On-Chip phénotypage endothélium inflammatoire

L’objectif de cette vidéo est de faire la démonstration d’une technique de laboratoire sur puce pour caractériser l’état inflammatoire des cellules endothéliales. Pour commencer, les cellules endothéliales aortiques humaines sont cultivées jusqu’à la confluence sur un substrat de culture tissulaire, puis insérées dans un dispositif de cisaillement à plaque Conan. Les cellules sont traitées avec la cytokine pro-inflammatoire, TNF alpha, et exposées simultanément à des conditions de stress de cisaillement différentiel pendant quatre heures en contrôlant avec précision la rotation du cône au-dessus du substrat

Cela inclut la régulation à la hausse des molécules d’adhésion telles que VCA one et ICAM one. Le substrat est transféré sur une platine de microscope où le dispositif microfluidique A-P-D-M-S est scellé sous vide directement sur la monocouche, créant ainsi des canaux d’écoulement. Monocytaires activées, les cellules THP one sont transportées au-dessus des hs préconditionnés, où elles se lient proportionnellement au niveau d’expression de la molécule d’adhésion cellulaire.

L’état inflammatoire de l’endothélium est déterminé en quantifiant le nombre total de cellules THP qui sont fermement arrêtées. Bonjour, je m’appelle D Diverse et je m’appelle Greg Foster. Et je suis Keith Bailey.

Nous sommes dans les laboratoires des professeurs, du pasteur et de Simon au Département de génie biomédical de l’Université de Californie à Davis. Aujourd’hui, nous allons décrire l’utilisation d’une approche basée sur un laboratoire sur puce pour examiner quantitativement le dysfonctionnement endothélial et l’inflammation. Ces outils nous fournissent une plate-forme pour mener des études liées à la superposition du stress métabolique avec des facteurs hydrodynamiques et à la régulation du phénotype inflammatoire endothélial et de la susceptibilité à l’athérosclérose.

C’est pourquoi nous appelons nos dispositifs des chambres microfluidiques mimétiques, vasculaires, ou vmmc. Ces dispositifs nous permettent de quantifier les résultats inflammatoires dans les cellules endothéliales et les monocytes dans des conditions qui imitent celles des vaisseaux athérogènes. Le VMMC facilite l’utilisation de petites quantités de réactifs ou de matériaux qui peuvent être en quantité limitée.

Ils peuvent également être construits dans un certain nombre de dispositions et de géométries personnalisables, ce qui les rend très adaptés à une vaste gamme d’applications. Aujourd’hui, nous allons faire la démonstration d’une expérience représentative en utilisant notre approche de laboratoire sur puce. Les monocouches endothéliales humaines seront exposées à l’activation des cytokines sous des contraintes de cisaillement bien définies.

Nous démontrerons l’utilisation de la VMC pour quantifier le recrutement de cellules monocytaires humaines dans la monocouche en temps réel en tant que lecture fonctionnelle de l’activation endothéliale à l’aide d’un tour Des substrats circulaires de trois pouces sont fraisés à partir de boîtes de culture tissulaire de 100 millimètres. Les substrats de trois pouces sont lavés à l’eau distillée, puis stérilisés par trempage dans de l’éthanol à 70 %. Les substrats stériles sont placés dans des boîtes de Pétri de 100 millimètres et laissés sécher.

Ils sont ensuite incubés avec du collagène de type 1 à une concentration de 100 microgrammes par millilitre pendant une heure à température ambiante et lavés avec du PBS. Les cellules endothéliales aortiques humaines ou AH sont en suspension à une concentration de 650 000 cellules par millilitre. Un millilitre de suspension cellulaire est placé en gouttelettes sur un substrat enduit de collagène séché et étalé dans une suspension uniforme.

Les substrats assis sont ensuite placés dans un incubateur à 37 degrés 5 % de CO2 et laissés se fixer à la surface du substrat. Après une heure, neuf millilitres de croissance de E GM deux, un milieu est ajouté et les cellules sont autorisées à se développer en monocouches à environ 90 % de fluidité Co. Les chambres microfluidiques mimétiques vasculaires sont construites en versant un moule A-P-D-M-S sur une forme maîtresse comprenant le canal souhaité. Géométrie.

La base en silicone est versée dans un bateau en plastique, suivie de l’agent de durcissement à base de silicone dans un rapport de 10 pour un en poids. Le gel PDMS est ensuite bien mélangé, en prenant soin de ne pas gratter les côtés du bateau, et en introduisant ainsi des copeaux de plastique dans le mélange. Les masters photoresist sont nettoyés à l’hexane et préparés pour mouler le VMMC.

Le mélange PDMS est ensuite versé sur la forme maîtresse, puis placé dans une chambre à vide. Dans la chambre. L’air est retiré du mélange PDMS et remonte à la surface après 15 minutes.

Le moule est retiré de la chambre et l’air est soufflé doucement sur la surface du PDMS pour purger les bulles d’air restantes du moule. Le moule est ensuite recouvert et placé dans un four à 37 degrés pendant une heure où le PMS est autorisé à durcir. Retirez le gel PDMS solidifié du four et faites des incisions circulaires autour de la chambre à l’aide d’un petit scalpel.

Il est crucial de le faire progressivement pour éviter tout contact avec le matériau photorésistant, car cela endommagerait le moule maître. Excisez la chambre microfluidique des orifices d’entrée et de sortie du poinçon du moule pour chaque canal à l’aide d’une aiguille de verrouillage de leurre de calibre 19. De plus, percez des trous pour les tubes à vide loin des canaux.

La préparation du CMVM est maintenant terminée. Pipetez la cytokine pro-inflammatoire TNF alpha dans six millilitres de milieu L 15 pour obtenir une concentration finale de 0,5 nanogramme par millilitre. Le média L 15 est utilisé ici comme fluide de cisaillement en raison de sa capacité tampon de pH en l’absence de 5 % de CO2.

Le milieu est ensuite aspiré dans une seringue stérile de 10 millilitres, qui est utilisée pour charger le dispositif de cisaillement. La monocouche Confluent est ensuite transférée dans le dispositif de cisaillement cellulaire, qui a été stérilisé avec de l’éthanol nivelé et la hauteur de l’espace du cône a été réglée. Le substrat est retiré de la boîte de Pétri et placé sur le bloc de jauge en verre centré et soigneusement inséré dans le fond de la chambre de logement, de sorte que le cône se trouve directement au-dessus des cellules.

Le substrat est fixé en serrant uniformément des vis en acier inoxydable autour du bloc de jauge. Le média de cisaillement est ensuite chargé dans la chambre, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air. Ensuite, un ordinateur est utilisé pour entrer le programme de contrainte de cisaillement souhaité et le micro-moteur séparé est mis en marche.

Ici, nous utilisons un cisaillement oscillatoire de zéro, plus ou moins cinq dinés par centimètre carré. Après quatre heures, le programme de tonte est arrêté. Le bloc de jauge est retiré et le substrat est soigneusement remis dans la boîte de Pétri.

Les cellules sont maintenant prêtes pour le test d’adhésion des monocytes. Immédiatement après le cisaillement, les monocouches d’AH sont transportées à la station de microscope pour l’assemblage du VMMC. Le VMMC est fixé au tuyau d’aspiration et immergé dans l’eau DI pour éliminer toutes les bulles d’air piégées dans les canaux.

Lorsque la soupape de dépression est initialement éteinte, la chambre est soigneusement pressée sur le dessus de la monocouche et la soupape de vide est activée. Il est essentiel ici de s’assurer qu’aucune bulle d’air n’a été piégée dans les canaux de la chambre. Maintenant, 80 microlitres de HBSS avec du calcium et du magnésium sont pipetés dans un réservoir fabriqué en coupant la pointe d’un leurre de calibre 19 Le liquide de l’aiguille de verrouillage est poussé hors de la pointe en appuyant fermement sur le haut du réservoir, qui est ensuite inséré dans l’orifice d’entrée du VMMC.

L’ensemble est placé sur la platine du microscope et la caméra du microscope et le moniteur vidéo sont allumés. Une seringue en verre de 10 millilitres est chargée sur le pousse-seringue. Ensuite, le tube de la seringue est connecté à l’orifice de sortie du VMMC.

Le débit est réglé de manière à induire une contrainte pure d’un dîner par centimètre carré dans le canal, puis fonctionne en mode de remplissage de sorte que la seringue tire le fluide du réservoir à travers le canal. Les cellules P one stimulées par SDF one sont suspendues à une concentration de 2 millions de cellules par millilitre. Dans les deux minutes suivant l’activation du flux, 50 microlitres de suspension cellulaire sont ajoutés au réservoir.

Encore une fois, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air lors du développement complet de l’écoulement. La vidéo est capturée à trois images par seconde et les données sont énumérées à l’aide du logiciel Image J. Adhérent. Les cellules THP one sont définies comme ne déplaçant pas plus d’un demi-diamètre de cellule en 10 secondes.

Ici, nous démontrons : Les données décrivant l’adhérence de THP un aux monocouches ha stimulées par le TNF alpha et conditionnées soit sous une contrainte de cisaillement constante à paroi élevée de 15 dilines par centimètre carré, soit à une contrainte de cisaillement oscillatoire de zéro, plus ou moins cinq dilines par centimètre carré ha Les monocouches conditionnées par une contrainte de cisaillement oscillatoire ont montré un recrutement TP une cellule trois fois plus important par rapport aux monocouches qui ont subi une contrainte de cisaillement élevée. Aujourd’hui, nous démontrons l’utilisation de techniques in vitro personnalisables qui peuvent être combinées pour fournir des informations importantes sur les événements inflammatoires précoces sous-jacents à l’athérosclérose. Plus précisément, nous quantifions les résultats associés à la dysfonction endothéliale et aux cellules exposées à des stimuli inflammatoires dans des conditions hydrodynamiques bien définies.

L’utilisation de VMM CS nous permet d’examiner des mécanismes spécifiques sous-jacents aux interactions d’adhésion endothéliale et leucocytaire. Ces dispositifs ont également l’avantage d’être flexibles et peu coûteux et facilitent l’utilisation de matériaux dont l’approvisionnement peut être limité, tels que les composants dérivés du sérum provenant de sujets humains. Nos études utilisant ces dispositifs ont inclus des études sur les cytokines, les lipides et l’inflammation induite par la rage dans les cellules endothéliales.

Nous avons également mis au point des tests sur puce examinant les mécanismes d’adhésion dans plusieurs types de leucocytes ainsi que dans le sang total. En fin de compte, nous prévoyons que cette technologie conduira à des approches ex vivo pour évaluer le risque d’un individu de maladie cardiovasculaire induite par l’inflammation.