Ingénierie bactéries adhérentes en créant un simple synthétique Curli Operon

L’objectif général de l’expérience suivante est de donner des propriétés adhérentes aux bactéries afin de faciliter leur séparation des milieux liquides. Ceci est réalisé en concevant d’abord un curli synthétique pour contourner la régulation génétique complexe et permettre une production facile et massive de polymères collants. Dans un deuxième temps, une bactérie adhérente est visualisée et quantifiée sur du polystyrène, ce qui permet une estimation rapide de l’efficacité du dispositif synthétique.

Ensuite, une bactérie adhérente est visualisée sur du verre par microscopie confocale. Afin d’observer directement le biofilm et d’obtenir des informations sur sa structure, des résultats sont obtenus qui montrent une augmentation significative de l’adhérence de la souche hébergeant le dispositif synthétique sur la base de l’adhérence, de la mesure en pourcentage et des observations microscopiques. Le principal avantage de l’approche de la biologie synthétique par rapport aux méthodes existantes comme le clonage conventionnel, est qu’il est très rapidement possible d’obtenir très rapidement des gènes contenant uniquement les gènes absolument clairs requis avec des signaux appropriés.

Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine de la biorestauration, comme relever le défi d’éliminer les bactéries chargées de métal des déchets radioactifs. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode ont des difficultés parce que des connaissances de base sur les signaux de régulation génétique et la manipulation des bases de données sont nécessaires. La démonstration visuelle se concentrera sur la quantification et les visualisations de biofilms car ces deux étapes sont très difficiles à apprendre en raison de la fragilité des biocadres.

La première étape de la conception du carron synthétique consiste à déterminer l’organisation génétique des gènes bouclés et à localiser leurs signaux endogènes, transcriptionnels et translationnels. Ceci est accompli à l’aide de bases de données spécialisées telles que REON DB ou eco gene. L’étape suivante consiste à sélectionner les cinq gènes absolument nécessaires à la synthèse des boucles, CSGB et CSGA et à coder les monomères de fibres et C-S-G-E-C-S-G-F et CSGG codent le complexe de sécrétion enroulée, extraient les séquences choisies de la base de données dans un format plus rapide, la gestion des données et la pré-analyse in silico sera effectuée avec un logiciel de gestion de clones car le cluster C-S-G-G-F-E est antisens dans le génome d’e coli.

Cette séquence doit être convertie en son homologue du complément inverse. Utilisez les outils du gestionnaire de clones opérations processus molécule inversée molécule, collez la séquence C-S-G-E-F-G derrière C-S-G-B-A à l’aide de la fonction ligate. Ensuite, ajoutez le promoteur PRCN approprié devant la séquence iCal C-S-G-B-A-E-F-G.

Le locus RCN code pour une pompe FLX RCNA, responsable de la détoxification du nickel et du cobalt, et son régulateur métallo apparenté RCNR. En l’absence de cobalt ou de nickel, le répresseur RCNR se lie à la boîte RCNR sur l’ADN et empêche l’activation complète de la transcription des gènes en aval. Si la concentration intracellulaire de cobalts ou de nickel augmente, la liaison du cobalt ou du nickel à la protéine RCNR empêche la fixation du répresseur au promoteur et l’activité transcriptionnelle de P-R-C-N-A augmente en plaçant les cinq gènes bouclés sélectionnés sous le contrôle du promoteur.

On prévoit que les frisés PRCN seront surproduits en présence de cobalt et de nickel. Par la suite, optimisez les signaux transcriptionnels en ajoutant un site de liaison parfait au ribosome ou RBS devant le premier A TG de la séquence CS gba, séquence d’ADN et un second RBS parfait devant la séquence C-S-G-E-F-G. Pour s’adapter aux normes de I GMs, l’appareil doit être flanqué d’un préfixe de biobrique standard contenant des sites de restriction pour ECO R un et X-bar un, et un suffixe contenant des sites de restriction pour SPE un et PST un pour faciliter l’assemblage ultérieur.

La partie de la brique biologique elle-même ne peut pas contenir de sites de reconnaissance ECO R, PST un SPE et X-bar R un. Par conséquent, ces sites ont été éliminés par des changements de mutation silencieux dans l’analyse de restriction silico du dispositif a révélé une PST, un site dans la séquence CSGA, un site PST dans la séquence RCNR et un ECO R dans le gène CSGE. Ces sites ont été modifiés par des mutations silencieuses.

Une fois la conception de l’opéra synthétique terminée, exécutez une simulation de traduction à l’aide du logiciel de gestion des clones. Utilisez le programme d’alignement de séquences pour vérifier l’homologie parfaite entre les protéines bouclées de type sauvage et les protéines codées par le synthétique pour commencer cette procédure pour chaque puits d’une plaque de polystyrène de 24 puits avec deux millilitres de M 63, un milieu minimal avec 0,2 % de glucose inoculer chaque puits avec 10 à six cellules d’une culture bactérienne de nuit. Cultivez les bactéries à 30 degrés Celsius pendant 18 à 48 heures sans secouer chaque colonne de la plaque à 24 puits représente une modalité.

La bonne quantité de cobalt et d’antibiotique est ajoutée au besoin. Les trois premières rangées sont utilisées pour quantifier les bactéries adhérentes A en faisant la moyenne des trois répétitions. La dernière rangée à gauche permet de visualiser le biofilm par coloration au violet cristallin après 18 à 48 heures, de récupérer le supinate contenant les cellules planctoniques de chaque puits à partir des trois premières rangées de la plaque de 24 puits et de transférer le supinate dans un tube d’hémolyse.

Rincez soigneusement chaque puits avec un millilitre de M 63 medium et tirez le lavage dans le tube d’hémolyse avec le supinate initial. Cette piscine est appelée cellules natatoires nommées S.Le fond des puits dans la microplaque est recouvert de cellules d’adhérence. Pour récupérer le biofilm, ajoutez un millilitre de M 63 dans chacun.

Bien gratter avec la pointe de la pipette, puis pipeter de haut en bas et transférer la fraction du biofilm dans un nouveau tube d’hémolyse. Faites tourbillonner le tube pendant 15 secondes. Recueillir la fraction du biofilm dans des tubes d’hémolyse.

Ce bassin représente les cellules attachées à la surface nommées B qui transfèrent 200 microlitres de la fraction de supinate et de biofilm des tubes d’hémolyse vers une plaque de 96 puits. Estimez le nombre de bactéries attachées à la surface et nageant à partir de la densité optique à 600 nanomètres. Le pourcentage d’adhérence pour chaque modalité est calculé en utilisant la formule B fois 100 divisé par trois fois S plus B.To visualiser le biofilm pour seulement la dernière rangée des 24, bien jeter les cellules de plancton de ces puits.

Ajoutez un millilitre de M 63 dans chaque puits pour rincer le biofilm qui s’est développé au fond de la plaque. Séchez la plaque découverte pendant une heure à 80 degrés Celsius après une heure, ajoutez 100 microlitres de violet cristallin à 20 % pour deux dans chaque puits, suivi de lavages approfondis à l’eau. Un châssis fluorescent est requis pour ce protocole.

Un hôte approprié pour le plasmide portant la souche synthétique bouclée est la souche e coli SCC one, qui exprime constitutivement la protéine fluorescente verte sans différence observable par rapport à la souche parente MG 1 16 55. Transformer la souche hôte avec un plasmide puck 57 portant les boucles synthétiques pour obtenir la souche S 23. Transformer la souche hôte à l’aide d’une rondelle plasmidique témoin 18 pour obtenir la souche témoin.

S 24 cultive pendant la nuit les souches S 23 et S 24 à 30 degrés Celsius. Dans un milieu M 63 complété par du glucose et de l’ampicilline le lendemain, ajoutez 20 millilitres de milieu M 63 dans une boîte de Pétri, puis inoculez 15 millilitres de M 63 dans des boîtes de Pétri avec 100 microlitres de pré-cultures. Ajoutez la concentration appropriée de cobalt et n’oubliez pas le contrôle négatif sans cobalt.

Introduisez trois lamelles rectangulaires en verre dans chaque boîte de Pétri. Incuber les plats pendant la nuit à 30 degrés Celsius sans secouer. Les bactéries peuvent être visualisées directement au microscope fluorescent les jours suivants.

Il est important d’éviter le dessèchement de l’échantillon, c’est pourquoi les étapes suivantes doivent être effectuées avec soin mais rapidement. Retirez chaque lamelle des boîtes de Pétri et égouttez-la soigneusement. Nettoyez soigneusement le bas du visage avec un petit coton-tige imbibé d’éthanol à 70 % pour essuyer tous les résidus bactériens pour l’observation confocale.

Déposez la lamelle sur une lame de verre, la face supérieure recouverte par le biofilm placée face vers le haut. Le biofilm est ensuite recouvert d’une lamelle plus grande, qui est fixée au verre. Glisser avec du vernis.

Inversez la configuration de sorte que le biofilm se trouve maintenant sur le bas du visage. Placez l’installation sous le microscope laser confocal dans cette expérience. Un microscope laser confocal Zeiss LSM cinq 10 méta est utilisé dans la micro-plateforme CT.

Sélectionnez l’objectif d’immersion dans l’huile 40 fois. Utilisez les paramètres suivants, excitez la GFP à 4 88 nanomètres et collectez la fluorescence bactérienne dans la gamme de 500 à 600 nanomètres. Utilisez l’objectif d’immersion dans l’huile 40 fois pour acquérir des images.

En mode confocal à balayage laser. Scannez les structures tridimensionnelles globales des biofilms de la surface solide à l’interface avec le milieu de croissance. En utilisant un pas d’un micron.

Réaliser des projections tridimensionnelles avec un logiciel maus, déterminer l’épaisseur du biofilm par l’analyse de la valeur C moyenne le long de sections longitudinales statistiques. Quantification du biofilm, les biovolumes peuvent être extraits des empilements confocaux Z. Les capacités d’adhérence d’E. coli conçu pour surproduire des bouclés en réponse au métal peuvent être évaluées par des méthodes simples.

Par exemple, la coloration violette cristalline sur 24 plaques Irene bien polies permet de visualiser rapidement la formation de biofilm au fond de chaque puits, comme le montre la différence d’intensité de la couleur violette. Il semble que la souche de type sauvage soit moins adhérente que la souche modifiée. Une méthode quantitative consiste à mesurer les pourcentages d’adhérence sur le polystyrène de type sauvage et les souches modifiées avec diverses concentrations de cobalt.

Les résultats présentés dans ce graphique révèlent que le pourcentage d’adhérence de la souche modifiée est 1,5 fois plus élevé que celui de la souche de type sauvage en l’absence de cobalt. De plus, un renforcement significatif de l’adhérence en présence de concentrations croissantes de cobalt a été observé dans les milieux où les concentrations de cobalt sont de 25 micromolaires ou de 50 micromolaires, les cellules modifiées atteignent respectivement 30 % et 40 %. Les capacités d’adhérence peuvent également être comparées à l’aide de la microscopie avec des bactéries marquées à la GFP cultivées sur des lames de verre, les observations en microscopie épifluorescence de bactéries vertes sur fond noir révèlent que la souche modifiée forme un biofilm, tandis que la souche sauvage trippe ne forme que des microcolonies indiquées par les flèches.

L’analyse par microscopie confocale fournit une vue d’ensemble de la structure tridimensionnelle du biofilm. Les reconstructions en vue de dessus sont montrées dans les panneaux A et les reconstructions en vue latérale sont montrées dans les panneaux B.Les résultats confirment que la souche modifiée est plus adhérente et forme un biofilm plus dense et plus épais que le type sauvage. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de vérifier la conception de l’opération, par exemple, pour explorer le potentiel de biomédiation des E coli ou des fourmis professionnelles modifiées dans le contexte des eaux usées radioactives.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir une ouverture synthétique à l’aide d’un logiciel de gestion de clones et de quantifier rapidement l’expression de souches bactériennes. N’oubliez pas que travailler avec des gènes synthétiques et des organismes génétiquement modifiés peut être extrêmement dangereux. Ils doivent être soumis conformément aux lois en vigueur et des précautions telles que l’autoclave des bactéries transformées doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.