Ingénierie bactéries adhérentes en créant un simple synthétique Curli Operon

L'objectif général de l'expérience suivante est de conférer des propriétés adhérentes à des bactéries afin de faciliter leur séparation d'un milieu liquide. Cette opération s'effectue tout d'abord en concevant une curli synthétique permettant de contourner la régulation génétique complexe et de permettre une production facile et massive de polymères collants. Dans un second temps, des bactéries adhérentes sont visualisées et quantifiées sur du polystyrène, ce qui permet une estimation rapide de l'efficacité du dispositif synthétique.

Ensuite, les bactéries adhérentes sont visualisées sur du verre par microscopie confocale. Afin d'observer directement le biofilm et d'obtenir des informations sur sa structure, des résultats sont obtenus qui montrent une augmentation significative de l'adhérence chez la souche contenant le dispositif synthétique, basée à la fois sur la mesure du pourcentage d'adhérence et sur les observations microscopiques. Le principal avantage de l'approche de biologie synthétique par rapport aux méthodes existantes, comme le clonage conventionnel, est que les constructions ne contenant que les gènes strictement nécessaires, munis des signaux appropriés, peuvent être obtenues très rapidement.

Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine de la bioremédiation, par exemple en abordant le défi de l’élimination des bactéries chargées en métaux des déchets radioactifs. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés car des connaissances de base sur les signaux régulateurs génétiques et la gestion des bases de données sont nécessaires. La démonstration visuelle portera sur la quantification et les visualisations du biofilm, car ces deux étapes sont très difficiles à apprendre en raison de la fragilité des biostructures.

La première étape de la conception du carron synthétique consiste à déterminer l'organisation génétique des gènes curly et à localiser leurs signaux transcriptionnels et traductionnels endogènes. Cela s'accomplit à l'aide de bases de données spécialisées telles que REON DB ou eco gene. L'étape suivante consiste à sélectionner les cinq gènes absolument nécessaires à la synthèse de curly, CSGB et CSGA codant pour les monomères de la fibre, et C-S-G-E-C-S-G-F ainsi que CSGG codant pour le complexe de sécrétion enroulé. Les séquences choisies sont extraites de la base de données au format fasta. Une gestion des données et une pré-analyse in silico seront effectuées à l'aide du logiciel Clone Manager, car le groupe C-S-G-G-F-E est en sens inverse dans le génome d’e coli.

Cette séquence doit être convertie en sa séquence complémentaire inverse. Utilisez les outils du gestionnaire de clonage, l'opération « inverser la molécule », puis collez la séquence C-S-G-E-F-G derrière la séquence C-S-G-B-A à l'aide de la fonction de ligature. Ensuite, ajoutez le promoteur approprié PRCN en amont de la séquence iCal C-S-G-B-A-E-F-G.

Le locus RCN code pour une pompe FLX, RCNA, responsable de la détoxification du nickel et du cobalt, ainsi que pour son régulateur métallo-associé RCNR. En l'absence de cobalt ou de nickel, le répresseur RCNR se lie à la boîte RCNR sur l'ADN et empêche l'activation complète de la transcription des gènes en aval. Si la concentration intracellulaire de cobalt ou de nickel augmente, la liaison du cobalt ou du nickel à la protéine RCNR empêche la fixation du répresseur au promoteur, et l'activité transcriptionnelle de P-R-C-N-A augmente en plaçant les cinq gènes frisés sélectionnés sous le contrôle du promoteur.

On prévoit que les PRCN bouclés soient surexprimés en présence de cobalt et de nickel. Ensuite, optimisez les signaux transcriptionnels en ajoutant un site de liaison au ribosome parfait, ou RBS, en amont du premier A TG de la séquence d'ADN CS gba, et un second RBS parfait en amont de la séquence C-S-G-E-F-G. Pour respecter les normes I GMs, le dispositif doit être encadré par un préfixe standard de bio-brique contenant des sites de restriction pour ECO R un et X-bar un, et un suffixe contenant des sites de restriction pour SPE un et PST un, afin de faciliter l'assemblage ultérieur.

La pièce bio-brick elle-même ne doit contenir aucun site de reconnaissance ECO R one, PST one, SPE one ni X-bar R one. Par conséquent, ces sites ont été éliminés par des mutations silencieuses. L'analyse in silico par restriction a révélé un site PST one dans la séquence CSGA, un site PST one dans la séquence RCNR et un site ECO R one dans le gène CSGE. Ces sites ont été modifiés par des mutations silencieuses.

Une fois la conception de l'opor synthétique terminée, effectuez une simulation de traduction à l'aide du logiciel Clone Manager. Utilisez le programme d'alignement de séquences BLAST pour vérifier l'homologie parfaite entre les protéines Curly de type sauvage et les protéines codées par l'opor synthétique. Pour commencer cette procédure, ajoutez dans chaque puits d'une plaque polystyrène de 24 puits deux millilitres de milieu minimal M63 contenant 0,2 % de glucose, puis inoculez chaque puits avec 106 cellules provenant d'une culture bactérienne incubée toute la nuit. Incubez les bactéries à 30 degrés Celsius pendant 18 à 48 heures sans agitation. Chaque colonne de la plaque de 24 puits représente une modalité.

La quantité appropriée de cobalt et d'antibiotique est ajoutée selon les besoins. Les trois premières rangées sont utilisées pour quantifier les bactéries adhérentes A en faisant la moyenne des trois répétitions. La dernière rangée restante est utilisée pour visualiser le biofilm par coloration au violet de crésyl après 18 à 48 heures ; récupérez le surnageant contenant les cellules planctoniques de chaque puits des trois premières rangées de la plaque 24 puits et transférez le surnageant dans un tube d'hémolyse.

Rincez soigneusement chaque puits avec un millilitre de milieu M 63 et aspirez la solution de lavage dans le tube d'hémolyse avec le surnageant initial. Ce pool est appelé cellules nageuses, désigné S. Le fond des puits de la microplaque est recouvert de cellules adhérentes. Pour récupérer le biofilm, ajoutez un millilitre de milieu M 63 dans chaque puits.

Gratter la culture avec la pointe de la pipette, puis aspirer et expulser plusieurs fois afin de transférer la fraction de biofilm dans un nouveau tube d'hémolyse. Vortexer le tube pendant 15 secondes. Rassembler la fraction de biofilm dans des tubes d'hémolyse.

Ce prélèvement représente les cellules adhérentes à la surface, appelées B. Transférez 200 microlitres de la fraction surnageante et de biofilm des tubes d’hémolyse vers une plaque de 96 puits. Estimez le nombre de bactéries adhérentes à la surface et de bactéries mobiles à partir de la densité optique à 600 nanomètres. Le pourcentage d’adhérence pour chaque modalité est calculé à l’aide de la formule B multiplié par 100 divisé par trois fois S plus B. Pour visualiser le biofilm uniquement pour la dernière rangée de la plaque de 24 puits, éliminez les cellules planctoniques de ces puits.

Ajoutez un millilitre de M 63 dans chaque puits pour rincer le biofilm développé au fond de la plaque. Séchez la plaque découverte pendant une heure à 80 degrés Celsius ; après une heure, ajoutez 100 microlitres de violet de crésyl à 20 % dans chaque puits, puis effectuez des lavages abondants à l’eau. Un châssis fluorescent est requis pour ce protocole.

Un hôte approprié pour le plasmide portant le gène synthétique de la curli est la souche e coli SCC one, qui exprime de manière constitutive la protéine fluorescente verte sans différence observable par rapport à la souche parentale MG 1 16 55. Transformer la souche hôte avec un plasmide puck 57 portant la curli synthétique afin d'obtenir la souche S 23. Transformer la souche hôte avec un plasmide témoin puck 18 afin d'obtenir la souche témoin.

Incuber toute la nuit des pré-cultures des souches S 23 et S 24 à 30 degrés Celsius. Le jour suivant, dans du milieu M 63 supplémenté en glucose et en ampicilline, ajouter 20 millilitres de milieu M 63 dans une boîte de Pétri, puis ensemencer 15 millilitres de milieu M 63 dans des boîtes de Pétri avec 100 microlitres des pré-cultures. Ajouter la concentration appropriée de cobalt et ne pas oublier le contrôle négatif sans cobalt.

Introduire trois lamelles de verre rectangulaires dans chaque boîte de Pétri. Incuber les boîtes toute la nuit à 30 degrés Celsius sans agitation. Les bactéries peuvent être visualisées directement au microscope fluorescent les jours suivants.

Il est important d'éviter le dessèchement de l'échantillon, donc les étapes suivantes doivent être effectuées avec soin mais rapidement. Retirer chaque lame couvre-objet des boîtes de Pétri et la vider soigneusement. Nettoyer soigneusement la face inférieure avec un petit coton-tige imbibé d'éthanol à 70 % afin d'éliminer tous les résidus bactériens pour l'observation en microscopie confocale.

Déposer la lame couvre-objet sur une lame en verre, la face supérieure recouverte du biofilm placée vers le haut. Le biofilm est ensuite recouvert par une lame couvre-objet plus grande, fixée à la lame de verre avec du vernis.

Retournez le dispositif afin que le biofilm se trouve désormais sur la face inférieure. Placez le dispositif sous le microscope à laser confocal pour cette expérience. Un microscope à laser confocal Zeiss LSM five 10 meta est utilisé dans le cadre de la plateforme CT micro.

Sélectionnez l'objectif à immersion huile 40 fois. Utilisez les paramètres suivants : excitez la GFP à 488 nanomètres et recueillez la fluorescence bactérienne dans la plage de 500 à 600 nanomètres. Utilisez l'objectif à immersion huile 40 fois pour acquérir les images.

En mode confocal à balayage laser, balayer l'ensemble des structures tridimensionnelles des biofilms, depuis la surface solide jusqu'à l'interface avec le milieu de croissance, en utilisant un pas d'un micron.

Effectuer des projections tridimensionnelles à l'aide du logiciel maus, déterminer l'épaisseur du biofilm par l'analyse de la valeur moyenne de C le long de sections longitudinales statistiques. La quantification du biofilm, les volumes biologiques peuvent être extraits à partir de coupes Z confocales. Les capacités d'adhérence d'Escherichia coli génétiquement modifiée pour surexprimer la protéine curly en réponse aux métaux peuvent être évaluées par des méthodes simples.

Par exemple, la coloration au violet de crésyl sur des plaques Irene polies de 24 puits permet une visualisation rapide de la formation de biofilm au fond de chaque puits, comme le montre la différence d'intensité de la couleur violette. Il semble que la souche sauvage soit moins adhérente que la souche modifiée. Une méthode quantitative consiste à mesurer les pourcentages d'adhérence sur le polystyrène des souches sauvage et modifiée à différentes concentrations de cobalt.

Les résultats présentés dans ce graphique révèlent que le pourcentage d'adhérence de la souche modifiée est 1,5 fois plus élevé que celui de la souche sauvage en l'absence de cobalt. De plus, un renforcement significatif de l'adhérence en présence de concentrations croissantes de cobalt a été observé dans les milieux contenant 25 micromolaires ou 50 micromolaires de cobalt, les pourcentages d'adhérence des cellules modifiées atteignant respectivement 30 % et 40 %. Les capacités d'adhérence peuvent également être comparées à l'aide de la microscopie en utilisant des bactéries marquées au GFP cultivées sur des lames de verre ; les observations en microscopie à épifluorescence de bactéries vertes sur fond noir révèlent que la souche modifiée forme un biofilm, tandis que la souche sauvage ne forme que de microcolonies, indiquées par les flèches.

L'analyse par microscopie confocale fournit une vue d'ensemble de la structure tridimensionnelle du biofilm. Les reconstructions en vue supérieure sont présentées dans les panneaux A et les reconstructions en vue latérale dans les panneaux B. Les résultats confirment que la souche modifiée est plus adhérente et forme un biofilm plus dense et plus épais que la souche sauvage. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de vérifier attentivement la conception expérimentale, par exemple pour explorer le potentiel de bioremédiation d'Escherichia coli modifié ou d'occus ants dans le contexte des eaux usées radioactives.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment concevoir un gène synthétique à l’aide d’un logiciel de gestion de clones et comment quantifier rapidement l’expression de souches bactériennes. N’oubliez pas que le travail avec des gènes synthétiques et des organismes génétiquement modifiés peut présenter des risques extrêmement élevés. Ces manipulations doivent être effectuées conformément aux réglementations en vigueur, et des précautions telles que l’autoclavage des bactéries transformées doivent toujours être prises lors de cette procédure.