Lensfree sur puce microscopie tomographique Employant multi-angle d'éclairage et de Pixel Super-résolution
16 août 2012
Lensfree tomographie optique est une technique de microscopie en trois dimensions qui offre une résolution spatiale de moins de 1 um × <1 um x <3 microns en x, y et z dimensions, respectivement, au cours d'une imagerie grand volume de 15-100 mm 3, Qui peut être particulièrement utile pour l'intégration avec le laboratoire-sur-une-puce plates-formes.
L'objectif général de cette procédure est d'obtenir un imageage tridimensionnel sans lentille sur puce d'échantillons biologiques sur un grand volume d'imageage. Cela est réalisé en plaçant d'abord l'échantillon directement sur la puce du capteur et en fournissant une illumination partiellement cohérente. La deuxième étape consiste à déplacer latéralement la source lumineuse à différentes positions pour enregistrer les images.
Images holographiques du spécimen avec décalage des sous-pixels. Prochain décalage des sous-pixels. Les images holographiques sont enregistrées selon des multiples de l'illumination pour l'imagerie tomographique.
La dernière étape consiste en le traitement des données, au cours de laquelle le jeu de données acquis est numériquement reconstruit afin d'obtenir finalement des images tomographiques tridimensionnelles de l'échantillon. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie optique classique réside dans sa capacité à fournir un imagerie à haut débit dans une architecture compacte. Cela rend notre plateforme particulièrement utile pour une intégration avec des plateformes de puces lab-on-a-chip.
Dans ce rapport, on décrit l'installation de base d'imagerie pour une mise en œuvre sur banc optique destinée à la tomographie d'échantillons statiques. Un monochromateur équipé d'une lampe au xénon a été réglé pour fournir une sortie présentant une largeur spectrale d'environ un à 10 nanomètres autour d'une longueur d'onde centrale comprise entre 450 et 650 nanomètres. Cette sortie partiellement cohérente est ensuite couplée à une fibre optique multi-mode afin d'acheminer la lumière partiellement cohérente vers le système.
La fibre optique est montée sur une platine motorisée de rotation afin de modifier l'angle d'illumination. La platine motorisée munie de la source lumineuse est fixée sur une platine linéaire bidimensionnelle XY, utilisée pour effectuer des déplacements dans le plan de la source lumineuse à un angle donné pour la détection. Un réseau de capteurs A-C-M-O-S doté de cinq mégapixels et d'une taille de pixel de 2,2 micromètres est utilisé.
Le détecteur sert à enregistrer les images holographiques à grand champ de vision des échantillons. Il est essentiel que le réseau de capteurs soit positionné dans le même plan axial que l'axe de rotation de la source lumineuse afin de vérifier si le capteur reçoit suffisamment de lumière sous de grands angles d'illumination. Bien que la tomographie optique sans lentille puisse imaginer divers objets tels que des cellules et des micro-organismes, les principes de base sont illustrés ici par une microscopie tridimensionnelle d'un échantillon de « sea elgan », à l'aide d'un scalpel ou d'une spatule.
Prélevez un petit morceau d'agar depuis la boîte de Pétri contenant la culture d'organes sécréteurs. Un morceau cubique de plusieurs millimètres de côté contiendra des centaines de nématodes. Placez ce petit morceau d'agar dans un flacon en polypropylène contenant un millilitre d'eau déionisée.
Vortexer doucement pendant 30 secondes à une minute. Après 10 à 15 minutes, le ver devrait sortir de l'agar et ramper dans l'eau déionisée. Remarquez que les vers sont trop petits pour être vus ici afin d'immobiliser temporairement les vers et un millilitre de Lima à cinq à 10 millimolaire.
Donc, laissez la solution reposer pendant 10 minutes. Prélevez à la pipette cinq à 10 microlitres d'échantillon à partir du fond du flacon et placez-les en sandwich entre deux lamelles. Cet échantillon, contenant un grand nombre de vers temporairement immobilisés, peut être placé sur le détecteur pour commencer l'acquisition des données.
Pour des raisons de démonstration, les étapes d'acquisition d'images pour une expérience typique de tomographie optique sans lentille, ou LOT, sont résumées dans cette section. Toutefois, l'ensemble du processus a été automatisé à l'aide d'une interface LabVIEW développée sur mesure. Pour commencer les étapes manuelles, régler l'angle initial de la platine de rotation à moins 50 degrés, où zéro degré correspond à la position verticale de la source lumineuse. Régler la position initiale de la platine XY à zéro zéro, qui correspond à la position d'origine.
Réglez le temps d'exposition du détecteur afin d'exploiter au mieux sa plage dynamique, de sorte que l'image soit aussi lumineuse que possible sans aucun pixel saturé, sans modifier l'angle du plateau rotatif. Capturez neuf images pour chaque image. Déplacez le plateau XY vers une nouvelle position selon une grille carrée de trois par trois, de manière à ce que chaque image soit décalée d'environ un quart de pixel par rapport à la précédente.
L'acquisition de davantage d'images à chaque angle pourrait améliorer la résolution, selon le type d'objet et le rapport signal sur bruit. Après avoir collecté neuf images à l'angle initial, réajuster la position de la platine XY à la position zéro zéro. Ensuite, augmenter l'angle de la platine de rotation par incréments de deux degrés jusqu'à atteindre plus 50 degrés.
Après chaque incrément et pour chaque nouvel angle, répétez les étapes décrites. Les incréments angulaires peuvent être plus fins ou plus larges selon l'optimisation du temps d'acquisition par rapport à la résolution d'imagerie. Après l'acquisition des données, un ensemble de 459 images est obtenu, comprenant neuf images décalées au niveau des sous-pixels pour chacun des 51 angles d'illumination différents.
Chaque ensemble de neuf images est traité numériquement à l'aide d'algorithmes de super-résolution de pixels afin d'obtenir une projection haute résolution. Les résultats de super-résolution par hologramme et par angle sont ensuite reconstruits numériquement pour obtenir 51 images de projection. Le traitement des données est illustré ici à l'aide d'un ordinateur portable.
La reconstruction prendrait moins d'une seconde pour tout le champ de vision en utilisant des unités de traitement graphique. Cet ensemble de 51 images de projection est ensuite rétroprojeté à l'aide du module complémentaire Tom OJA. Pour ImageJ, les images de projection sont d'abord chargées dans ImageJ, puis le module complémentaire Tom OJ est lancé.
Une table de correspondance qui fournit l'angle de vue pour chaque image de projection est chargée dans OJ. En utilisant la méthode de rétroprojection pondérée, des images tomographiques tridimensionnelles de l'échantillon peuvent être obtenues. Le grand champ de vision de la tomographie optique sans lentille est illustré ici par le fait que l'échantillon est placé directement sur le dessus du réseau de détecteurs. Des images holographiques des objets peuvent être enregistrées sur un champ de vision de 24 millimètres carrés, qui peut être encore augmenté en utilisant des réseaux de détecteurs émergents dotés de zones actives plus grandes.
Bien que la taille des pixels du réseau de détecteurs limite la résolution des images holographiques enregistrées, des techniques de super-résolution au niveau du pixel atténuent ce problème. Des hologrammes super-résolus au niveau du pixel sont présentés ici, ainsi que les images de projection reconstruites, offrant une résolution spatiale submicrométrique pour trois angles d'illumination différents. Les images de projection peuvent être combinées à l'aide de techniques de reconstruction d'images tomographiques afin de calculer les tomographies du spécimen. Trois coupes dans le plan XY à travers l'extrémité antérieure du ver sont montrées ici, où le tube pharyngien n'est visible que dans la coupe correspondant à Z égal à huit micromètres, comme prévu pour cette structure approximativement cylindrique dont le diamètre externe est d'environ cinq micromètres.
En outre, l'image en coupe transversale dans le plan XZ montre clairement les limites du ver et du tube pharyngien interne, démontrant ainsi une imagerie 3D réussie du pharynx. Grâce à son développement, cette technique peut ouvrir la voie aux chercheurs pour réaliser une microscopie tridimensionnelle sur des volumes d'imagerie atteignant plusieurs dizaines de millimètres. Par conséquent, la tomographie optique sans lentille peut constituer un outil utile pour des applications d'imagerie à haut débit sur des plates-formes de puces lab-on-a-chip.
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Aperçu
Cet article traite de la tomographie optique sans lentille, une technique de microscopie tridimensionnelle permettant une imagerie à haute résolution d'échantillons biologiques. La méthode autorise l'imagerie sur un grand volume, ce qui la rend adaptée à l'intégration avec des plateformes lab-on-a-chip.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Imagerie biologique
- Techniques de microscopie
Contexte
- La tomographie optique sans lentille offre une résolution spatiale de <1 μm × <1 μm × <3 μm.
- La technique permet d'imaginer des volumes compris entre 15 et 100 mm³.
- Elle est particulièrement avantageuse pour des applications dans les technologies de laboratoire-sur-puce.
- Cette méthode utilise un éclairage partiellement cohérent pour l'imagerie.
Objectif de l'étude
- Obtenir une imagerie tridimensionnelle sans lentille de spécimens biologiques.
- Explorer l'intégration de cette technique avec des plateformes lab-on-a-chip.
- Améliorer les capacités d'imagerie sur de grands volumes.
Méthodes utilisées
- Placement de l'échantillon directement sur la puce du capteur.
- Utilisation d'un éclairage partiellement cohérent.
- Décalage latéral de la source lumineuse pour enregistrer des images holographiques décalées au sous-pixel.
- Enregistrement de plusieurs images holographiques pour l'imagerie tomographique.
Résultats principaux
- Imagerie réussie d'échantillons biologiques en trois dimensions.
- Démonstration des capacités de haute résolution spatiale.
- Intégration efficace avec des plateformes lab-on-a-chip.
- Validation de la méthode par divers tests d'imagerie.
Conclusions
- La tomographie optique sans lentille est une technique prometteuse pour l'imagerie biologique.
- La méthode offre des avantages considérables en termes de résolution spatiale et de volume d'imagerie.
- Les applications futures pourraient s'étendre à divers domaines de la recherche biologique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La microscopie tomographique sans lentille sur puce permet une imagerie 3D à haut débit et sans marquage d'échantillons biologiques sur de grands volumes, sans optique encombrante, facilitant ainsi l'intégration avec des plateformes microfluidiques et de laboratoire-sur-puce. Cette approche réduit l'encombrement et le coût de l'instrument tout en maintenant une résolution submicronique, répondant aux goulots d'étranglement en phase de découverte liés au débit d'échantillons et à la compatibilité des tests. La technologie améliore la fiabilité prédictive lors de la validation précoce des cibles en fournissant des données structurales quantitatives résolues en profondeur pour le criblage phénotypique et la réduction des risques mécanistiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à la visualisation tridimensionnelle des phénotypes cellulaires et des organites subcellulaires.
- Valeur opérationnelle : Permet l'imagerie sans marquage de spécimens vivants, réduisant ainsi les artefacts de préparation et préservant la biologie native pour les études d'engagement des cibles.
- Valeur prédictive : Génère des données volumétriques quantitatives permettant de clarifier le mécanisme d'action et de réduire les risques associés aux voies cibles en phase de découverte précoce.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Fournit une imagerie 3D à résolution submicronique sur de grands champs de vision, permettant un criblage phénotypique à haut contenu de micro-organismes et de populations cellulaires.
- Valeur opérationnelle : Supprime le besoin de lentilles et d'optique complexe, standardisant ainsi les flux de travail d'imagerie pour un développement d'essais reproductible et évolutif.
- Préparation aux essais : Facilite la mise au point de systèmes biologiques validés pour l'évaluation de composés en aval grâce à une acquisition automatisée des données à haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie la découverte à la validation préclinique en assurant une imagerie 3D cohérente à travers différents modèles, tels que les C. elegans et les embryons de poisson-zèbre.
- Dérisquage mécanistique : Permet le suivi longitudinal des modifications structurelles dans des systèmes pertinents pour la maladie, soutenant ainsi l'alignement des biomarqueurs et les décisions d'avancement ajustées au risque.
- Fidélité des modèles précliniques : Préserve l'architecture tissulaire native et ses dynamiques, améliorant la transposabilité des résultats des contextes in vitro aux contextes in vivo.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, de la biologie précoce jusqu'à l'identification de composés candidats, en soutenant la vérification d'hypothèses, la standardisation des tests et les analyses quantitatives, sans nécessiter de traitement intensif des échantillons ni d'étiquetage.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques grâce à la visualisation 3D de phénotypes structuraux dans des systèmes biologiques non perturbés.
- Criblage : Fournit une imagerie prête à l'emploi et reproductible, accompagnée de données quantitatives, permettant de comparer des conditions témoins et traitées sur de grandes populations d'échantillons.
- Analyse : Génère des reconstructions tomographiques résolues en profondeur et des images de projection qui facilitent la comparaison statistique de caractéristiques morphologiques.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en imagerie d'organismes modèles pertinents pour les maladies, avec une résolution et une couverture volumique constantes.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une plateforme d'imagerie réutilisable, compatible avec divers types d'échantillons et formats microfluidiques, réduisant ainsi les investissements technologiques redondants.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive grâce à une imagerie 3D sans marquage et à haute résolution, réduisant ainsi l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation et l'évolutivité par une conception sans objectif, une acquisition automatisée et une compatibilité avec des réseaux de capteurs de grand format.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en permettant une détection précoce des anomalies phénotypiques, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée et les inefficacités de capital.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque en fournissant des données d'imagerie quantitatives et multiparamétriques permettant une comparaison objective des candidats thérapeutiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en imagerie computationnelle, en holographie et en algorithmes de reconstruction tomographique.
- Dépend de capteurs CMOS haute résolution et de plateformes d'éclairage motorisées pour l'acquisition de données à multiples angles.
- Exige une standardisation inter-équipes des protocoles d'éclairage, des réglages d'exposition et des procédures de décalage au sous-pixel pour assurer la reproductibilité.
- L'adaptation à différents systèmes modèles peut nécessiter une optimisation des techniques de préparation et d'immobilisation des échantillons afin de préserver leur viabilité pendant l'imagerie.
- Les limitations pratiques incluent la sensibilité aux variations de l'indice de réfraction et aux propriétés de diffusion de l'échantillon, ce qui peut affecter le rapport signal sur bruit dans les spécimens denses ou fortement absorbants.
