Traitement post-production des fibres électrofilées de génie tissulaire

L'objectif de cette procédure est de produire des échafaudages biodégradables obtenus par électrofilage, pouvant être stérilisés et suffisamment épais, avec une résistance mécanique appropriée pour l'ingénierie tissulaire clinique. Cela est réalisé en premier lieu par l'électrofilage de polymères biodégradables en architectures primaires, soit aléatoires, soit alignées et orientées ou superposées séquentiellement. La deuxième étape consiste à appliquer des modifications post-électrofilage aux échafaudages en assemblant plusieurs couches et en les stérilisant.

Ensuite, les cellules sont introduites dans les échafaudages et leur comportement pendant et après la culture est évalué. La dernière étape consiste à soumettre les cellules à un régime d'exercice afin de simuler le stress physiologique qu'elles rencontreront dans l'organisme, et ainsi les préparer à la transplantation. En fin de compte, on peut évaluer la réponse des cellules à l'exercice en mesurant la matrice extracellulaire qu'elles produisent en réponse à une tension dynamique.

Cette technique est polyvalente et souple, permettant de fabriquer une grande variété de supports dont les propriétés sont spécifiquement modifiées en fonction de l'application requise. Par exemple, les supports peuvent être conçus pour traiter des affections complexes nécessitant une réparation tissulaire, comme le remplacement d'une perte cutanée étendue chez des patients gravement brûlés ou la réparation d'une muqueuse buccale endommagée suite à un cancer ou un traumatisme. Bien que cette vidéo montre une production durable de cellules comme indicateur de stress dynamique, vous pourriez également envisager une gamme de protéines de la matrice extracellulaire et évaluer de nombreux autres aspects de la biologie cellulaire à l'aide de cellules soumises à un effort ou non.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés à obtenir des échafaudages reproductibles, car le procédé d'électrofilage est influencé par de nombreuses variables. La démonstration visuelle du traitement des échafaudages après électrofilage est importante. Ce point est rarement abordé.

Une connaissance du processus est nécessaire pour que la technique soit correctement appliquée en clinique. Commencez par recouvrir un collecteur à mandrin rotatif avec une feuille d'aluminium, le côté brillant tourné vers l'extérieur. Placez ensuite quatre seringues de cinq millilitres chargées chacune avec cinq millilitres du polymère d'intérêt.

Ici, l'acide polylactique est utilisé dans une pompe à seringue. Régler le débit à 40 microlitres par minute et par seringue, et la distance de travail à 17 centimètres entre la pointe de l'aiguille et le mandrin. Ensuite, appliquer une charge électrique de +17 000 volts aux aiguilles de la seringue et réaliser l'électrofilage à une distance appropriée sur le mandrin recouvert de papier d'aluminium afin d'obtenir des fibres alignées.

Faites tourner le mandrin à 1000 tr/min pour obtenir des fibres aléatoires. Faites tourner le mandrin à 200 tr/min. Les échafaudages électrofilés peuvent être conservés sur du papier d’aluminium dans un récipient hermétique à quatre degrés Celsius en présence d’un agent desséchant pendant au moins quatre mois après l’électrofilage du second polymère PHBV Lotus.

Encore une fois ici. La PLA a montré un dépôt en couche au-dessus du PHBV, puis utilisation des paramètres et conditions normales pour la centrifugation de ce polymère. Là encore, ce procédé additif permet de constituer une double couche de support, produisant une bicouche afin d'obtenir un support multicouche à l'aide d'un chauffage.

Placez à genoux quatre feuilles de PLGA les unes sur les autres, puis chauffez-les à genoux à 60 degrés Celsius pendant trois heures afin de produire un support multicouche par pressage à la vapeur. Versez 10 millilitres de méthane DILU ou de DCM dans un récipient de taille appropriée. Ensuite, placez quatre feuilles de PLGA les unes sur les autres et suspendez-les à deux centimètres au-dessus du DCM.

Enfin, scellez le récipient pendant une heure à température ambiante afin d'obtenir une production aseptique de l'échafaudage par électrofilage, dissolvez des polymères de qualité médicale stérilisés par incubation dans le DCM, puis réalisez l'électrofilage. Déposez par électrofilage la solution polymérique sur une feuille stérile enroulée autour d'un mandrin stérilisé. Ensuite, dans une hotte à flux laminaire stérile, incubez l'échafaudage dans un milieu de croissance sans antibiotique pendant la durée appropriée afin de vérifier la stérilité des échantillons selon la désinfection expérimentale à l'éthanol.

Placer les échafaudages dans une solution d'éthanol et d'eau distillée pendant 15 minutes. Pour la stérilisation à l'acide peracétique. Immerger les échafaudages dans une solution d'acide paracétique et de PBS pendant trois heures.

À température ambiante pour la stérilisation par rayonnement gamma, irradier les échafaudages avec une dose de trois kilogray à l’aide d’une source au césium, puis découper les échafaudages en rectangles de cinq millimètres sur 20 millimètres. Ensuite, utiliser un micromètre pour mesurer l’épaisseur des échafaudages. Puis placer les rectangles dans un appareil Bose Electro Force 3100.

Calculez le module de Young et l'élasticité à partir de la charge en fonction du déplacement, sous la forme d'une courbe contrainte-déformation tracée par l'appareil. Commencez par marquer les cellules avec un colorant fluorescent avant de semer les cellules. Incubez ensuite les fibroblastes dermiques humains à confluence dans la trypsine et l'EDTA pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, centrifuger les cellules détachées pendant 10 minutes à 150 ×g à température ambiante et resuspendre le culot dans 5 millilitres de DMEM. Après numération, ajuster la concentration cellulaire pour la mise en culture et ensemencer les cellules sur les supports. À présent, imager la surface des supports marqués à l’aide d’un microscope à fluorescence pour étudier la pénétration des cellules plus en profondeur dans les supports ; un microscope confocal multiphoton peut être utilisé.

Cela peut permettre une pénétration d'environ 200 micromètres dans la plupart des matrices, avec ou sans cellules. Ensuite, après culture des matrices ensemencées, fixer les échantillons dans un millilitre de formaldéhyde dans du PBS pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Après la fixation, laver les échantillons trois fois avec un millilitre de PBS, puis incuber chacun des échantillons dans 200 microlitres d'anticorps primaires dirigés contre l'élastine pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Lavez les échantillons trois fois supplémentaires dans un millilitre de PBS, puis incubez les échantillons dans une solution d'anticorps secondaire dans du PBS contenant du DPI pendant 30 minutes. Enfin, après avoir lavé les échantillons une dernière fois dans du PBS, observez les échantillons au microscope à fluorescence en utilisant une excitation à 365 nanomètres et une émission à 460 nanomètres pour le DPI, et une excitation à 480 nanomètres et une émission à 533 nanomètres pour l'anticorps secondaire. Stérilisez d'abord par autoclavage l'appareil de régulation du débit et le ballonnet, puis, dans une salle propre, sortez l'appareil de son emballage sous hotte à flux laminaire, en le positionnant pour l'électrofilage.

Ensuite, connectez une seringue de 50 millilitres remplie de PBS au tube latéral d’un robinet à trois voies et gonflez le ballonnet avec le PBS jusqu’à ce qu’il soit turgescent. Faites maintenant électrofiler le polymère souhaité sur le ballonnet. En utilisant les conditions normales de filage et une distance de travail de 10 centimètres, les fibres humides sont suffisamment collantes pour adhérer à la surface du ballonnet sans se détacher par la suite.

Une fois que le support est sec, placez le ballonnet dans un récipient stérile, puis transportez le récipient vers une hotte à flux laminaire adaptée à la culture cellulaire. La culture de cellules sur un support fixé sur un ballonnet distendu afin de soumettre les cellules à un conditionnement biomécanique constitue la partie la plus délicate de cette procédure. Il est essentiel de baser à plusieurs reprises le ballonnet avec la solution cellulaire afin d'attacher un nombre maximal de cellules au support.

Nous constatons que cela prend environ 20 minutes. Dans la hotte, retirez le ballonnet du récipient et placez-le sur une surface stérile, comme la boîte de Pétri utilisée ici, puis pipetez la suspension cellulaire sur le ballonnet enduit toutes les 20 secondes pendant 20 minutes afin de répartir uniformément les cellules à la surface du ballonnet. Replacez ensuite le ballonnet dans le récipient de culture et ajoutez le milieu préchauffé approprié au type cellulaire.

Enfin, connectez l'appareil d'insufflation à une pompe à seringue et insufflez et dégonflez le ballonnet selon les besoins afin d'obtenir une distension biaxiale. Une pompe à seringue contrôlée par ordinateur peut être utilisée pour réaliser un régime de distension plus complexe. L'électrofilage peut être utilisé pour créer des échafaudages présentant des architectures aléatoires et ordonnées.

Ceci est reproductible et les fibres sont uniformes. Par exemple, des fibres perpendiculaires peuvent être créées par électrofilage d'un ensemble de fibres alignées sur une feuille d'aluminium en tournant la feuille de 90 degrés, puis en effectuant immédiatement un électrofilage d'un second ensemble de fibres alignées par-dessus. De nombreux types de polymères peuvent être électrofilés avec des caractéristiques pouvant varier considérablement, comme illustré ici pour P-L-A-P-H-B-V-P-C-L et PLGA ; noter que P-L-A-P-C-L et PLGA sont tous deux des échafaudages microfibreux uniformes.

Le PHBV est filé comme un collier de perles avec des nanofibres reliant des billes de cinq à vingt microns. Ici, les supports ont d'abord été filés en utilisant du PHBV, puis les seringues ont été remplies de PLA et filées par-dessus les supports en PHBV. Ces images montrent des couches individuelles représentatives de PHBV et de PLA.

Cette image illustre l'aspect qu'une coupe transversale d'un bicouche A-P-H-B-V-P-L-A avec un collier de perles nano-fibreux denses, une couche de PHBV et une couche de PLA micro-fibreux plus ouverte pourrait présenter. Les trois types de supports favorisent l'attachement et la prolifération cellulaires. Si des supports plus épais sont nécessaires, un genouillage par vapeur et chauffage peut être utilisé pour fusionner ensemble plusieurs couches de supports, comme le montrent les quelques images suivantes. Les couches du support genouillées ne se délaminent pas, et il peut être très difficile de repérer la jonction entre les couches.

Cette image montre une coupe transversale d'un échafaudage en PLA par vapeur et agenouillé, dans lequel des échafaudages fibreux initiaux d'environ 150 microns ont été superposés. Ensuite, de la vapeur de DCM a été utilisée pour former des échafaudages nettement plus épais, atteignant jusqu'à 500 microns. Cette image présente la même section de l'échafaudage bicouche par vapeur à environ deux fois le grossissement précédent. Sur cette image, on observe que l'échafaudage se compose de couches de fibres nettement plus épaisses, dispersées parmi des couches de fibres plus fines créées par chauffage, et que l'agenouillement des couches de fibres fines et épaisses ensemble permet de produire des échafaudages aux propriétés mécaniques complexes.

Encore une fois, cette image montre le même support en éponge de chauffage agrandi quatre fois. L'agrandissement précédent par membranes superposées peut être réalisé avec différents types cellulaires, chacun étant cultivé sur une membrane séparée sans se mélanger, comme le montrent ces images de fibroblastes dermiques humains colorés avec deux colorants fluorescents traceurs cellulaires différents. La première image montre des fibroblastes sur un électrofilage en PLA.

Les cellules ont été fixées et colorées ; ici, les fibroblastes colorés avec le DAPI ont été semés sur l'électrofil de PHBV. Dans cette expérience, les fibroblastes ont été préalablement colorés avec le colorant vital Cell Tracker Green. Remarquez que les cellules se trouvent du côté PLA de la bicouche.

Cette image représente une coupe typique d’un bicouche, avec des fibroblastes marqués en rouge sur la surface inférieure de PHBV et des fibroblastes marqués en vert sur la surface supérieure de PLA. Sur cette image, les fibroblastes ont été préalablement marqués au traceur cellulaire rouge pendant leur croissance sur la surface de PHBV. Ainsi, l’utilisation de colorants fluorescents vitaux fournit une méthodologie pratique pour examiner la distribution des cellules sur un échafaudage, pendant que les cellules sont encore en cours de croissance.

La méthode de stérilisation a un impact sur le support ainsi que sur la culture cellulaire ultérieure. Ce graphique en courbes illustre les effets de l'acide paracétique, de l'irradiation gamma et de l'éthanol sur la résistance à la traction et le module de Young d'un support en PLG.

Chacune des méthodes de stérilisation modifie la résistance à la traction ultime et l'élasticité des échafaudages. La culture de cellules sur ces échafaudages réduit davantage leur contrainte de traction ultime, mais augmente leur élasticité. Ce graphique en barres illustre l'effet de la méthode de stérilisation sur le diamètre des fibres d'un échafaudage individuel.

L'irradiation gamma n'a pas d'effet significatif sur le diamètre des fibres, tandis que l'acide paracétique et l'éthanol réduisent le diamètre des fibres d'environ 50 %. Ainsi, la meilleure façon d'obtenir des échafaudages stériles consiste à les produire dans des conditions aseptiques. Cette dernière série d'images montre que les cellules restent viables pendant l'étirement dynamique et produisent également des quantités accrues d'élastine. Remarquez le développement de la couleur bleu foncé produite par les cellules en croissance, détectée à l'aide d'un indicateur métabolique MTT.

Ici, les cellules en bleu cultivées sur un ballonnet et soumises à une distension biaxiale ont développé des fibres d'élastine, comme l'indique la coloration verte. Cela contraste fortement avec l'absence d'élastine lorsque les mêmes cellules sont maintenues en conditions statiques sur un support de ballonnet identique. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le culture statique et l'écoulement de fluide des cellules dans les supports peuvent être réalisées afin d'étudier la réponse cellulaire à différentes conditions de culture.

Le développement de la culture de cellules sur un support fixé sur un ballonnet pouvant être distendu s'est révélé très utile, car il a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du génie tissulaire pour explorer désormais l'effet du conditionnement dynamique des cellules dans des constructions ingénieries tissulaires. N'oubliez pas que le travail avec des alimentations électriques à haute tension, des solvants, des lasers et des cellules humaines peut présenter des risques, et qu'une formation adéquate ainsi que des précautions appropriées doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.