Name: Une boîte à outils pour permettre la conversion dhydrocarbures en milieu aqueux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 28 s
Description: Découvrez un système bactérien auto-régulé pour la biodégradation des alcanes dans les milieux aqueux toxiques. Cette approche utilise E. coli modifié et des BioBricks pour une bioremédiation durable de la pollution pétrolière.

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Les expériences réalisées dans cette vidéo-article ont été développés pour la compétition machine génétiquement internationale 9. Les auteurs tiennent à remercier les membres de l&#39;équipe iGEM Luc Bergwerff, Pieter van TM Boheemen, Jelmer Cnossen, Hugo F. Rojas et Ramon Cueto van der Valk pour l&#39;aide à la recherche. Nous remercions Han de Winde, Stefan de Kok et Esengül Yıldırım pour des discussions utiles et d&#39;hébergement de cette recherche. Ce travail a été soutenu par le ministère de la TU Delft University of Biotechnology, Delft Le laboratoire de bioinformatique, TU Delft Département de Bionanoscience, Oil Sands Leadership Initiative (OSLI), Stud studentenuitzendbureau, Pays-Bas Initiative en génomique, Kluyver Centre, Nederlandse Vereniging Biotechnologische (Stichting Nederland Biotechnologie) , DSM, Geneart, Greiner Bio-One et Genencor.

1. BioBrick Assemblée <ol><li> BioBricks du Registre de pièces normalisées biologiques sont fournis par le siège iGEM. Pour construire une nouvelle BioBrick de BioBricks existants, digérer le donateur (jusqu&#39;à 1,0 mg) BioBrick par les enzymes EcoRI et Spel pour le positionnement de la partie aval des bailleurs de fonds de la part accepteur. Digestion par XbaI et PstI pour positionner le donneur de la pièce en amont de la partie accepteur. Ajouter une troisième enzyme de restriction appropriée qui coupe dans le squelette du donneur. Effectuer les digestions dans un volume total de 20-25 ml avec le tampon approprié, selon le fournisseur (concentration finale 1x). Utilisez 5 unités / mg d&#39;ADN pour les enzymes de restriction. </li><li> Digérer l&#39;accepteur BioBrick soit avec EcoRI et XbaI ou Spel et PstI. </li><li> Incuber les digestions pour (au moins) une heure à 37 ° C. Inactiver les endonucléases de restriction par la chaleur, l&#39;incubation à 80 ° C pendant 10 min et centrifugation sous peu. </li><li> Ligaturer le BioBrick digéréparties (donneur et accepteur) ensemble. Depuis Xbal et Spel générer des extrémités d&#39;ADN compatibles, un site mixte est créé, qui ne peut pas être coupé avec une enzyme de restriction résultant en une nouvelle «combiné» BioBrick qui flanquaient par les 4 sites de restriction standard. Dans le mélange de ligature de la concentration finale en ADN est de préférence ~ 100 ng / ul. Effectuer la réaction de ligature dans un volume total de 10-15 ml avec le tampon de ligature T4 (concentration finale 1 x) et la T4 ligase (1 unité / mg d&#39;ADN). </li><li> Incuber le mélange de ligature à 16 ° C pendant au moins 3 h. </li><li> Effectuer réaction de transformation de la moitié vers le mélange de ligature. </li><li> Confirmez le BioBrick comme correctes pour le séquençage. </li><li> Pour construire une nouvelle BioBrick de l&#39;ADN synthétisé, de modifier les gènes de synthèse pour une expression optimale dans E. coli à l&#39;aide de l&#39;outil de site JCAT ( <a href="http://www.jcat.de/" target="_blank">http://www.jcat.de/</a> ). Apporter d&#39;autres modifications, conformément aux exigences de la B<html> ioBrick standard. Cette standardisation implique que chaque BioBrick est composé d&#39;une séquence d&#39;ADN d&#39;intérêt précédée d&#39;un préfixe et d&#39;un suffixe suivi. Le préfixe et le suffixe sont des séquences qui contiennent des sites de restriction prédéfinis, qui sont absents dans le reste de la séquence du plasmide. Ces sites de restriction standards permettent d&#39;échanger et de prolonger les inserts BioBrick flexible 9. Les préfixes et suffixes ont les séquences suivantes: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Séquence </td><td> Commenter </td></tr><tr><td> Préfixe </td><td> 5 &#39;GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3&#39; </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 &#39;GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3&#39; </td><td> Si la partie qui suit est une séquence codante ou toute partie qui commence par &quot;ATG&quot; </td></tr><tr><td> Suffixe </td><td> 5 &#39;TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3&#39; </td><td></td></tr></tbody></table>ove_title &quot;&gt; 2. Conversion alcane cellule de dosage de repos, In Vivo Cet essai a été effectué sur la base de la méthode décrite par Fujii et al. (2004). <ol><li> Culture E. coli exprimant les cellules du système alcane hydroxylase ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398014" target="_blank">BBa_K398014</a> ) et les cellules portant un vecteur vide ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J13002" target="_blank">BBa_J13002</a> ) dans 5 ml de milieu LB avec des antibiotiques appropriés pendant la nuit. </li><li> Transfert 500 pi de la culture d&#39;une nuit dans 50 ml de LB frais (avec un antibiotique) et incuber jusqu&#39;à ce que la turbidité des cellules a atteint une DO (densité optique) de 0,3 à 600 nm. </li><li> Centrifuger pendant 10 min à 4000 rpm et remettre en suspension le culot dans 5 ml de tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4). </li><li> Centrifuger à nouveau pendant 10 min à 4000 rpm et remettre en suspension le culot dans 5 ml de tampon phosphate 0,1 M contenant des sels maintenant E2 et 0,66% v / v de glycérol (azote carencest moyen). </li><li> Mesurer la turbidité cellulaire (DO 600). </li><li> Préparer cellule-mélange des aliquotes de 6 ml dans des flacons de 25 ml en verre fermé d&#39;assemblage et les contrôles non-cellulaires (E2 + 0,66 sels% v / v de glycérol). </li><li> Ajouter 100 nmol d&#39;alcane dans chaque flacon. </li><li> Incuber les mélanges à 37 ° C pendant 24 heures (raccourcir lorsque des taux plus élevés sont obtenus). </li><li> Mesurer la DO 600 après incubation. </li><li> Extraire les hydrocarbures dans les milieux de culture par l&#39;acétate d&#39;éthyle et de déterminer la concentration d&#39;hydrocarbures en culture cellulaire par chromatographie en phase gazeuse (voir le protocole 3). </li><li> Calculer la dégradation par unité de biomasse en divisant la quantité totale d&#39;alcane converti par la biomasse totale présente dans chaque fiole (OD 600 à convertir la matière sèche). En divisant le résultat par la durée expérimentale donne l&#39;activité de dégradation par unité de biomasse par unité de temps. La moyenne est calculée à partir de trois points différents. </li></ol> 3. Essai alcane enzyme de conversion, enVitro Cet essai a été réalisé essentiellement selon la méthode décrite par Li et al. (2008). <ol><li> Culture E. cellules de E. coli exprimant le gène de Lada ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398017" target="_blank">BBa_K398017</a> ) et les cellules portant un vecteur vide ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J13002" target="_blank">BBa_J13002</a> ) dans 50 ml de milieu LB avec des antibiotiques appropriés pendant la nuit. </li><li> Transfert 500 pi de la culture d&#39;une nuit dans 50 ml de LB frais (avec un antibiotique) et incuber jusqu&#39;à ce que la turbidité des cellules a atteint une densité optique de 0,6 à 600 nm. </li><li> Centrifuger 10 min à 4000 rpm (4 ° C) et remettre en suspension le culot dans 5 ml de tampon Tris 50 mM. </li><li> Soniquer (cellulaire perturbateur, LA Biosystems), les cellules à rapport cyclique de 40% avec une commande de sortie de 4, maintenir la solution sur de la glace pendant toute la durée. </li><li> Centrifuger le mélange résultant pendant 5 min à 4000 rpm à 4 &amp; dpar exemple, C pour éliminer les débris cellulaires. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. </li><li> Déterminer la concentration totale en protéines des extraits cellulaires par dosage de Bradford. Remarque: Utilisez des flacons en verre pour empêcher l&#39;augmentation du fond et / ou la perte de protéines. </li><li> Préparer un mélange 100 ml contenant 0,1% en volume / volume d&#39;alcane et 50 mM de tampon Tris-HCl. </li><li> Chauffer le mélange à 100 ° C pendant 5 min. Remarque: Effectuez cette étape uniquement pour les alcanes à chaîne moyenne et longue avec un point d&#39;ébullition élevé. (Par exemple C 16: 287 ° C). </li><li> Pour obtenir une solubilité optimale de l&#39;alcane, une sonication pendant 1 min encore chaude jusqu&#39;à ce qu&#39;une homogène, mélange visqueux est obtenu. </li><li> Ajouter 1 mM de NADH, 1 mM FMN, 1 mM de MgSO 4 et 0,01 v / v de Triton X-100. </li><li> Préparez 6 ml d&#39;aliquotes de 25 ml à bouchon fermé flacons. </li><li> Ajouter une quantité suffisante d&#39;extrait cellulaire (dépend de tests Bradford, la concentration finale de 5 mg de protéine / l). Préparer un témoin sans protéines. </li><li> Incuber à 60 ° C (par e optimalenzymatic activité) pendant 24 heures. </li><li> Extraire les hydrocarbures dans les milieux de culture par l&#39;acétate d&#39;éthyle et de déterminer la concentration d&#39;hydrocarbures en culture cellulaire par chromatographie en phase gazeuse (voir le protocole 3). </li><li> Calculer la dégradation par unité de biomasse en divisant la quantité totale d&#39;alcane converti en protéine totale dans chaque fiole (par Bradford courbe d&#39;étalonnage). En outre la division de la durée du test donne l&#39;activité de dégradation par unité de protéine cellulaire par unité de temps. La moyenne est calculée à partir de trois points différents. </li></ol> 4. Ethyl Acetate extraction d&#39;hydrocarbures et de concentration <ol><li> Alcanes sont extraits de la solution aqueuse en ajoutant 2,5 ml d&#39;acétate d&#39;éthyle (solvant apolaire) pour solution expérimentale 6 ml. Un étalon interne est ajouté au solvant à une concentration de 0,1% (v / v). La norme (par exemple cyclo-décane) varie en fonction de la fourchette prévue des pics d&#39;intérêt. </li><li> Facultatif: Ajouter TritonX-100 pour le mélange aqueux et centrifuger les échantillons pendant 10 min à 4000 rpm afin d&#39;obtenir un bon système biphasique. </li><li> Vortex le mélange pendant 5 sec (1,500 rpm) et incuber à température ambiante jusqu&#39;à ce que les deux phases se séparent. </li><li> Suppression d&#39;un montant maximal de la couche organique (en haut) et sécher le solvant en utilisant du sulfate de magnésium anhydre. </li><li> Retirer MgSO 4 par filtration (0,2 um) et transférer le filtrat dans des flacons chromatographe en phase gazeuse pour la mesure, ni le conserver à -20 ° C. </li><li> Déterminer la concentration par chromatographie en phase gazeuse en utilisant une colonne CP-SIL 5CB (longueur = 5 m). Injecter 10 ul d&#39;échantillon en mode split (1:10, 230 ° C). Régler le débit de gaz colonne à 1 ml / min (Hélium). Le programme du four suivant la température est utilisée: <table border="1"><tbody><tr><td> Taux </td><td> Température [° C] </td><td> Temps [min] </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 50 </td><td> 7,5 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 90 </td><td> 1,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 110 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 130 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 145 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 160 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 170 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 185 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 210 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 250 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 320 </td><td> 2,0 </td></tr></tbody></table></li><li> Intégrer les pics et corriger les concentrations par rapport à l&#39;étalon interne. </li></ol> 5. Alcool / Test d&#39;activité aldéhyde déshydrogénase Cet essai a été réalisé essentiellement selon la méthode décrite par Kato et al.(2010). <ol><li> Culture E. cellules de E. coli exprimant l&#39;ADH ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398018" target="_blank">BBa_K398018</a> ) ou ALDH ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398030" target="_blank">BBa_K398030</a> ) des gènes et des cellules portant un vecteur vide ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J13002" target="_blank">BBa_J13002</a> ) dans 50 ml de milieu LB avec des antibiotiques appropriés pendant la nuit. </li><li> Transfert 500 pi de la culture d&#39;une nuit dans 50 ml de LB frais (avec un antibiotique) et incuber jusqu&#39;à ce que la turbidité des cellules a atteint une densité optique de 0,6 à 600 nm. </li><li> Centrifuger 10 min à 4000 rpm à 4 ° C et remettre en suspension le culot dans 5 ml de tampon Tris 50 mM. </li><li> Soniquer la solution de cellules au facteur de marche 40%, avec une commande de sortie de 4 (maintenir la solution sur de la glace pendant la sonication). </li><li> Centrifuger le mélange résultant pendant 5 min à 4000 rpm à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> Déterminer le àconcentration en protéines tal des extraits cellulaires par Bradford dosage (Remarque: utiliser un flacon en verre pour empêcher la liaison des protéines). </li><li> Chargez une plaque de 96 puits avec 180 pl 57 mM tampon glycine contenant du NAD (concentration finale 1 mM, pH 9,5) dans chaque puits. </li><li> Ajouter 5 ul de l&#39;alcool (aldéhyde) à tester dans les puits. Remarque: les alcools à longue chaîne de chaleur avant le début de l&#39;essai d&#39;avoir un liquide. Pour chaque alcool (aldéhyde) un contrôle sans substrat doit être ajouté (témoin négatif). En outre, de préparer une ébauche qui contient un mélange de tampon et le substrat sans extrait cellulaire. </li><li> Préchauffer la plaque de la plaque (Tecan Magellan v7.0) lecteur pendant 15 min à 37 ° C pour permettre l&#39;équilibrage du système. </li><li> Ajouter une quantité suffisante d&#39;extrait cellulaire (dépend de tests Bradford, la concentration finale de 5 mg de protéine / l). Préparer un témoin sans protéines. </li><li> Mesurer la production de NADH l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre à une longueur d&#39;onde de 340 nm toutes les 2-3 minutes pendant 1 heure à 37 ° C. &lt;/ Li&gt; <li> Calculer le taux de production de NADH à partir de la pente de la DO (340 nm). Prendre en compte la longueur de trajet de la lumière et le coefficient d&#39;extinction du NADH de 6220 M -1 cm -1. Diviser le rythme de production de NADH par la quantité totale de protéine ajoutée à exprimer l&#39;activité de la déshydrogénase de réaction dans l&#39;extrait cellulaire (U / mg de protéine de cellule entière). Calculer la moyenne et l&#39;écart type de trois essais indépendants. </li></ol> 6. Caractérisation pCaiF <ol><li> Culture E. cellules exprimant la construction coli pCaiF-GFP ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398331" target="_blank">BBa_K398331</a> ) et les cellules portant le promoteur seul ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398326" target="_blank">BBa_K398326</a> ) pendant une nuit dans 5 ml de milieu LB les antibiotiques appropriés pendant la nuit. </li><li> Inoculer 5 ml M9 contenant 10 g / l de glucose et les antibiotiques avec 50 ul de la culture de la nuit et du jour au lendemain se développer. </li&gt; <li> Subculture 50 pl de l&#39;excroissance du jour au lendemain dans 5 ml de frais M9 avec 10 g / l et incuber jusqu&#39;à ce que la turbidité des cellules a atteint une densité optique de 0,2 à 600 nm. </li><li> Chargez une plaque de 96 puits avec 100 ul de milieu M9 frais contenant la quantité désirée de source de carbone pour les essais dans chaque puits. Effectuer trois expériences pour l&#39;évaluation statistique et ajoutez les contrôles respectifs négatifs (de type sauvage de E. coli K12). </li><li> Ajouter 5 ul de la culture d&#39;une nuit dans les puits milieu contenant. </li><li> Mesurer la courbe de croissance (DO 600) et fluorescence de la GFP (485 nm d&#39;excitation et 520 émissions) en utilisant un lecteur de plaque toutes les 10 minutes pendant 18 heures à 37 ° C avec une agitation constante. </li><li> Calculer le taux de croissance et la teneur en GFP spécifique des mesures respectives et le comparer au contrôle. Calculer la moyenne et l&#39;écart type d&#39;au moins trois expériences indépendantes. </li></ol> 7. Essai de tolérance <ol><li> CultureE. coli exprimant le gène PhPFDα et β ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398406" target="_blank">BBa_K398406</a> ) pendant une nuit dans 5 ml de milieu LB et les antibiotiques appropriés. E. coli exprimant Lada gène ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398017" target="_blank">BBa_K398017</a> ) est utilisé comme contrôle négatif. </li><li> Subculture 10 pi du jour au lendemain en conséquence frais 5 ml de LB (avec un antibiotique) et incuber jusqu&#39;à ce que la turbidité des cellules a atteint une densité optique de 0,3 à 0,4 à 600 nm. </li><li> Diluer les cultures avec du milieu frais jusqu&#39;à une DO600 de 0,1 est atteint. </li><li> Chargez une plaque de 96 puits avec 180 ul de milieu M9 contenant les antibiotiques appropriés et la concentration finale appropriée du composé toxique (par exemple, 0, 4, 8, 10% de n-hexane) en trois exemplaires. Parce que alcane mélanges d&#39;eau et pourrait conduire à des systèmes à deux phases, il est essentiel d&#39;avoir des contrôles appropriés sur la plaque (par exemple, différents souches et les expériences respectives en blanc). </li><li> Ajouter 20 ul de la culture (contrôle) dans les puits. </li><li> Mesurer la concentration de la biomasse (OD 600) en utilisant un lecteur de plaque toutes les 10 minutes pendant 24 heures à 37 ° C avec une agitation constante. </li><li> Calculer les taux de croissance à partir des mesures respectives pour les différentes concentrations de l&#39;agent et le comparer au contrôle négatif. Calculer la moyenne et l&#39;écart type d&#39;au moins trois essais indépendants. </li></ol> 8. Cartographie interaction homologue <ol><li> L&#39;application a été développée pour LUI effectuer des requêtes de protéines sur un serveur PostgreSQL la base de données STRING (gratuit pour un usage académique) 20. L&#39;application de cartographie homologue de l&#39;interaction identifie les protéines qui interagissent dans l&#39;organisme hôte d&#39;origine en utilisant la base de données STRING. Les séquences des gènes respectifs interaction sont utilisés dans une recherche BLAST pour trouver des gènes homologues dans l&#39;organisme cible. Cytoscape 4 </sup&gt; est utilisé pour visualiser le résultat de la cartographie. L&#39;outil logiciel HIM peut être téléchargé à l&#39;adresse: <a href="https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping" target="_blank">https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.</a> </li><li> Pour effectuer une cartographie, (1) entrez l&#39;ID BioBrick et l&#39;application va automatiquement télécharger les données de séquence de pièces tirées du Registre des standards biologiques Pièces 9, ou (2) ENTRER (coller) les données de séquence dans l&#39;application. </li><li> Utilisez le site Web de la base de données STRING pour trouver l&#39;ID de protéines STRING pour la séquence d&#39;acides aminés entré. </li><li> Une protéine ayant une forte homologie est déterminée en utilisant BLAST. Par la suite, l&#39;application répertorie chaque protéine d&#39;interaction connue dans l&#39;organisme source et recherche des homologues dans l&#39;organisme hôte (par exemple E. coli). </li><li> Exporter découlant liste interaction putative de texte ou Cytoscape. </li></ol>

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<li>Okochi, M., Kanie, K., Kurimoto, M., Yohda, M., Honda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+prefoldin+from+the+hyperthermophilic+archaeum+Pyrococcus+horikoshii+OT3+endowed+Escherichia+coli+with+organic+solvent+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of prefoldin from the hyperthermophilic archaeum Pyrococcus horikoshii OT3 endowed Escherichia coli with organic solvent tolerance.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 79 (3), 443-449 (2008).</li>
<li>Rehm, H. J., Reiff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+occurrence+of+microbial+oxidation+of+long-chain+alkanes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+%2F+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and occurrence of microbial oxidation of long-chain alkanes.</a> Adv. Biochem. Eng. / Biotechnol. 19, 175-215 (1981).</li>
<li>Rojo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+alkanes+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Degradation of alkanes by bacteria.</a> Environ. Microbiol. 11 (10), 2477-2490 (2009).</li>
<li>STRING 9.0 Known and Predicted Protein-Protein Interactions [Internet]. , Available from: 
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<li>Van Beilen, J. B., Panke, S., Lucchini, S., Franchini, A. G., Rothlisberger, M., Witholt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Pseudomonas+putida+alkane-degradation+gene+clusters+and+flanking+insertion+sequences%3A+evolution+and+regulation+of+the+alk+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Pseudomonas putida alkane-degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk genes.</a> Microbiology. 147, 1621-1630 (2001).</li>
<li>Wang, L., Tang, Y., Wang, S., Liu, R. L., Liu, M. Z., Zhang, Y., Liang, F. L., Feng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+novel+thermophilic+Bacillus+strain+degrading+long-chain+n-alkanes%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a novel thermophilic Bacillus strain degrading long-chain n-alkanes.</a> Extremophiles. 10 (4), 347-356 (2006).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le principe BioBrick est utilisé pour construire un châssis pour la dégradation des alcanes et une preuve de principe pour les composants individuels de la boîte à outils a été obtenu. Plusieurs dosages sont proposés pour mesurer l&#39;in vivo et in vitro l&#39;activité des enzymes de la voie d&#39;alcanes dégradantes. Le travail présenté démontre avec succès un certain nombre de méthodes qui peuvent être utilisées pour déterminer l&#39;activité des enzymes et de l&#39;expression dans l&#39;organisme h...

La pollution par les hydrocarbures figure parmi les causes les plus graves de contamination environnementale et affecte fortement les écosystèmes, les entreprises et les communautés 3. Des solutions sont par exemple nécessaires pour lutter contre la pollution pétrolière continue provenant des eaux de décantation des sables bitumineux en Alberta, au Canada. Lors du processus d'extraction du pétrole à partir des sables bitumineux, le bitume, une forme semi-solide et oxydée du pétrole, est extrait à l'aide de techniques de récupération thermique qui consomment environ 3,1 barils d'eau par baril de pétrole produit 1. L'eau de procédé contaminée par le pétrole, provenant principalement d'une rivière locale, est stockée dans des bassins de décantation après l'extraction du bitume. Un recyclage plus efficace de l'eau de procédé, afin de réduire la nécessité de puiser de l'eau douce, s'avère indispensable. Pour faciliter l'extraction du bitume et garantir que les sites en aval respectent les normes de qualité de l'eau destinées à protéger les écosystèmes aquatiques, les traitements de l'eau de procédé évoluent rapidement 3.
Pour traiter la pollution par les composés organiques, les technologies de bioremédiation utilisant des micro-organismes sont actuellement encouragées 1. Les alcanes constituent la famille la plus abondante d'hydrocarbures présents dans le pétrole brut, contenant de 5 à 40 atomes de carbone par molécule 7, 21. De nombreuses bactéries sont connues pour dégrader des alcanes de différentes longueurs par une oxydation séquentielle du groupe méthyle terminal, produisant d'abord des alcools, puis des aldéhydes et enfin des acides gras 8. Dans le cadre de ce projet iGEM, plusieurs enzymes provenant d'organismes différents ont été exprimées et caractérisées, puis mises à disposition selon la norme BioBrick et le Registre des Pièces Biologiques Standardisées.
Le système bien étudié d'hydroxylase des alcanes de Gordonia sp. TF6 facilite la première étape d'oxydation des alcanes C5-C13 ainsi que celle des cycloalcanes C5-C8, en utilisant un minimum de quatre composants : alkB2 (alkane 1-monooxygénase), rubA3, rubA4 (deux rubrédoxines) et RubB (réductase de rubrédoxine) 8, 21. L'oxydation des alcanes à longue chaîne (allant de C15 à C36) est assurée par ladA, une monooxygénase d'alcane de type flavoprotéine provenant de Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 7, 15, 18, 22. LadA forme un complexe catalytique avec le mononucléotide de flavine (FMN), qui utilise l'oxygène atomique pour l'oxydation. Cela conduit à la transformation des alcanes en alcools primaires correspondants. Ces alcools sont ensuite oxydés par des déshydrogénases alcooliques et aldehydiques en acides gras, qui pénètrent facilement dans la voie de β-oxydation 7, 21. Une déshydrogénase alcoolique indépendante du zinc, provenant de la bactérie thermophile Geobacillus thermoleovorans B23, oxyde les alcools à chaîne moyenne en leurs aldéhydes respectifs, en utilisant NAD+ comme cofacteur 10. La déshydrogénase aldehydique provenant du même microorganisme est capable de catalyser la dernière étape, dépendante de NAD+, de l'oxydation des chaînes moyennes 11.
Afin de réduire les coûts d'induction et de maintenir une prolifération optimale du système bactérien, le promoteur pCaiF d'E.coli a été caractérisé. Ce promoteur peut réguler l'expression des composants de la voie de dégradation des hydrocarbures et est contrôlé par les niveaux de cAMP-Crp, qui dépendent à leur tour des concentrations de glucose 6. Lorsque les concentrations extracellulaires de glucose sont élevées dans l'environnement, le taux intracellulaire de cAMP (monophosphate d'adénosine cyclique) est faible en raison de l'inhibition de l'adénylyl cyclase, un effet secondaire du transport du glucose médié par le système PTS. En revanche, en cas de limitation (faibles concentrations de glucose), le niveau de cAMP augmente et Crp se lie au cAMP, formant le complexe cAMP-Crp, qui se fixe sur pCaiF et active la transcription des composants en aval 6, 14.
L'E. coli de type sauvage ne tolère que des concentrations modérées d'hydrocarbures. Pour compléter la boîte à outils, il fallait aborder la question de la tolérance aux hydrocarbures. Plusieurs bactéries tolérantes aux solvants organiques sont connues pour survivre dans des systèmes biphasiques eau-solvant 12. Les composants moléculaires connus pour augmenter la tolérance sont les chaperonnes, qui facilitent le repliement correct des protéines. Le système préfoldine de Pyrococcus horikoshii OT3, composé des protéines phPFDα et phPFDβ, s'est révélé augmenter la tolérance aux hydrocarbures 17.
La trousse de conversion des alcanes a été conçue selon le principe BioBrick, documenté dans le Registry of Standard Biological Parts 9. Les BioBricks sont des plasmides contenant un insert fonctionnel spécifique encadré par 4 sites de restriction prédéfinis. Les inserts BioBrick peuvent être étendus de manière flexible, permettant la construction de systèmes biologiques dotés de nouvelles fonctions.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; K12</td><td>New England Biolabs</td><td>C2523H</td><td></td></tr><tr><td>Octane</td><td>Fluka</td><td>74822</td><td></td></tr><tr><td>Hexadécane</td><td>Fluka</td><td>52209</td><td></td></tr><tr><td>octan-1-ol</td><td>Fluka</td><td>95446</td><td></td></tr><tr><td>dodécanol-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>126799</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>FMN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2253</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>J.T. Baker Casno</td><td>7487 889</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>ligase T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Chromatographe en phase gazeuse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Broyeur de cellules</td><td>LA Biosystems</td><td>CD-019</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>spec 2000</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>Magellan v7.0</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur </td><td>Innova, 44</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioBrickTM K398014 : BBa_J23100-BBa_J61100-&lt;em&gt;alkB2&lt;/em&gt;-BBa_J61100-&lt;em&gt;rubA3&lt;/em&gt;-BBa_J61100-&lt;em&gt;rubA4&lt;/em&gt;- BBa_J61100-&lt;em&gt;rubB&lt;/em&gt;</td><td>Université technique de Delft, département de biotechnologie ou registre des pièces biologiques standard</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398014&quot; cible=&quot;_aucun contenu à traduire_&quot;&gt;BBa_K398014&lt;/a&gt;</td><td>Système hydroxylase des alcanes&lt;br/&gt; Résistance : chloramphénicol </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398027 : BBa_R0040-BBa_B0034-&lt;em&gt;ladA&lt;/em&gt; </td><td>Université technique de Delft, département de biotechnologie ou registre des pièces biologiques standard</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398027&quot; cible=&quot;_aucun contenu à traduire_&quot;&gt;BBa_K398027&lt;/a&gt;</td><td>Générateur de protéine LadA&lt;br/&gt; Résistance : chloramphénicol </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398018 : BBa_J23100-BBa_J61101-&lt;em&gt;ADH&lt;/em&gt; </td><td>Université technique de Delft, département de biotechnologie ou registre des pièces biologiques standard</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398018&quot; cible=&quot;Veuillez fournir le texte source à traduire.&quot;&gt;BBa_K398018&lt;/a&gt;</td><td>générateur d'ADH&lt;br/&gt; Résistance : chloramphénicol </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398030 : BBa_R0040-BBa_B0034-&lt;em&gt;ALDH&lt;/em&gt; </td><td>Université technique de Delft, département de biotechnologie ou registre des pièces biologiques standard</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398030&quot; cible=&quot;_aucun_&quot;&gt;BBa_K398030&lt;/a&gt;</td><td>générateur ALDH&lt;br/&gt; Résistance : chloramphénicol </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398326 :&lt;em&gt; pCaiF&lt;/em&gt; </td><td>Université technique de Delft, département de biotechnologie ou registre des pièces biologiques standard</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398326&quot; cible=&quot;_aucun contenu à traduire_&quot;&gt;BBa_K398326&lt;/a&gt;</td><td>promoteur pCaiF&lt;br/&gt; Résistance : chloramphénicol </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398331 :&lt;em&gt; pCaiF&lt;/em&gt;-BBa_B0032-BBa_I13401</td><td>Université technique de Delft, département de biotechnologie ou registre des pièces biologiques standard</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398331&quot; cible=&quot;_aucun contenu à traduire_&quot;&gt;BBa_K398331&lt;/a&gt;</td><td>Dispositif de mesure pCaiF&lt;br/&gt; Résistance : chloramphénicol </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398406 : BBa_J23002-BBa_J61107-&lt;em&gt;phPFD&lt;/em&gt;&lt;em&gt;&amp;alpha;&lt;/em&gt;-BBa_J61107- </td><td>Université technique de Delft, département de biotechnologie ou registre des pièces biologiques standard</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398406&quot; cible=&quot;_vides&quot;&gt;BBa_K398406&lt;/a&gt;</td><td>Groupe de gènes de tolérance aux solvants&lt;br/&gt; Résistance : chloramphénicol </td></tr></tbody></table>

une boîte à outils pour permettre la conversion d&#39;hydrocarbures en milieu aqueux

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

Ce travail met en avant un ensemble d&#39;outils qui permet la conversion d&#39;alcanes par Escherichia coli et présente une preuve de principe de son applicabilité. La boîte à outils se compose de plusieurs éléments standards interchangeables (BioBricks) 9 portant sur ​​la conversion d&#39;alcanes, la régulation de l&#39;expression génique et la survie des toxiques riches en hydrocarbures environnements. Un parcours en trois étapes pour la dégradation de l&#39;alcane a été mis en œuvre dans E. coli afin de permettre la conversion d&#39;alcanes à moyen et à longue chaîne à leurs alcanols, alcanals respectives et, finalement, des acides alcanoïque. Ces derniers ont été métabolisé par le natif de β-oxydation voie. Pour faciliter l&#39;oxydation des alcanes à chaîne moyenne (C5-C13) et de cycloalcanes (C5-C8), quatre gènes (alkB2, rubA3, rubA4 et Rubb) du système alcane hydroxylase de Gordonia sp. TF6 8,21 ont été transformés en E. coli. Pour la conversion desalcanes à longue chaîne (C15-C36), le gène de Lada thermodenitrificans Geobacillus a été mis en œuvre. Pour les autres étapes nécessaires du processus de dégradation, l&#39;ADH et l&#39;ALDH (provenant de thermodenitrificans G.) ont été introduites 10,11. L&#39;activité a été mesurée par des dosages de cellules au repos. Pour chaque étape d&#39;oxydation, l&#39;activité enzymatique a été observée. Afin d&#39;optimiser l&#39;efficacité des processus, l&#39;expression n&#39;a été induite dans des conditions hypoglycémie: un promoteur régulé substrat, pCaiF, a été utilisé. pCaiF est présent dans E. coli K12 et régule l&#39;expression des gènes impliqués dans la dégradation de la source de carbone non-glucose. La dernière partie de la trousse à outils - le ciblage de survie - a été mis en œuvre en utilisant des gènes de tolérance solvants, PhPFDα et β, deux de Pyrococcus horikoshii OT3. Les solvants organiques peuvent induire un stress cellulaire et une diminution de la survie par négativement affectinrepliement des protéines g. Comme chaperons, PhPFDα et β améliorer le processus de repliement des protéines, par exemple en présence d&#39;alcanes. L&#39;expression de ces gènes conduit à une tolérance améliorée d&#39;hydrocarbures montré un taux de croissance élevé (jusqu&#39;à 50%) dans les présences de 10% de n-hexane dans le milieu de culture ont été observés. En résumé, les résultats indiquent que la boîte à outils permet E. coli à convertir et à tolérer les hydrocarbures dans les milieux aqueux. En tant que tel, il constitue une première étape vers une solution durable pour le pétrole-remédiation en utilisant une approche de biologie synthétique.

Conversion des alcanes
L'activité des trois étapes d'oxydation allant de l'alcane à l'acide gras correspondant a été évaluée à l'aide de tests sur cellules au repos et de mesures de l'activité enzymatique. Les résultats sont présentés selon les réactions du chemin métabolique : (1) hydroxylase des alcanes, (2) déshydrogénase de l'alcool et (3) déshydrogénase de l'aldéhyde. 
Pour la première étape, différents plasmides ont été construits pour les alcanes à chaîne moyenne et à chaîne longue. Le...

Un système de régulation automatique durable bactérienne pour l&#39;assainissement des pollutions pétrolières a été conçu en utilisant des pièces interchangeables (ADN BioBricks). Une ingénierie<em&gt; E. coli</em&gt; Les contraintes a été utilisée pour dégrader les alcanes par β-oxydation dans des milieux aqueux toxiques. Les enzymes respectives de différentes espèces ont montré une activité dégradation alcane. En outre, une tolérance accrue à<em&gt; N</em&gt;-Hexane a été réalisée par l&#39;introduction de gènes de bactéries résistantes alcane.

Une boîte à outils pour permettre la conversion d&#39;hydrocarbures en milieu aqueux

Ce travail propose une boîte à outils permettant la conversion des alcanes par Escherichia coli et présente une preuve de concept de son applicabilité. Le ...

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