ensuite, lancez le programme de démarrage.

Lorsqu’il est prêt, amorcez une combustion de 20 minutes, qui décontamine la fibre. Établissez des étalons à l’aide d’une fiole jaugée de 100 millilitres pour diluer 238 microlitres d’éthanol à 95 % avec de l’eau jusqu’à un volume final de 100 millilitres. Utilisez une dilution en série un à un pour créer des normes.

Pipetez les étalons dans des flacons en verre et scellez-les exactement comme les échantillons ont été préparés. Assurez-vous de faire un blanc d’eau avec vos normes. Placez les étalons et les échantillons dans le plateau d’échantillonnage automatique et chauffez-les jusqu’à ce que toute l’aliquote liquide ait été vaporisée.

Pour exécuter les étalons et les échantillons, créez une liste d’échantillons indiquant quel échantillon se trouve dans quel emplacement d’échantillonneur automatique et notez que chaque échantillon doit être perforé. Une fois acheminez les fichiers de données vers un dossier sélectionné, sélectionnez une méthode de choix pour les échantillons et commencez l’exécution. Une fois que le système a parcouru les échantillons, vérifiez que le programme a correctement intégré chaque pic.

Tracez la hauteur maximale en fonction de chaque étalon externe connu. Concentration d’éthanol. Utilisez la fonction linéaire donnée par les points pour interpoler la concentration d’éthanol de chaque échantillon de dialysat.

Cette figure montre des exemples de chromatogrammes pour trois concentrations d’étalons d’éthanol et un pour un échantillon de dialysat de rat prélevé à la fin de la séance d’auto-administration d’éthanol. Les pics d’éthanol doivent être relativement symétriques, avoir des temps de rétention constants et un rapport signal/bruit supérieur à 10. Si ces critères ne sont pas respectés, le système nécessite une maintenance, une chromatographie de qualité et des étalons corrects produisent une courbe standard linéaire qui est utilisée pour calculer la concentration d’éthanol des échantillons de dialysat prélevés sur des animaux auto-administrés d’éthanol au cours de leur auto-administration.

Les concentrations dérivées d’éthanol dialysat ne sont pas corrigées pour la récupération in vivo de la sonde et ne représentent qu’une fraction de la concentration tissulaire d’éthanol dans le cerveau. Si une microdialyse quantitative de l’éthanol est nécessaire, la fraction d’extraction de l’éthanol qui se diffuse de l’espace extracellulaire dans la sonde est déterminée expérimentalement. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ quatre à cinq heures si elle est exécutée correctement.

Cela variera en fonction de la durée de la séance comportementale. La réussite de la phase de microdialyse de l’expérience dépend en grande partie de la qualité des phases préparatoires. Bien qu’il soit important d’essayer cette procédure, assurez-vous que vos rats sont bien manipulés et que vous les avez habitués à tout stimuli potentiellement distrayant qui pourrait survenir pendant l’expérience de dialyse, afin que le comportement d’auto-administration de l’animal ne soit pas affecté.