Name: Un In vitro Co-infection modèle pour étudier Plasmodium falciparum-VIH-1 dans les interactions de lhomme primaires dérivées de monocytes cellules immunitaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Découvrez un modèle de co-infection in vitro pour étudier l'effet de Plasmodium falciparum sur la réplication du VIH-1 dans les macrophages dérivés de monocytes humains. Cette méthode permet d'explorer les interactions entre le paludisme et le VIH.

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Ce travail a été soutenu par les Instituts canadiens de recherche en santé à travers un catalyseur Co-infections et des co-morbidités de subvention. Érythrocytes humains ont été fournies par le Centre Hospitalier de l&#39;Université de banque de sang à Laval.

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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous avons illustré ici deux approches différentes pour analyser l&#39;impact du parasite du paludisme sur le VIH-1 cycle viral, c&#39;est à dire en analysant soit l&#39;expression du gène viral ou la production de virus et la réplication dans la descendance des monocytes-macrophages dérivés. Des approches similaires ont été utilisés pour d&#39;autres le VIH-1-parasite co-infections 16. Toutefois, ces nouvelles données sont un pas en avant dans l&#39;enquête sur le paludisme et le VIH-1 co-infections. . En effet, Diou et al 8 ont étudié l&#39;effet de l&#39;hémozoïne, les parasites vivent pas, sur le VIH-1 de réplication, en accord avec nos résultats, ils ont observé que l&#39;hemozoin était elle-même suffisante pour inhiber la production virale par MDM, et non MDM. Utilisation de la mise en page décrit expérimentale, nous avons observé que P. falciparum exerce un effet néfaste sur la claire du cycle réplicatif du VIH-1 dans les macrophages: une inhibition significative de la production virale est observée dans les macrophages pré-exposés aux parasites (Figure 2A) et un impact spécifique du parasite sur la transcription virale est illustré dans la figure 2B. Cependant, nous ne pouvons pas laisser de côté les effets additionnels du parasite sur l&#39;entrée du virus ou de fusion (décapsidation), ou sur la post-intégration des mécanismes, tels que la synthèse des protéines ou l&#39;assemblage et le bourgeonnement de particules virales. En outre, il est possible que un impact différent sur le VIH-1 de réplication qui serait obtenu si le parasite ont été ajoutés, soit au moment même ou d&#39;une infection MDM suivante avec le virus. Notre in vitro la co-infection modèle fournit un outil puissant pour effectuer des enquêtes approfondies de VIH-1 / P. interactions falciparum dans la cellule hôte. Par exemple, la combinaison de ce dispositif expérimental avec d&#39;autres techniques telles que quantitative PCR en temps réel, ce qui permet de cibler et de quantifier des mesures spécifiques dans rétrotranscription virale et l&#39;intégration du génome viral dans le génome cellule hôte, sont tout à fait faisable et devrait apporter d&#39;autres INSISMTG dans les mécanismes impliqués dans les co-infections. Par ailleurs, des essais spécifiques pour évaluer les étapes précoces du cycle viral (virus de fusion, la quantification d&#39;entrée décapsidation,) peut être appliquée à ce protocole de base pour analyser plus en détail l&#39;effet sur la réplication virale. Ces modifications montrent la souplesse de ce protocole est sur le VIH-1 quantification et de détection: en effet, même standards du VIH-1 inverse tests de quantification de la transcriptase utilisant marqué au tritium nucléotides pourrait éventuellement remplacer le test ELISA pour le VIH-1 p24. En plus de MDM, nous nous attendons à notre système pour être adaptable à d&#39;autres types cellulaires pertinents pour le VIH-1-paludisme interactions, telles que les monocytes et les cellules dendritiques. Le fait que MDM sont des cellules adhérentes facilite leur manipulation, ce qui facilite le lavage de CISR qui n&#39;ont pas été prises, ou qui sont en contact avec MDM, sans pour autant éliminer les macrophages. Un tel avantage ne s&#39;applique pas aux cellules dendritiques et les monocytes, qui sont cultivées en suspension, ce qui complique la soiparation de la CISR URBC et libre avec de telles cellules et nous sommes en train de traiter cette question. Notre système pourrait également être utile pour étudier les interactions plus complexes tels que les effets de Plasmodium-exposés dérivées de monocytes des cellules sur le cycle viral du VIH-1 dans d&#39;autres cellules immunitaires telles que CD4-positifs dans les lymphocytes T de co-culture des expériences. Enfin, notre protocole pourrait être adaptée pour des expériences qui cherchent à l&#39;effet de P. iRBCs falciparum sur le VIH-1 dans la réactivation des PBMC pour le VIH-1 des individus infectés. Déclaration d&#39;éthique Human PBMC ont été obtenues à partir du sang de donneurs sains, conformément aux directives du Comité de bioéthique du Centre Hospitalier de l&#39;Université Centre de recherche de Laval. Un consentement écrit a été obtenu à partir de tous les donneurs de sang.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Multicell </td><td> 350-000-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS-endotoxines </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Wisent </td><td> 080-150 </td><td> Inactivé par la chaleur à 56 ° C pendant 30 min </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4555-56 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax II </td><td> Gibco </td><td> 11021-037 </td><td> Dissous dans du RPMI 1640, stérilisée par filtration </td></tr><tr><td> Milieu de séparation des lymphocytes </td><td> Multicell </td><td> 305-010-CL </td><td></td></tr><tr><td> Plaques blanches luminomètre </td><td> Promega </td><td> Z3291 </td><td></td></tr><tr><td> CS séparation Mac columms </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-041-305 </td><td></td></tr><tr><td> Séparateur VarioMacs </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-090-282 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine solution </td><td> Wisent </td><td> 450-201-EL </td><td></td></tr><tr><td> D-sorbitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td><td></td></tr><tr><td> Grattoir à cellules (25 cm) </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1830 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques à 24 puits de culture cellulaire </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 150 x 20 mm boîte de culture </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td></td></tr><tr><td> M-CSF </td><td> GenScript </td><td> Z02001 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum humain AB + </td><td> Vallée biomédicale </td><td> HP1022 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Wisent </td><td> 311-505-CL </td><td></td></tr><tr><td> La gentamicine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397 </td><td></td></tr><tr><td> Hypoxanthine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9636 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Luciferase Assay System </td><td> Promega </td><td> E1500 </td><td></td></tr><tr><td> Des globules rouges humains </td><td></td><td></td><td> Obtenu purifiée à partir de la banque de sang du CHUL. </td></tr></tbody></table>

un<em&gt; in vitro</em&gt; co-infection modèle pour étudier<em&gt; plasmodium falciparum</em&gt;-vih-1 dans les interactions de l&#39;homme primaires dérivées de monocytes cellules immunitaires

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, l&#39;agent causal de la forme la plus mortelle du paludisme, et virus d&#39;immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) sont parmi les problèmes de santé les plus importants à travers le monde, étant responsable d&#39;un total de 4 millions de décès annuels 1. En raison de leurs chevauchement important dans les régions en développement, en particulier en Afrique subsaharienne, les co-infections avec le paludisme et le VIH-1 sont communs, mais l&#39;interaction entre les deux maladies est mal comprise. Les rapports épidémiologiques ont suggéré que l&#39;infection palustre augmente transitoirement la réplication du VIH-1 et augmente la charge virale VIH-1 dans les personnes co-infectées 2,3. Parce que cette virémie reste élevée pendant plusieurs semaines après le traitement par des antipaludiques, ce phénomène pourrait avoir un impact sur la progression de la maladie et la transmission. Les mécanismes immunologiques cellulaires sous-tendent ces observations ont été étudié uniquement à peine. Les quelques études in vitro InvestigUTILISER LE impact du paludisme sur le VIH-1 ont démontré que l&#39;exposition à antigènes solubles du paludisme peut augmenter le VIH-1 infection et de réactivation dans les cellules immunitaires. Cependant, ces études ont utilisé des extraits de cellules entières de P. falciparum stade schizonte et les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), ce qui rend difficile à déchiffrer quel composant du paludisme (s) était responsable des effets observés et quelles sont les cellules hôtes cibles étaient 4,5. Des travaux récents ont démontré que l&#39;exposition de cellules dendritiques immatures dérivées de monocytes à le pigment palustre hémozoïne augmenté leur capacité à transférer le VIH-1 à cellules T CD4 + 6,7, mais qu&#39;il a diminué le VIH-1 infection des macrophages 8. Pour faire la lumière sur ce processus complexe, une analyse systématique des interactions entre le parasite du paludisme et le VIH-1 dans différentes populations cellulaires de l&#39;homme pertinents primaires est extrêmement nécessaire. Plusieurs techniques pour enquêter sur l&#39;impact de HIV-1 sur la phagocytose des micro-organismes et l&#39;effet de ces agents pathogènes sur le VIH-1 de réplication ont été décrits. Nous présentons ici une méthode pour étudier les effets de P. érythrocytes infectés par P. falciparum sur la réplication du VIH-1 chez l&#39;humain primaires dérivées de monocytes macrophages. L&#39;impact de l&#39;exposition du parasite sur le VIH-1 transcription / traduction événements est surveillée en utilisant des virus à cycle unique pseudotypés dans lequel un gène rapporteur luciférase a remplacé le gène Env tandis que l&#39;effet de la quantité de virus libérés par les macrophages infectés est déterminée en mesurant la VIH-1 protéine de capside p24 par ELISA dans les surnageants cellulaires.

Nous avons développé un<em&gt; In vitro</em&gt; Le paludisme et le VIH-1 co-infection modèle pour étudier l&#39;impact de la<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Sur le cycle réplicatif du VIH-1 dans les primaires humaines dérivées de monocytes macrophages. Ce système polyvalent peut facilement être adapté à d&#39;autres types de cellules primaires sensibles à l&#39;infection VIH-1.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infection modèle pour étudier<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 dans les interactions de l&#39;homme primaires dérivées de monocytes cellules immunitaires

*Plasmodium falciparum*, l'agent causal de la forme la plus mortelle du paludisme, et le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) figurent parmi les plus importants...

L'objectif général de cette procédure est de développer un modèle in vitro permettant d'étudier les effets des érythrocytes infectés par Plasmodium fpar sur la réplication du VIH-1 dans des macrophages dérivés de monocytes primaires humains. Ceci est réalisé en isolant d'abord les globules rouges infectés par Plasmodium false para à l'aide du système veac, puis en exposant les macrophages dérivés de monocytes humains à ces cellules infectées. Ensuite, les macrophages dérivés de monocytes exposés aux globules rouges sont infectés par un VIH entièrement réplicatif ou par un VIH codant pour la luciférase et limité à une seule réplication.Enfin, les surnageants de culture sont récoltés aux jours 3, 6, 9 et 12 post-infection pour le virus entièrement réplicatif porteur du gène de la luciférase. Les cellules infectées sont lysées 72 heures après l'infection. En définitive, la réplication virale peut être suivie en quantifiant la quantité de protéine de capside P24 du VIH-1 dans les surnageants par ELISA, et la transcription virale peut être suivie par la quantification de la luciférase dans les lysats cellulaires.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des co-infections paludisme-VIH. Par exemple, comment l'infection par le parasite plasmodium influence-t-elle la réplication du VIH ? Bien que cette méthode ait été développée pour étudier les interactions entre plasmodium et VIH dans les macrophages, elle pourrait également être appliquée à d'autres types cellulaires.Par exemple, les cellules dendritiques, les monocytes ou les lymphocytes T CD quatre illustrant la procédure seront assurés par Guadalupe Andreani. Une chercheuse postdoctorale dans le laboratoire commence par récolter les globules rouges à partir de la plaque de culture, lave les cellules récupérées dans 10 millilitres de milieu de macrophages dérivés de monocytes, puis resuspend le culot dans 12 millilitres de milieu de culture de macrophages dérivés de monocytes. Ajoutez ensuite lentement la suspension cellulaire dans une colonne Milton ECS et laissez-la s'écouler ; après avoir lavé la colonne une fois avec du milieu frais, retirez-la de l'aimant et éluésez avec 12 millilitres de milieu de culture de macrophages dérivés de monocytes.Milieu traversant la colonne, recueillir les globules rouges infectés dans un tube stérile afin d'exposer les macrophages dérivés des monocytes à des globules rouges infectés ou non infectés. Ajouter le volume approprié de suspension de globules rouges à chaque puits d'une plaque de 24 puits préparée au préalable et contenant des macrophages dérivés des monocytes. Incuber les cocultures à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de dioxyde de carbone ; après quatre heures, retirer le milieu contenant les globules rouges, puis ajouter doucement 600 microlitres de PBS sans endotoxine dans chaque puits, en effectuant trois lavages et en aspirant immédiatement le PBS après chaque lavage.Ajouter maintenant 200 microlitres d’eau glacée, stérile, dans chaque puits pour lyser les globules rouges, puis aspirer l’eau après 20 secondes. Ajouter ensuite 600 microlitres de milieu de culture de macrophages dérivés de monocytes dans chaque puits et incuber les cultures pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Pour évaluer l’effet de Plasmodium falciparum sur la réplication du VIH-1 dans les macrophages dérivés de monocytes, ajouter 300 microlitres de milieu de macrophages dérivés de monocytes contenant la protéine p24 des virus NL4-3 et BO-IV-1 dans les puits appropriés, selon le protocole illustré dans cette figure.Après avoir incubé les cocultures pendant deux heures, laver les cellules trois fois avec 600 microlitres de PBS sans endotoxine. Ensuite, ajouter 600 microlitres de milieu frais pour macrophages dérivés de monocytes dans chaque puits et continuer l'incubation des cocultures aux jours 3, 6, 9 et 12 après l'infection virale initiale. Prélever 200 microlitres de chaque surnageant, en remplaçant la suspension cellulaire récupérée par 200 microlitres de milieu frais pour macrophages dérivés de monocytes. Conserver par la suite les surnageants prélevés à moins 20 degrés Celsius en vue d'une analyse ultérieure par Eliza.Afin de déterminer l'impact des parasites sur l'expression du gène HIV un dans les macrophages dérivés des monocytes, ajouter 300 microlitres de milieu de macrophages dérivés de monocytes contenant la P24 du virus d'intérêt revêtu de luciférase ENC dans les puits correspondants, de manière similaire aux protocoles illustrés ici. Après incubation et lavage des cultures co-infectées comme indiqué précédemment pour le virus non revêtu de luciférase ENC, retirer le milieu 72 heures après l'infection et ajouter 200 microlitres du tampon de lyse pour le test de la luciférase. Le tampon de lyse lysis les cellules à température ambiante avec agitation douce, puis conserver les cultures co-infectées à moins 20 degrés Celsius.Après décongélation de la plaque, transférez 40 microlitres de lysat de chaque puits vers le puits correspondant d'une plaque de luminomètre à 96 puits. Ajoutez ensuite 100 microlitres du substrat de luciférase provenant du kit de dosage de la luciférase dans chaque puits. Enfin, mesurez l'activité de la luciférase de luciole à l'aide d'un luminomètre.Selon les instructions du fabricant dans cette expérience, des macrophages dérivés de monocytes ont été exposés à des globules rouges infectés ou non infectés, puis infectés avec NL4-3 Blen. Comme vient de l'être démontré, la production de la protéine virale p24 a ensuite été mesurée par ELISA pour la p24 du VIH-1 dans les surnageants acellulaires à différents moments suivant l'infection virale initiale. Remarquez la diminution significative de la libération de particules virales au jour 12, mesurée par la protéine de capside p24 du VIH-1 dans le surnageant de macrophages dérivés de monocytes prétraités avec des parasites.Dans cette expérience, des macrophages dérivés de monocytes ont été exposés à des globules rouges infectés et non infectés, puis infectés par un virus codant pour la luciférase, comme vient de l'être démontré. L'expression de la luciférase a ensuite été évaluée dans les lysats cellulaires 72 heures après l'infection initiale par le virus. L'infection des macrophages dérivés de monocytes par ces virus porteurs de glycoprotéines exogènes VSV-G ou du VIH-1 a entraîné une production de luciférase significativement moindre dans les cellules exposées à des globules rouges parasités. Il est à noter que les virus pseudotypés VSV-G ont produit une activité luciférase nettement plus élevée que leurs homologues JRFL, en raison de l'efficacité infectieuse supérieure des particules pseudotypées VSV-G.Cette technique permettra aux chercheurs spécialisés dans le paludisme et les infections à VIH de mieux explorer les interactions entre ces deux agents pathogènes à l’aide d’un modèle in vitro adaptable à l’étude de plusieurs types de cellules immunitaires.

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Le virus respiratoire syncytial humain (HRSV) peut provoquer une bronchiolite sévère chez les jeunes nourrissons. Une partie de la pathogenèse de la maladie grave du VRSL est causée par la réponse immunitaire de l’hôte. La stimulation des cellules immunitaires humaines primaires avec le HRSV fournit un système modèle rapide et reproductible pour étudier l’activation des voies inflammatoires et l’infection.

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Contrairement aux particules du VIH-1 sans cellules, les cellules T CD4 + infectées sont effectivement détectés par des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC). Ce manuscrit décrit une méthode où les cellules périphériques mononucléaires du sang (PBMC) ou des pDC isolées sont co-cultivées avec le VIH-1 des cellules T infectées par détection d'évaluer innée par les pDC évaluée par la libération de l'IFN de type I.

L&#39;évaluation de l&#39;Innate détection du VIH-1 CD4 infectés<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T par les cellules dendritiques plasmacytoïdes Utilisation d&#39;un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de co-culture.

La co-infection humaine est difficile à reproduire in vitro. Cependant, les parasites humains du paludisme peuvent facilement être cultivés in vitro, tout comme les cellules mononucléées du sang périphérique humain fraîchement isolées naturellement infectées par le VIH. Il s’agit d’un excellent modèle pour l’étude des réponses immunitaires précoces aux parasites du paludisme dans le contexte de la co-infection par le VIH.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle de mesure de réponses immunitaires contre le paludisme dans le contexte du VIH co-infection

Ce protocole décrit les méthodes de construction d’un modèle murin humanisé de moelle osseuse, de foie et de thymus avec une immunité artificielle à base de cellules souches contre l’infection par le VIH.

De cellules souches Basé Immunité Engineered contre l&#39;infection à VIH dans le modèle humanisé Souris

Infection des tissus humains avec le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) ex vivo fournit un précieux modèle 3D de la pathogenèse du virus. Nous décrivons ici un protocole pour traiter et infecter des échantillons de tissus d’amygdales humaines et des muqueuses génitales femelles avec le VIH-1 et les maintenir en culture à l’interface air-liquide.

Ex Vivo Infection de la muqueuse génitale humain tissu lymphoïde et femelle avec le Virus de l’immunodéficience humaine 1 et Histoculture

Présenté ici est un protocole optimisé pour isoler, cultiver, transfecter, et différencier les monocytes primaires humains des individus infectés par le VIH et des contrôles sains.

Isolement, transfection et culture des monocytes humains primaires

Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour aider à élucider les mécanismes de l’immunité cellulaire à Plasmodium pendant le stade sanguin de l’infection. Il s’agit d’un test in vitro qui mesure la destruction des globules rouges infectés par les lymphocytes cytotoxiques.

In vitro Dosage de la destruction des globules rouges infectés par le plasmodium par des lymphocytes cytotoxiques

Ce protocole décrit comment la combinaison de l’infection EcoHIV avec des souris Tmem119-EGFP offre un système biologique précieux pour l’étude des altérations microgliales et des réservoirs viraux dans des modèles de rongeurs de troubles neurocognitifs associés au VIH.

Identification de cellules infectées par EcoHIV chez des souris transgéniques manipulées par la microglie

Découvrez un modèle de co-infection in vitro pour étudier l'effet de Plasmodium falciparum sur la réplication du VIH-1 dans les macrophages dérivés de monocytes humains. Cette méthode permet d'explorer les interactions entre le paludisme et le VIH.

Un In vitro Co-infection modèle pour étudier Plasmodium falciparum-VIH-1 dans les interactions de lhomme primaires dérivées de monocytes cellules immunitaires (Vidéo) | JoVE Journal

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