Fabrication et utilisation de puces à micro-environnement (MEArrays)

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer les effets de différents microenvironnements sur les fonctions cellulaires de types cellulaires adhérents en les exposant en parallèle à une collection variée de microenvironnements Combinator. Cette approche consiste d'abord à fabriquer des substrats d'impression capables d'absorber des mélanges de protéines de microenvironnement. Ensuite, des plaques maîtresses de protéines de microenvironnement sont préparées, puis utilisées pour imprimer des réseaux de microenvironnement (ME) à l’aide d’un robot d’impression de puces à microarray utilisant soit une plume, soit une pointe capillaire.

Ensuite, des plaques maîtresses de protéines microenvironnementales sont préparées. Puis, des cellules adhérentes sont cultivées sur le réseau ME, avec la possibilité de limiter le nombre de cellules. Les résultats obtenus montrent l'impact des différents microenvironnements sur les fonctions cellulaires telles que la différenciation ou la prolifération, selon une analyse par immunofluorescence.

L'idée de cette méthode nous est d'abord venue lorsque nous souhaitions quantifier les effets des microenvironnements tissulaires sur les décisions de destin des cellules souches mémoires humaines, mais nous avons réalisé que les travaux in vivo étaient impossibles. Désormais développée, cette méthode possède de nombreuses applications en biologie cellulaire, en recherche et en découverte de médicaments. Le PDMS est utilisé comme substrat imitant les tissus plus rigides car il est peu coûteux, facile à préparer et facile à imprimer.

Cependant, l'hydrophobicité du PDMS peut le rendre incompatible avec certaines lignées cellulaires lorsqu'on travaille avec du PDMS. Utilisez des gants sans latex, car le latex peut inhiber la polymérisation du PDMS. Pour commencer, dans un gobelet en plastique jetable, mélangez la base d'élastomère de silicone Sylgard 184 avec l'agent de réticulation dans un rapport de 10 à 1, puis homogénéisez vigoureusement à l'aide d'un abaisse-langue en bois ou en plastique.

Ensuite, dégazer une heure le mélange sous vide à température ambiante pendant 30 minutes. Placez ensuite une lame de microscope standard au centre du mandrin sous vide actionné d'une machine de dépôt par centrifugation, puis versez 0,5 millilitre du polymère élastomère mélangé au centre de la surface de la lame et appliquez un revêtement par centrifugation à 6 000 tr/min pendant 60 secondes. Durcissez les lames recouvertes de PDMS à 70 degrés Celsius pendant quatre heures à toute la nuit.

Les lames peuvent être conservées hermétiquement à température ambiante pendant plusieurs mois. Le PA est un hydrogel capable de mimer des tissus plus mous dans la gamme où les cellules de PA n'adhèrent qu'aux emplacements présentant des protéines favorisant l'adhésion cellulaire. Commencez par graver les lames avec de l'hydroxyde de sodium.

Placez les lames sur un bloc chauffant à 80 degrés Celsius. Déposez un millilitre de soude 0,1 N sur chaque lame. Veillez à recouvrir entièrement la surface de la lame, sinon l'analyse par acide (PA) échouera.

Laisser l'hydroxyde de sodium s'évaporer, laissant un film blanc. Répéter ce processus si la surface n'est pas entièrement recouverte. La lame peut être conservée à température ambiante pendant plusieurs jours, si nécessaire.

Ensuite, recouvrir les lames avec un PES sous hotte chimique. Placer les lames dans une boîte de 15 millilitres. Ajouter 300 microlitres de PES sur chaque lame gravée à l'hydroxyde de sodium.

Laisser réagir le PES A avec les lames d'hydroxyde de sodium pendant exactement cinq minutes. Pas plus longtemps. Rincer soigneusement le PES A avec de l'eau déionisée deux à trois fois sur les deux faces des lames.

Sinon, il s'oxydera et formera un dépôt brunâtre sur les lames à l'étape suivante. Aspirez maintenant toutes les solutions des surfaces des lames vers chaque boîte. Ajoutez 25 millilitres de glutaraldéhyde 0,5 % dans du PBS.

Placer les lames à l’abri de la lumière et attendre 30 minutes. Après 30 minutes, aspirer toute la solution de glutaraldéhyde à la surface de la lame. Ensuite, sécher soigneusement les lames à l’aide d’un papier absorbant sans peluches.

Les lames peuvent désormais être conservées à température ambiante pendant la nuit, si nécessaire. Après avoir préparé et dégazé les mélanges de PA, placez-les sur de la glace afin de ralentir leur polymérisation. Juste avant la préparation des lames, ajoutez du persulfate d'ammonium et du TEMED à chaque mélange sur glace, puis mélangez-les à l'aide d'une pipette pendant cinq à dix secondes.

Prélève maintenant le mélange de PA à l’aide d’une pipette et dépose-le sur les surfaces des lames. La quantité de PA varie selon la dureté souhaitée du gel. Ensuite, place des lamelles en verre sur le dessus du PA sans exercer de pression afin d’éviter la formation de bulles.

Laisser polymériser le gel de PA pendant deux heures, puis retirer les lamelles inférieures sous eau déionisée. Laver les lames avec du gel de PA dans de grands bocaux en verre remplis d'eau toute la nuit. Le lendemain, pour éliminer les acrylamides non réactifs, sécher les lames jusqu'à ce que le gel de PA durcisse complètement.

Les lames peuvent ensuite être conservées à quatre degrés Celsius pendant un mois dans une boîte à lames scellée. Pour commencer, une chambre en plastique est fixée de manière à entourer le réseau imprimé provenant d'une lame à deux chambres. Retirez les chambres et coupez-les en deux à l’aide d’un scalpel.

Utilisez une pipette d'un millilitre pour appliquer un fin filet de silicone pour aquarium sur le bord d'une chambre, puis appuyez-la contre la surface d'un réseau Emmy. Évitez de toucher le silicone aux éléments du réseau. Il est essentiel d'assurer une bonne fixation des baleines culturelles au réseau Emmy, car les fuites au niveau de l'attachement des baleines permettent au milieu de s'échapper des chambres, ce qui peut entraîner une mort cellulaire généralisée.

Pour les lames revêtues de PDMS, bloquer les lames en les incubant dans une solution aqueuse de F 108 à 1 % pendant 15 minutes sous vide, quel que soit le type de gel, puis rincer les matrices avec le milieu de culture cellulaire contenant des antibiotiques trois fois, cinq minutes par rinçage. Cette étape élimine les monomères non réactifs, qui peuvent être toxiques pour les cellules dans le cas des gels en PA. Après le troisième rinçage, prévoir une incubation supplémentaire de 30 minutes dans le milieu afin de réhydrater le gel.

Placez maintenant quatre à cinq matrices dans une boîte de Pétri stérile de 15 centimètres. Ajoutez à la boîte la moitié du volume final de milieu contenant les cellules d'intérêt à la concentration requise pour leur application. Les matrices ME doivent être placées dans un incubateur adapté au maintien du type cellulaire utilisé.

Vérifiez toutes les 15 à 20 minutes, au microscope, l’adhérence uniforme des cellules aux motifs imprimés pendant l’observation. Secouez doucement les réseaux ME pour distinguer les cellules attachées des cellules en suspension. Le temps d’adhérence peut varier, mais est généralement complet en moins de deux heures sur un réseau ME codé en PA.

Une fois la saturation de l'attachement ou la limite de temps atteinte, aspirez les cellules non liées et complétez le milieu jusqu'au volume final dans les boîtes contenant les matrices ME revêtues de PDMS. Le retrait complet du milieu entraînerait la mort des cellules. Par conséquent, lors de chaque changement de milieu sur ces préparations, remplacez successivement la moitié du volume de milieu, puis complétez la boîte jusqu'au volume final.

La culture peut se poursuivre pendant plusieurs jours avec des changements normaux de milieu. Les fixateurs courants tels que le paraforme, l'aldéhyde et l'acétone méthanolée sont compatibles avec les systèmes de matrices Emmy. N'oubliez pas que, même lors de la coloration, les matrices ME recouvertes de PDMS doivent rester humides.

Continuez donc avec la technique de remplacement à demi-volume pour préparer des lames des réseaux ME colorés. Utilisez une lame de rasoir pour retirer les chambres et montez les lamelles avec de la flora. La protéine G a été déposée sur un réseau ME en PDMS imprimé à l’aide de broches en silicium à extrémité carrée fixées sur un porte-broche.

Le dépôt de diverses protéines par robot d'impression de puces à ADN a été vérifié par immunofluorescence à l'aide d'anticorps. Les dilutions des solutions protéiques dans la plaque mère reflétaient la quantité déposée sur la surface des substrats d'impression ; les cellules se fixaient aux motifs imprimés de manière évidemment ordonnée. De même, on observe le même motif net de fixation cellulaire lorsque l'on imprime une matrice Emmy à l'échelle de 40 000 passages.

Les profils d'expression des kératines, dépendants de la concentration, ont été induits par deux protéines du microenvironnement sur une lignée cellulaire humaine multipotente de progéniteurs épithéliaux mammaires cultivée sur un gel de PA. Le rapport logarithmique des signaux de kératine 8 par rapport aux signaux de kératine 14 illustre la variation et la reproductibilité du signal. Après 24 heures de culture, les cellules non liées sont éliminées par lavage lors d'une analyse de 12 puces me.

Une analyse statistique standard a été utilisée pour déterminer si les différentes dilutions de collagène de type un et de p-cadhérine humaine recombinante modifiaient l'expression de la kératine. Initialement, aucune variation par rapport à la moyenne n'a été observée parmi les cellules sur les supports juste après leur attachement. Toutefois, après 24 heures, de fortes concentrations de collagène de type un ont induit une expression significativement plus élevée de la kératine huit.

Alors que de fortes concentrations de PCA ici induisaient un signal intense de kératine 14. Cette observation est conforme aux rapports antérieurs concernant les cellules progénitrices mémoires bipotentes. En raison de la nature dynamique et réciproque des interactions entre ces cellules et leur microenvironnement, ces cellules peuvent elles-mêmes modifier la composition des microenvironnements imprimés.

Par conséquent, afin de comprendre les effets aigus des microenvironnements imprimés, la durée d'exposition ne doit pas dépasser 48 heures suivant cette procédure. Tout processus biologique pouvant être mesuré de manière fluorescente ou colorimétrique peut être évalué en fonction du microenvironnement afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que : comment différents microenvironnements modifient-ils la réponse aux médicaments dans des lignées cancéreuses ? Cela se manifeste principalement par des modifications de l'apoptose et de la prolifération.

Ou comment les microenvironnements modifient-ils la différenciation des progéniteurs.