Name: On-Chip phénotypage endothélium inflammatoire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-21T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Découvrez une technique lab-on-a-chip pour caractériser l'inflammation des cellules endothéliales humaines sous contrainte de cisaillement. Cette méthode microfluidique permet d'étudier l'adhésion des monocytes en temps réel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par le NIH / NHLBI subvention R01 HL082689 à Scott I. Simon et Anthony G. Passerini.

1. Culture cellulaire et de préparation des supports <ol><li> Couper 3-pouces substrats circulaires à partir d&#39;un 100 x 20 mm boîte de culture de tissus (BD Falcon) en utilisant un tour. Stériliser substrats par immersion dans l&#39;éthanol à 70%. Placer dans une boîte de Pétri et les enrober de 4 ml collagène de type I (100 pg / ml) pendant 1 h à température ambiante, puis rincer avec 4 ml de PBS 1 x. </li><li> Suspendre les cellules endothéliales aortiques humaines (HAEC, le passage 4-6) à 6.5x10 5 cellules / ml et des semences en appliquant 1 ml directement sur ​​le substrat. Placer dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur et permettent aux cellules d&#39;adhérer au substrat pendant 1 heure. </li><li> Ajouter 9 ml de croissance de l&#39;endothélium moyen-2 (EGM-2) complétée avec 1x antibiotiques antimycosiques solution aux cellules. Changer les médias tous les 2 jours jusqu&#39;à ce que les cellules atteignent 90% de confluence. </li><li> Maintenir cellules THP-1 en milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de FBS et 1x antibiotiques antimycosiques solution. Au passage des cellules quand elles atteignent une densité de 10 6 cellules / ml. </li></ol> 2. Protocole Shearing portable Les cellules sont conditionnés dans une mesure cône-plaque de dispositif de cisaillement cellulaire (CDD). Indications sur l&#39;appareil et les spécifications de conception sont documentées dans le tableau 1 et figure 4. <ol><li> Préparer la CDD. Stériliser le boîtier de la chambre avec de l&#39;éthanol et rincer avec du PBS stérile. Chauffer le boîtier à 37 ° C et le niveau de sorte que le cône est perpendiculaire à la monocouche de cellules. Assembler le substrat avec les cellules à partir du fond du boîtier et définir le cône à la hauteur désirée. </li><li> Utilisation Leibovitz-15 (L-15) un milieu supplémenté avec BulletKit endothéliale que le milieu de cisaillement pour maintenir le pH approprié en l&#39;absence de CO 2. Pour stimuler l&#39;inflammation, ajouter facteur de nécrose tumorale α-(TNF-α, 0,5 ng / ml) dans le milieu de cisaillement et d&#39;injecter 6 ml dans le dispositif par l&#39;intermédiaire d&#39;une seringue reliée à un orifice d&#39;entrée, en prenant soin de ne pas introduire de l&#39;airbulles dans la chambre. </li><li> Cellules de cisaillement à une contrainte de cisaillement de forte magnitude constante (HSS, 15 dyne / cm 2) ou une contrainte de cisaillement oscillatoire (OSS, 0 ± 5 dynes / cm 2, 1 Hz) pendant 4 heures. Le SS désiré est obtenu en faisant tourner le cône au-dessus des cellules, qui est contrôlée avec précision avec un moteur micro-pas à pas, comme décrit précédemment 6 Le SS mur à la surface (τ w) est approchée par.: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq1.jpg" alt="L&#39;équation 1" /> où μ est la viscosité du milieu, ω est la vitesse angulaire du cône, et α est l&#39;angle de cône (0,5 °). L&#39;alignement du substrat avec une membrane est ajustée à l&#39;intérieur 0,05 ° par nivellement de précision et la hauteur d&#39;écartement fixé à 20 ± 10 um moyen d&#39;une jauge de profondeur pour minimiser la variation circonférentielle et radiale dans τ w. Le dispositif a été validé pour garantir les caractéristiques d&#39;écoulement laminaire. Retirer caunes de l&#39;appareil et se préparer pour l&#39;analyse de l&#39;adhésion des monocytes. </li></ol> 3. Fabrication de PDMS Microfluidique Chambre <ol><li> Obtenir moule maître pour le numéro de canal désiré microfluidique et la hauteur de canal en fonction de l&#39;application. Les caractéristiques de la conception spécifique utilisé dans ce protocole sont détaillées dans le tableau 1. La méthode pour créer ceux-ci est déjà bien documenté dans la littérature 1. En bref, le réseau de canaux a été conçu en utilisant le logiciel de CAO (Autodesk Inventor) et imprimé à 5000 dpi sur un transparent. Photorésist négatif (SU8) est filée sur une plaquette de silicium jusqu&#39;à une épaisseur de 100 microns. La transparence est recouverte et exposée à la lumière UV. Non-polymérisé de photorésist est éliminé pour générer le maître réplique positif. </li><li> Pour faire une solution PDMS mélange à base de silicone avec du silicone agent de durcissement 10:1 en poids dans un bateau peser et mélanger avec une pipette 5 ml sérologique. Veillez à ne pas racler les paroisBateau de la pesée de ne pas ajouter flocons de plastique à la solution. </li><li> Placer la galette maître dans un plat 100x15mm Petri et versez la solution PDMS dans le plat. </li><li> Couvrir le plat et le placer dans un récipient vide pendant 15 minutes pour éliminer les bulles. Après 15 minutes de prendre la boîte de Petri et enlever les bulles excès par soufflage d&#39;air doucement sur la surface. </li><li> Placez la boîte de Petri dans un four pendant 1 heure à 70 ° C. Retirer le plat et découpez les chambres microfluidiques à l&#39;aide d&#39;une lame tranchante. </li></ol> 4. Assemblée des périphériques sur Microscope <ol><li> Tournez sur la source de lumière pour microscope inversé et mis en chauffe à 37 ° C. Fixer le tube à une seringue de 10 ml et remplir d&#39;eau distillée de sorte qu&#39;il n&#39;y ait pas de bulles. Placez la seringue dans le pousse-seringue et le débit ensemble pour induire un SS de paroi de 1 dyne / cm 2. La contrainte de cisaillement de paroi (τ w) générés le long de la ligne médiane du canal est approchée en utilisant la normeéquation pour une chambre d&#39;écoulement à plaques parallèles: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq2.jpg" alt="L&#39;équation 2" /> où μ est la viscosité du milieu, Q est le débit volumétrique, h est la hauteur du canal, et w est la largeur de canal note:. depuis les canaux sont de largeur finie de la réelle τ w varie avec w en fonction du canal rapport d&#39;aspect, et les mesures sont évités à 25% plus proche des parois latérales. 1,7 </li><li> Placez PDMS chambre dans l&#39;eau et utiliser une micropipette 100 pi pour éliminer l&#39;air à partir des canaux individuels. Fixer l&#39;adaptateur à vide à la chambre de faire en sorte que la vanne est mise hors service. </li><li> Placez boîte de Pétri avec monocouche OAB sur l&#39;objectif. Placez la chambre PDMS sur la boîte de Pétri et mettez sur la monocouche OAB, tout en assurant qu&#39;aucune bulle d&#39;air se forment entre l&#39;appareil et la monocouche. Tournez la vanne de sorte que le vide est en marche et la chambre est fermement attaché. </li&gt; <li> Couper 19 aiguille de calibre émousser telle qu&#39;il n&#39;y a qu&#39;un 5 mm de gauche métallique. Remplissez le réservoir en plastique avec un tampon et de mettre en PDMS chambre d&#39;entrée. Répétez l&#39;opération pour un nombre approprié de canaux qui seront utilisés. Fixer le tube de pompes à seringues pour PDMS exits de canal. </li></ol> 5. Essai d&#39;adhérence des monocytes sous contrainte de cisaillement <ol><li> Suspendre cellules THP-1 à 2x10 6 cellules / ml dans du HBSS + Ca 2 + / Mg 2 + HSA + 0,1%. Activer cellules THP-1 par l&#39;incubation avec le facteur-1 dérivé stromal (SDF-1, 50 pg / ml) pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Activer la pompe à seringue pour établir un flux, puis ajouter 50 ul de la suspension cellulaire au réservoir sans introduire de bulles d&#39;air. Une fois le débit est pleinement développé, commencez d&#39;acquisition de données. </li><li> Course à 5 min à un débit approprié, ajout d&#39;un tampon dans le réservoir si la solution est faible. Continuer coule dans les canaux mémoire tampon pour laver toutes les cellules non liées dans le flux. </li></ol> 6. Acquisition et analyse des données <ol><li> Acquérir des séquences d&#39;images numériques à 3 images / s pendant 2 min à la suite d&#39;écoulement entièrement développé le long de l&#39;axe longitudinal du canal à 3 endroits dans le canal, en prenant soin de ne pas enregistrer immédiatement après l&#39;entrée ou avant des orifices de sortie ou dans les 25% plus proche du côté murs. </li><li> Comptez le nombre de cellules arrêtées par champ en identifiant leur phase brillante apparition dans le même plan focal que la monocouche. </li><li> Arrestation cellule ferme est définie par le mouvement &lt;diamètre des cellules ½ en 10 s. Les données moyennes de plus de 3 champs aléatoires / canal et de quantifier l&#39;aide du logiciel ImageJ. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Bien que l&#39;endothélium vasculaire est uniformément exposée à des agonistes qui contribuent à l&#39;inflammation systémique, l&#39;athérosclérose est une maladie focale qui se développe préférentiellement sur ​​les sites de perturbation de débit dans les artères, impliquant l&#39;hétérogénéité spatiale de la fonction endothéliale. 8 </sup&gt; circulants médiateurs inflammatoires tels que le TNF-α sont élevés dans le sérum humain en situation de stress métabolique et en corrélation avec la fonction endothéliale altérée. 9, 10 TNF-α induit une réponse bien caractérisé en CE qui inclut la régulation positive de molécules d&#39;adhésion cellulaire (CAM ; par exemple de VCAM-1, ICAM-1, E-sélectine) et des chimiokines qui recrutent les monocytes de la circulation, une caractéristique de la lésion athéroscléreuse début 11 Hémodynamique est un régulateur important de phénotype inflammatoire endothéliale 12 niveau élevé de stress de cisaillement ampleur (HSS..; p.ex. 15 dynes / cm 2) ou des contraintes de cisaillement pulsatile (PSS; par exemple 15 ± 5 dynes / cm 2) associé à des sites de résistance à l&#39;athérosclérose dans les artères réguler à la baisse du TNF-α-réponses induites. A l&#39;inverse, faible niveau de stress de cisaillement grandeur (LSS; par exemple 2 dynes / cm 2) ou de cisaillement oscillatoire (OSS; par exemple, 0 ± 5 dynes / cm 2), les caractéristiques des sites sensibles in vivo, exacerbent cytokine l&#39;inflammation induite par. 13, 14 microfluidiques Nos appareils PDMS fournir une plateforme pour la réalisation d&#39;études mécanistiques de tester des hypothèses liées à la superposition de stress métabolique avec des facteurs hydrodynamiques dans la régulation de la fonction endothéliale et de la pathologie. L&#39;utilité et la polyvalence de l&#39;approche est largement illustré par les résultats représentatifs suivants. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. La contrainte de cisaillement module différentiellement adhérence THP-1 de cellules au TNF-alpha enflammées monocouches endothéliales. Ces données ont été acquises en utilisant le protocole détaillé ci-dessus décrit et documenté dans la vidéo. Monocouches OAB ont été simultanément exposés à une faible dose de la cytokine inflammatoire TNF-α (0,5 ng / ml, ~ CE 50 pour VCAM-1 up-régulation) et soit HSS (15 dynes / cm 2) ou OSS (0 ± 5 dynes / cm 2, 1 Hz) dans un CDD personnalisé pendant 4 heures comme descrilit dans le protocole détaillé. THP-1 arrestation cellules a été quantifiée dans un écoulement de cisaillement dans une chambre d&#39;écoulement PDMS. Cette lignée cellulaire qui imite le phénotype des monocytes humains a été choisi pour sa reproductibilité et sa facilité d&#39;utilisation. HSS atténué la réponse inflammatoire par rapport à l&#39;OSS, ayant entraîné un arrêt des cellules THP-1 a diminué. Les données ont été analysées par Student-test et sont représentées en moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. Adapté avec la permission de DeVerse et al. 5 Les données suivantes démontrent la polyvalence de notre approche en utilisant des exemples de notre travail publié. Départs à partir du protocole ci-dessus sont indiquées le cas échéant. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. La modulation de cytokine induite par l&#39;expression de VCAM-1 et le recrutement des monocytes dans un gradient de contrainte de cisaillement. A) monocouches OAB ont été stimulées par le TNF-α (0,3 ng / ml) pendant 4 heures sous flow dans un VMMC conçue sur la base de la théorie d&#39;écoulement de Hele-Shaw. 15 A diminution linéaire de grandeur SS le long de la ligne médiane du canal a été obtenue en concevant les parois latérales de la chambre de manière à coïncider avec les lignes de courant d&#39;un flux à deux dimensions et la stagnation de mise en forme l&#39;extrémité du canal pour correspondre aux lignes d&#39;iso-potentiels. La contrainte de cisaillement de paroi (τ w) générés le long de la ligne centrale de ce canal à une distance axiale de l&#39;entrée (x) est donnée par: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq3.jpg" alt="L&#39;équation 3" /> où μ est la viscosité du milieu, Q est le débit volumétrique, h est la hauteur du canal, w 1 est la largeur de canal d&#39;entrée, et L est la longueur totale du canal. Q est choisi pour générer un gradient de grandeur SS de 16 dynes / cm 2 à l&#39;entrée à 0 au point de stagnation &quot;a&quot; juste en amont de l&#39;outlet. B) à C) l&#39;expression de VCAM-1 a été mesurée in situ par immunofluorescence en utilisant des anticorps conjugués à des points quantiques et présenté comme intensité de la fluorescence pourcentage médian (MFI) de contrôle statique non stimulé. SS n&#39;a pas de moduler le niveau basal de VCAM-1, qui est faible en non stimulées OAB (triangles gris). Toutefois, l&#39;expression de VCAM-1 a augmenté par rapport au TNF-α à des amplitudes LSS, avec un pic à ~ 2 dynes/cm2 et le retour à la ligne de base du TNF-α ou au-dessous des magnitudes de cisaillement&gt; 5 dynes / cm 2 (carrés noirs). D) monocytes (10 6 / ml) ont été perfusés à 2 dynes/cm2 pendant 5 min dans des canaux d&#39;écoulement parallèles sur des monocouches préconditionnés comme dans A). Le recrutement des monocytes à l&#39;endothélium quantitativement corrélée à la VCAM-1 &#39;expression d&#39;une magnitude contrainte de cisaillement donné. Notamment, la capacité de sonder l&#39;expression de VCAM-1 et le recrutement des monocytes avec une résolution spatiale fine dans un monolayer ont révélé des changements significatifs au cours d&#39;une gamme étroite de grandeur SS qui ne seraient pas appréciés en appliquant seulement quelques valeurs discrètes de cisaillement dans des expériences séparées. Les données ont été analysées par ANOVA mesures répétées et les différences évaluées par post-test de Newman-Keuls, * P &lt;0,05 à partir de TNF-α dans des conditions statiques. Les données sont la moyenne ± SEM de 3-6 expériences indépendantes. Adapté avec la permission de Tsou et al. 2 <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Lipoprotéines riches en triglycérides (TGRL) moduler l&#39;inflammation induite par les cytokines en proportion à des niveaux de triglycérides sériques et donateurs de VCAM-1 expression. Monocouches OAB ont été stimulées par le TNF-α (0,3 ng / ml) pendant 4 heures en même temps que TGRL (10 mg / dl ApoB) isolés à partir des sujets humains après un repas riche en graisses en culture statique. A) l&#39;expression de VCAM-1 a été mesurée séparément dans suspendue CE par cytométrie en fluxet l&#39;adhésion des monocytes quantifiée en utilisant un VMMC tel que décrit dans le protocole détaillé. Les données sont présentées comme variation en% par le TNF-α. Arrestation des monocytes varié en proportion directe de l&#39;endothélium expression de VCAM-1, qui a augmenté directement avec le niveau de triglycérides de sérum de donneur. B) L&#39;arrestation des monocytes pour un sous-ensemble de pro-inflammatoires donneurs a été abrogée en la présence d&#39;un VCAM-1 anticorps bloquant. La signification a été déterminée par jumelé t de Student-test, des moyens ± SEM de 3-5 expériences indépendantes. Adapté avec la permission de Wang et al. 4

<ol><li>Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+mimetics+based+on+microfluidics+for+imaging+the+leukocyte--endothelial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response.</a> Lab Chip. 7, 448-456 (2007).</li>
<li>Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+inflammation+by+human+aortic+endothelial+cells+in+a+linear+gradient+of+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress.</a> Microcirculation. 15, 311-323 (2008).</li>
<li>Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglyceride-rich+lipoproteins+prime+aortic+endothelium+for+an+enhanced+inflammatory+response+to+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha.</a> Circ. Res. 100, 381-390 (2007).</li>
<li>Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+inflammation+correlates+with+subject+triglycerides+and+waist+size+after+a+high-fat+meal%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).</li>
<li>Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+modulates+rage-mediated+inflammation+in+a+model+of+diabetes-induced+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).</li>
<li>Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+endothelial+phenotypes+evoked+by+arterial+waveforms+derived+from+atherosclerosis-susceptible+and+-resistant+regions+of+human+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14871-14876 (2004).</li>
<li>Young, E. W., Wheeler, A. R., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-dependent+adhesion+of+vascular+and+valvular+endothelial+cells+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Matrix-dependent adhesion of vascular and valvular endothelial cells in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7, 1759-1766 (2007).</li>
<li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Guerraty, M. A., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+heterogeneity+associated+with+regional+athero-susceptibility+and+adaptation+to+disturbed+blood+flow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Endothelial heterogeneity associated with regional athero-susceptibility and adaptation to disturbed blood flow in vivo.</a> Semin Thromb Hemost. 36, 265-275 (2008).</li>
<li>Burdge, G. C., Calder, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cytokine+response+during+the+postprandial+period%3A+A+potential+causal+process+in+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Plasma cytokine response during the postprandial period: A potential causal process in vascular disease.</a> Br. J. Nutr. 93, 3-9 (2005).</li>
<li>Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inflammation and metabolic disorders.</a> Nature. 444, 860-867 (2006).</li>
<li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inflammation in atherosclerosis.</a> Nature. 420, 868-874 (2002).</li>
<li>Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+shear+stress+and+atherosclerosis%3A+A+matter+of+site+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity.</a> Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).</li>
<li>Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+increases+icam-1+and+decreases+vcam-1+and+e-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-%5Balpha%5D+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).</li>
<li>Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).</li>
<li>Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+construction+of+a+linear+shear+stress+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Design and construction of a linear shear stress flow chamber.</a> Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).</li>
<li>Helmke, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+cytoskeletal+mechanics+by+hemodynamic+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Molecular control of cytoskeletal mechanics by hemodynamic forces.</a> Physiology (Bethesda). 20, 43-53 (2005).</li>
<li>Gower, R. M., Wu, H., Foster, G. A., Devaraj, S., Jialal, I., Ballantyne, C. M., Knowlton, A. A., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd11c%2Fcd18+expression+is+upregulated+on+blood+monocytes+during+hypertriglyceridemia+and+enhances+adhesion+to+vascular+cell+adhesion+molecule-1%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cd11c/cd18 expression is upregulated on blood monocytes during hypertriglyceridemia and enhances adhesion to vascular cell adhesion molecule-1.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 160-166 (2011).</li>
<li>Wu, H., Gower, R. M., Wang, H., Perrard, X. Y., Ma, R., Bullard, D. C., Burns, A. R., Paul, A., Smith, C. W., Simon, S. I., Ballantyne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+cd11c%2B+monocytes+in+atherogenesis+associated+with+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia.</a> Circulation. 119, 2708-2717 (2009).</li>
<li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+Review+of+scientific+instruments%22%5BJournal%5D)">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous décrivons l&#39;utilisation de dispositifs microfluidiques en PDMS pour l&#39;évaluation sur la puce du phénotype inflammatoire endothéliale par le biais de l&#39;imagerie en temps réel de l&#39;expression CAM et l&#39;adhésion des monocytes. Un avantage majeur de notre approche réside dans la capacité à quantifier les résultats associés à une dysfonction endothéliale dans les cellules exposées à des médiateurs inflammatoires tels que les lipides alimentaires et des cytokines dans des conditions hydrodynamiques déf...

<table border="1"><tbody><tr><td> Point </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> 100 x 20mm boîtes de Pétri </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Éthanol à 95% </td><td> EMD Chemicals </td><td> EX0290-1 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> Collagène de type I Rat Tail dérivé </td><td> Gibco </td><td> A10483-01 </td></tr><tr><td> L&#39;homme les cellules endothéliales aortiques </td><td> Genlantis </td><td> PH30405A </td></tr><tr><td> Antibiotiques antimycosique Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> BulletKit endothéliale </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Endothéliales basales médias-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td></tr><tr><td> 10 Seringues ml </td><td> BD Falcon </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Tubes en polyuréthane </td><td> Tygon </td><td> ABW0001 </td></tr><tr><td> Leibovitz-15 avec les médias </td><td> Gibco </td><td> 11415-069 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 base d&#39;élastomère de silicone </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Durcisseur silicone élastomère </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> SU8 Wafer Maître Photoresist </td><td> UC Davis Pan Lab </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Eclipse TE200 microscope inversé </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE200 </td></tr><tr><td> Pousse-seringue </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD2000 </td></tr><tr><td> 19 aiguille hypodermique jauge </td><td> Kendall </td><td> 8881 </td></tr><tr><td> THP-1 lignée de cellules monocytaires </td><td> ATCC </td><td> TIB-202 </td></tr><tr><td> HBSS (Hanks solution saline tamponnée) avec le Ca 2 + / Mg 2 + </td><td&gt; Gibco </td><td> 14025-092 </td></tr><tr><td> Facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> Stromale facteur dérivé - 1 (SDF-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 350-NS-010 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040-CV </td></tr><tr><td> Albumine sérique humaine (HSA) </td><td> ZLB Behring </td><td> NDC 0053-7680-32 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Réactifs et équipements spécifiques.

on-chip phénotypage endothélium inflammatoire

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Athérogénèse est potentialisée par des anomalies métaboliques qui contribuent à un état d&#39;inflammation systémique résultant dans la dysfonction endothéliale. Cependant, les premiers changements fonctionnels dans l&#39;endothélium qui signifient au niveau d&#39;un individu de risque ne sont pas directement évaluée en clinique pour aider à la stratégie de guide thérapeutique. En outre, la régulation de l&#39;inflammation par l&#39;hémodynamique locale contribue à la distribution spatiale non aléatoire de l&#39;athérosclérose, mais les mécanismes sont difficiles à délimiter in vivo. Nous décrivons une approche de laboratoire-sur-une-puce basée sur la perturbation métabolique de déterminer quantitativement les événements inflammatoires dans les cellules endothéliales humaines (CE) et des monocytes dans des conditions d&#39;écoulement précis. Les méthodes standard de lithographie douce sont utilisés pour microfabricate vasculaires mimétiques chambres microfluidiques VMMC), qui sont directement liés à la culture des monocouches de la CE. 1 Ces dispositifs ont l&#39;avantage d&#39;utiliser de petits volumes de réactifs, tout enfournir une plate-forme pour l&#39;imagerie directement les réactions inflammatoires à la membrane de CE exposé à un champ de cisaillement bien définie. Nous avons appliqué avec succès ces dispositifs pour étudier les cytokines, 2 lipidique-3, 4 et 5 RAGE-induite dans l&#39;inflammation humaine aortique CE (AHCE). Ici, nous documenter l&#39;utilisation de la VMMC à la cellule de dosage monocytaire (THP-1) de roulement et à l&#39;arrestation sur des monocouches de HAEC qui sont conditionnés selon des caractéristiques de cisaillement différentielles et activé par la cytokine inflammatoire TNF-α. Des études comme celles-ci fournissent une approche mécanistique dans atherosusceptibility sous facteurs de risque métaboliques.

Chambres d&#39;écoulement microfluidiques gravés par photolithographie et fabriqué à partir de PDMS sont appliqués à sonder les résultats fonctionnels associés à une dysfonction CE et de l&#39;inflammation. Dans une expérience représentative, la capacité de contrainte de cisaillement différentiel de moduler l&#39;adhésion cellulaire monocytaire à cytokine activé monocouches CE est démontrée.

On-Chip phénotypage endothélium inflammatoire

L'athérogénèse est potentialisée par des anomalies métaboliques qui contribuent à un état d'inflammation systémique accrue, entraînant une dysfonction endothéliale...

L'objectif de cette vidéo est de présenter une technique de laboratoire sur puce permettant de caractériser l'état inflammatoire des cellules endothéliales. Pour commencer, des cellules endothéliales aortiques humaines sont cultivées jusqu'à confluence sur un substrat adapté à la culture tissulaire, puis insérées dans un dispositif de cisaillement de type plaque Conan. Les cellules sont traitées avec le cytokine pro-inflammatoire TNF alpha et simultanément exposées à des conditions contrôlées de contrainte de cisaillement pendant quatre heures, grâce à une rotation précise du cône situé au-dessus du substrat. La contrainte de cisaillement module ainsi une réponse inflammatoire bien documentée induite par le cytokine.Cela inclut la surrégulation de molécules d’adhérence telles que VCAM-1 et ICAM-1. Le substrat est transféré sur la platine d’un microscope, où un dispositif microfluidique A-P-D-M-S est scellé sous vide directement sur la monocouche, créant ainsi des canaux d’écoulement. Des cellules monocytaire activées, lignée THP-1, sont acheminées sur le hs préconditionné, où elles s’attachent en proportion du niveau d’expression des molécules d’adhérence cellulaire.L'état inflamma

on-chip-endothelial-inflammatory-phenotyping

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Dans cette vidéo, nous démontrons la visualisation en temps réel des interactions cellules sanguines-endothéliales dans les veines mésentériales d’un modèle murin injecté par voie intrapéritonéale avec du lipopolysaccharide.

Microscopie intravitale pour analyser les interactions cellules sanguines-endothéliales dans un modèle murin d’inflammation

Endothélium vasculaire contrôle étroitement le recrutement des leucocytes. Extravasation de leucocyte inadéquate contribue aux maladies inflammatoires humaines. La recherche de nouveaux éléments régulateurs d’activation endothéliale est donc nécessaire de concevoir des traitements améliorés pour troubles inflammatoires. Nous décrivons ici une méthodologie globale afin de caractériser les nouveaux régulateurs endothéliales qui peuvent de modifier leucocytes traite au cours de l’inflammation.

Dépistage des essais pour caractériser les nouveaux régulateurs endothéliales impliqués dans la réponse inflammatoire

Ce protocole étape par étape fournit une description détaillée du montage expérimental et analyse des données pour l’évaluation des réponses inflammatoires hiPSC-ECs et l’analyse de l’adhérence des leucocytes dans un écoulement physiologique.

Microfluidique analyse pour l’évaluation de l’adhésion leucocytaire à humaine Induced Pluripotent Stem Cell dérivé des cellules endothéliales (hiPSC-ce)

Le développement des événements cardio-vasculaires défavorables principaux, qui affectent le pronostic cardio-vasculaire après l'angioplastie coronaire, sont influencés par l'ampleur des dommages coronaires et de la réparation vasculaire. L'utilisation de nouveaux biomarqueurs cellulaires et solubles coronaires, réactifs aux dommages et à la réparation vasculaires, sont utiles pour prévoir le développement des MACE et du pronostic.

Cellules de progéniture coronaire et biomarqueurs solubles dans le pronostic cardio-vasculaire après angioplastie coronaire

Les organoïdes intestinaux dérivés de la biopsie et les technologies d’organes sur puce sont combinés dans une plate-forme microphysiologique pour récapituler la fonctionnalité intestinale spécifique à la région.

Combinaison d’organoïdes humains et de la technologie Organ-on-a-Chip pour modéliser des fonctionnalités spécifiques à la région intestinale

Ici, nous décrivons un protocole, la méthode de culture cellulaire endothéliale étendue (EECM), qui permet de différencier les cellules souches pluripotentes en cellules de type cellule endothéliale microvasculaire cérébrale (BMEC). Ces cellules présentent l’expression de molécules d’adhésion cellulaire endothéliale et constituent donc un modèle de barrière hémato-encéphalique humain adapté à l’étude des interactions entre cellules immunitaires in vitro.

Différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme en cellules endothéliales microvasculaires cérébrales de type phénotype avec un phénotype immunitaire mature

Isotachophorèse (PTI) est une séparation solide électrocinétique et de la technique de préconcentration avec des applications allant de la détection de la toxine à la préparation des échantillons. Nous passons en revue les principes physiques de l'ITP et la méthodologie de l'application de cette technique à deux exemples d'applications spécifiques: la séparation et la détection de petites molécules et de purification des acides nucléiques à partir de lysat de culture cellulaire.

Sur la puce isotachophorèse pour la séparation des ions et purification des acides nucléiques

Lensfree tomographie optique est une technique de microscopie en trois dimensions qui offre une résolution spatiale de moins de 1 um × &lt;1 um x &lt;3 microns en x, y et z dimensions, respectivement, au cours d'une imagerie grand volume de 15-100...

Lensfree sur puce microscopie tomographique Employant multi-angle d&#39;éclairage et de Pixel Super-résolution

Les caractéristiques mécaniques du glycocalyx endothéliale ont été mesurées par indentation à l'aide des sphères micrométriques sur des cantilevers AFM. Les cellules endothéliales ont été cultivées dans une chambre de mesure dans des conditions physiologiques de flux pour induire l'expression glycocalyx. Les données ont été analysées en utilisant un modèle de film mince pour déterminer l'épaisseur et le module glycocalyx.

Quantification des propriétés mécaniques de la Glycocalyx endothéliale par microscopie à force atomique

Nos objectifs étaient de concevoir, fabriquer et tester stents ferromagnétiques pour la capture des cellules endothéliales. Dix stents ont été testés pour la fracture et 10 autres stents ont été testés pour le magnétisme retenu. Enfin, 10 stents ont été testés in vitro et 8 autres stents ont été implantés dans 4 porcs pour montrer capture et la conservation cellule.

Ferromagnétique Bare Metal Stent pour endothéliale capture de cellules et de la conservation

Découvrez une technique lab-on-a-chip pour caractériser l'inflammation des cellules endothéliales humaines sous contrainte de cisaillement. Cette méthode microfluidique permet d'étudier l'adhésion des monocytes en temps réel.

On-Chip phénotypage endothélium inflammatoire

Explorer plus de vidéos