Tridimensionnelle modèle de culture cellulaire pour mesurer les effets de l'écoulement des fluides interstitiels sur l'invasion tumorale

Le but de cette procédure est d’exposer des cellules cultivées en 3D à l’écoulement de fluide interstitiel, et de quantifier les effets médiés par l’écoulement sur l’invasion cellulaire. Ceci est accompli en préparant d’abord une solution de gel composée de collagène de type un et de matrigel. La deuxième étape consiste à ajouter une concentration spécifiée de cellules à la solution de gel.

Ensuite, la suspension cellulaire est ajoutée à un transwell de 12 millimètres de diamètre, de huit microns, et incubée à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la matrice se gélifie. La dernière étape de la configuration de l’analyse consiste à ajouter des quantités spécifiques de milieu aux puits de transfusion pour créer des conditions statiques et d’écoulement. 24 heures plus tard, les membranes du transpuits sont fixées, colorées et visualisées pour la quantification du nombre de cellules envahies.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les chambres d’écoulement microfluidiques et interstitielles, est qu’elle ne nécessite pas de pompes ou d’équipement spécialisé, et qu’elle permet aux chercheurs de tester facilement et rapidement plusieurs conditions ou traitements. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la migration et de l’invasion cellulaires, elle peut également être utilisée ou appliquée pour étudier l’effet du flux de liquide interstitiel sur d’autres comportements cellulaires pertinents, tels que l’expression des protéines, la prolifération cellulaire et les altérations de la signalisation cellulaire. La démonstration de cette procédure sera un LIMA two chaa.

Un étudiant diplômé de mon laboratoire commence cette procédure en jetant une petite aliquote de matrigel sur de la glace à quatre degrés Celsius. Ensuite, préparez la recette de gel avec de l’eau stérile PBS, de l’hydroxyde de sodium, du matrigel et du collagène de type 1 en queue de rat. Mélangez ensuite les composants du gel sur de la glace dans le même ordre et incubez la solution finale pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Placez maintenant des inserts de culture cellulaire de 12 millimètres de diamètre dans une plaque à 12 puits à l’aide d’une paire de pinces stérilisées. Ensuite, comptez les cellules et mettez-les en suspension dans un milieu exempt de sérum à cinq fois 10 à six cellules par millilitre, ajoutez 100 microlitres de suspension cellulaire à 900 microlitres de solution de gel. Après cela, mélangez-les soigneusement en les pipetant doucement de haut en bas.

Par la suite, ajoutez 150 microlitres du mélange final dans chaque insert. Transférez ensuite les inserts dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes jusqu’à ce que le gel polymérise. Pour la condition statique, ajoutez 100 microlitres de milieu sans sérum sur le gel et 1 200 microlitres sous l’insert.

Les niveaux de liquide à l’intérieur et à l’extérieur de l’insert dans le puits doivent être à peu près égaux, ce qui entraîne une différence de pression minimale à travers le gel et aucun flux interstitiel. Pour la condition d’écoulement, ajoutez 100 microlitres de milieu sans sérum sous l’insert et 650 microlitres au-dessus du gel. Dans le même temps, essayez d’éviter de créer des bulles d’air sous l’insert, car elles empêcheront les cellules de migrer à travers la membrane à ces endroits.

Placez ensuite la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Dans cette étape, ajoutez 500 microlitres d’une fois PBS par puits dans une nouvelle plaque à 24 puits pour le lavage des inserts. Retirez ensuite le fluide restant dans la partie supérieure des puits d’écoulement.

Ensuite, utilisez des cotons-tiges pour retirer le gel des inserts. Essuyez le haut de la surface de la membrane afin d’éliminer les cellules non-VA. Lavez ensuite les inserts en les plaçant dans la plaque à 24 puits contenant une fois PBS pendant 15 secondes.

Après cela, retirez le PBS et ajoutez 500 microlitres de para formaldéhyde à 4 % sous chaque insert. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante pour fixer les cellules transmigrées. Retirez ensuite le PFA et rincez-les une fois avec 500 microlitres une fois PBS pour éliminer le fixateur résiduel.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres de solution Triton X 100 à 0,5 % sous les inserts et incubez pendant 10 minutes à température ambiante. Pour perméer les cellules, coupez les membranes de l’insert à l’aide d’une lame de rasoir. Ensuite, placez-les dans 100 microlitres de deux microgrammes par millilitre DPI dans une solution PBS une fois.

En prenant soin de placer le dessous de la membrane vers le bas. La solution DPI doit être préparée quelques minutes avant l’utilisation et conservée dans l’obscurité. Enveloppez maintenant l’assiette dans du papier d’aluminium.

Placez-le sur un shaker à 150 tr/min pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les membranes dans 500 microlitres une fois PBS et remettez-les sur le shaker pendant 10 minutes. Pour enlever le jy libre, répétez le lavage deux fois de plus.

L’étape suivante consiste à placer les membranes sur des lames de verre avec les cellules transmigrées vers le haut. Ajoutez une solution de montage aux membranes. Ensuite, couvrez-les de lamelles.

Ensuite, comptez la tache dappy jusqu’aux noyaux et calculez le nombre de cellules envahies selon le manuscrit ci-joint. Cette figure montre les cellules MDA MB 4 35 s transmigrées sur la membrane. Les cellules envahies ont été fixées après le test d’invasion du flux de fluide interstitiel et colorées avec DPI et Alexa Fluor 4 88 conjugué pour faciliter le comptage des cellules envahies.

C’est la membrane sous fond clair et voici les noyaux de tache dappy. L’Alexa Fluor 4 88 est coloré à l’actine F est montré ici. Ce graphique montre que l’invasion des cellules de mélanome métastatique MDA MB 4 35 s a été significativement augmentée par le flux interstitiel.

Après 24 heures, les résultats sont normalisés à la moyenne de la condition d’invasion statique et la moyenne de six inserts de culture cellulaire est présentée. La différence entre les conditions est statistiquement significative avec une valeur P de 0,003. Une fois maîtrisé, le test d’écoulement de fluide interstitiel peut être mis en place en deux heures, suivi d’une incubation de 24 heures, puis de deux heures pour la fixation et la coloration des membranes transformantes.

À la suite de cette procédure, des cellules, des protéines ou des acides nucléiques peuvent être facilement extraits afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont l’expression des gènes et des protéines change en réponse au flux de liquide interstitiel. Depuis son développement, il est devenu un test essentiel pour les chercheurs qui étudient les effets du flux interstitiel sur les cellules cancéreuses.