Une procédure optimisée pour Fluorescence-activated tri cellulaire (FACS) Isolement du système nerveux autonome progéniteurs neuronaux de viscères de souris sur le fœtus

L’objectif global de cette procédure est de dériver une population de progéniteurs neuronaux purifiés à partir des ganglions périphériques du système nerveux. Ceci est accompli en disséquant d’abord l’organe ou les ganglions spécifiques d’intérêt chez les souris fœtales. Les tissus sont ensuite partiellement dissociés pour libérer les cellules individuelles dans les milieux environnants.

Ensuite, la suspension cellulaire est filtrée pour éliminer les amas de tissus résiduels ou les gros agrégats. Enfin, la suspension cellulaire est triée par flux pour isoler la population d’intérêt en fonction de l’expression d’un rapporteur fluorescent dans cette population cellulaire. En fin de compte, les modèles d’expression génique peuvent être comparés entre progéniteurs, isolés à différents stades de développement, ou entre des populations purifiées de différents types de cellules neuronales.

Le principal avantage de cette technique par rapport à l’isolement de populations cellulaires basé sur le marquage d’anticorps est que souvent les réactifs immunitaires ne sont pas disponibles. Cette étiquette des cellules exprimant un gène particulier, des lignées de souris génétiquement modifiées qui produisent des protéines fluorescentes dans des sous-ensembles neuronaux discrets, permettent d’isoler ces populations cellulaires. Bien que nous démontrions cette méthode pour isoler les progéniteurs neuronaux de l’intestin et de la piste neurogène de la bouche, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes modèles qui expriment des rapporteurs fluorescents.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés car elles ont tendance à trop digérer les tissus sources, ce qui entraîne une perte de viabilité cellulaire. Avant de commencer la dissection, observez les embryons à l’aide d’un éclairage en fond clair pour vous assurer que les structures pertinentes sont nettes. Ensuite, identifiez les embryons transgéniques positifs en dépistant l’expression du rapporteur fluorescent à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent.

Après l’euthanasie, les embryons commencent par ajouter une quantité minimale de PBS dans la boîte de dissection, de sorte que l’embryon ne flotte pas pendant que les tissus sont disséqués. Ouvrez la peau de l’embryon le long des côtés du corps et à travers l’abdomen au niveau du foie. Faites rouler l’embryon sur le dos et utilisez des pinces fines pour le fixer en place.

Au niveau du membre antérieur, insérez une autre paire de pinces au niveau du diaphragme, puis vivement. Tirez les organes internes vers le bas vers la queue et loin de la paroi dorsale du corps pour retirer les viscères du foie jusqu’au tubercule génital. Si des organes de la cavité thoracique, tels que le cœur ou les poumons, ressortent attachés aux viscères, retirez-les avant de continuer.

Une fois que les viscères abdominaux sont séparés de la carcasse, insérez une paire de pinces sous le foie, près de l’estomac, et éloignez doucement le foie de l’intestin. Ensuite, disséquez soigneusement l’intestin postérieur en l’éloignant de l’urètre dorsal et retirez l’intestin du tractus urogénital. Enfin, retournez l’intestin pour que la rate soit visible sous l’estomac.

Retirez la rate et le pancréas. Séparez les boucles de l’intestin en tenant le mésentary. Ensuite, retirez le mésentaire et le système vasculaire qui l’accompagne de l’intestin en tirant doucement sur le mésentary.

Évitez de tenir l’intestin directement avec la pince. Si l’intestin se brise, il suffit de regrouper les morceaux séparés au stade de la dissociation. Regroupez chaque type de tissu dans un tube conique de 15 millilitres contenant du HBSS glacé selon le type de tissu et le type de phénotype de l’embryon.

Après la granulation, les tissus sous-disséqués aspirent autant de HBSS que possible. Remettez ensuite en suspension la pastille de tissu dans un à plusieurs millilitres d’ACU max. Changement des pointes de pipette entre chaque échantillon.

Pour éviter la contamination croisée des types de tissus, placez les tubes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 20 à 45 minutes. Selon le stade du tissu isolé, la dissociation et le filtrage du tissu sont la partie la plus délicate de la procédure pour prévenir la dissociation manifeste du tissu. Et par conséquent, une faible viabilité cellulaire.

Limitez le temps de dissociation et n’essayez pas de dissocier complètement tous les morceaux de tissu à mi-chemin. Et à la fin du temps de dissociation, brisez manuellement le tissu en frappant vigoureusement le tube contre le côté du bain-marie et en projetant le tube vers le bas avec un mouvement de claquement du poignet. Déplacez maintenant les échantillons dissociés sur de la glace et ajoutez immédiatement un millilitre de trempe fraîchement préparée dans chaque tube à l’aide d’une nouvelle pointe de pipette pour chaque échantillon, triez l’échantillon de haut en bas jusqu’à ce que le tissu soit presque complètement dissocié.

Maintenant, à l’aide d’une paire de pinces stérilisées à l’éthanol, placez un carré de trois centimètres de membrane en nylon de 38 microns sur l’embouchure d’un nouveau tube conique de 15 millilitres. Ensuite, à l’aide d’embouts à alésage étroit, filtrez la solution individuelle de cellules en suspension à travers le maillage en pipetant au centre de la membrane. Une fois la suspension cellulaire filtrée, rincez le tube d’échantillon avec un millilitre de trempe de un à cinq et filtrez les cellules restantes.

Retirez ensuite la membrane en prenant soin d’empêcher les échantillons de tissus non filtrés de pénétrer dans le tube. Après la granulation, les suspensions cellulaires aspirent le surnageant et remettent le granulé en suspension dans un millilitre de trempe un à cinq. Filtrez ensuite chaque suspension cellulaire à travers un maillage en nylon dans des tubes de polystyrène de cinq millilitres, comme illustré ci-dessous.

Commencez par réserver une petite aliquote de l’échantillon de fluorescence pour le contrôle de compensation EGFP uniquement. Divisez ensuite l’échantillon de tissu de type sauvage en deux parties, en étiquetant l’une uniquement de type sauvage et les sept autres A, a, d.Only. Remplissez maintenant tous les tubes d’échantillon avec une trempe de un à cinq, et après avoir granulé les échantillons, aspirez tous les microlitres de surnageant, sauf les 200 derniers microlitres dans chaque tube.

Enfin, ajoutez sept a a d aux échantillons à trier et les sept a a d uniquement de contrôle. Ajoutez ensuite 0,75 millilitre de triazole LS à une micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre. Les tubes de prélèvement d’échantillons commencent par utiliser les échantillons de contrôle pour régler les paramètres de compensation et les portes afin d’éviter sept cellules mortes positives A a D et de collecter des cellules présentant une forte intensité de fluorescence GFP.

Après avoir réglé les paramètres de compensation, commencez le tri à la pression la plus basse possible avec une buse à large alésage et un faible débit. Collectez un maximum de 25 000 cellules dans chaque microtube à centrifuger afin que le triol LS ne soit pas trop dilué. Immédiatement après le tri vortex, chaque tube de cellules capturé dans le triol ls.

Dans cette première figure, un appareil génital européen entier à 15,5 jours après le coït vu ventralement sous un éclairage en fond clair est montré ici. Le même échantillon est observé sous éclairage de fluorescence Pour démontrer la distribution des cellules EGFP positives dans les ganglions coeliaques surrénaliens et médiaux, identifiés par leur expression du transgène TH EGFP. Cette vue latérale d’une vessie sous-disséquée 15,5 jours après le cotus TH EGFP montre la fluorescence de l’expression du transgène dans les ganglions pelviens, la paroi de la vessie et l’urètre.

Dans cette vue dorsale de la même EGFP, des cellules positives sont évidentes dans l’urètre dorsal antérieur La dissociation du tissu pour produire des suspensions cellulaires pour le tri du flux est un équilibre délicat entre une digestion enzymatique adéquate et l’évitement d’une surdigestion qui peut entraîner de faibles variabilités cellulaires. Ces photomicrographies montrent les tissus du tractus urogénital inférieur et de l’intestin à mi-chemin du temps de dissociation. Comme on le voit sur ces photos de tissus correctement digérés avant et après le manuel, trois morceaux d’organes sous-disséqués sont encore clairement évidents dans les tissus qui sont traités enzymatiquement pendant trop longtemps ou à une concentration trop élevée d’enzyme.

Cependant, la suspension résultante n’a pas de gros morceaux résiduels de tissu Une dissociation appropriée et le filtrage manuel produit des profils de cytométrie en flux qui présentent généralement plus de 90 % de cellules viables et les cellules exprimant le rapporteur dans cette population viable, les cellules conservent une expression EGFP de haute intensité. La population noire est composée de cellules uniques qui sont mortes et étiquetées par l’absorption de sept puces de fluorescence. La population grise est composée de cellules singulet basées sur la diffusion directe et latérale qui ont exclu sept a a d, et sont donc viables.

La population verte provient de la zone fermée positive à la GFP et est composée de cellules viables uniques qui ont exclu sept A a d et qui présentent une fluorescence EGFP. Grâce à cette procédure, l’isolement des progéniteurs neuronaux d’autres tissus périphériques comme la chaîne sympathique, la racine dorsale, les ganglions ou les poumons peut être effectué afin de répondre à des questions sur les différences dans les profils d’expression génique entre les populations ou sur le développement de lignées distinctes.