Name: Un test galvanotaxie pour lanalyse de la cinétique précurseurs neuronaux migration des cellules dans un champ appliqué de lextérieur électrique à courant continu (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Découvrez la galvanotaxie des précurseurs neuronaux adultes dans un champ électrique continu. Cette méthode utilise des chambres Galvan Axxis et l'imagerie en time-lapse pour étudier la migration cellulaire dirigée et ses applications en réparation nerveuse.

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Ce travail est financé en sciences naturelles et en génie du Canada (subvention no 249669, 482986 et #) et la Fondation des maladies du Canada (subvention no 485508). Les auteurs tiennent à remercier Youssef El-Hayek et le Dr Qi Wan pour leur aide dans l&#39;élaboration des protocoles expérimentaux.

Toutes les procédures impliquant la manipulation des animaux ont été approuvés par l&#39;Université de Toronto Comité de protection des animaux, conformément aux directives institutionnelles (protocole n °. 20009387). Les méthodes suivantes doivent être effectuées à l&#39;aide des outils et des techniques stériles, dans une hotte à flux laminaire, le cas échéant. Dans le texte du protocole ci-dessous, l&#39;expression «EFH-SFM» se réfère à un milieu sans sérum supplémenté avec facteur de croissance épidermique, le facteur de croissance des fibroblastes et l&#39;héparine. EFH-SFM est utilisé lorsqu&#39;il examine la galvanotaxie de PNJ indifférenciées parce que ces mitogènes maintenir PNJ dans leur 4 état ​​indifférencié. Lorsque l&#39;on étudie la galvanotaxie de PNJ induites à se différencier en types de cellules matures, &quot;FBS-SFM» se réfère à un milieu sans sérum supplémenté avec 1% de sérum de veau foetal. FBS favorise la différenciation des PNJ dans les phénotypes neuraux matures 5. 1. Isolement et culture des précurseurs neuronaux (Nonmontré dans la vidéo) <ol><li> Anesthésier la souris CD1 (6-8 semaines) avec isofluorane et le sacrifice par dislocation cervicale. </li><li> Arrosez la tête dans l&#39;éthanol à 70% et décapiter l&#39;animal avec des ciseaux pointus dissection. </li><li> Tout en maintenant la tête avec une pince chirurgicale, enlever la peau sur la surface dorsale pour exposer le crâne. </li><li> L&#39;aide d&#39;un scalpel et non. 11 lames, marquer le crâne au niveau du sinus frontal dans l&#39;axe médio-latéral, et aussi le long de la suture sagittale dans le sens rostro-caudal. </li><li> Peler les os pariétaux loin de la tête sans. 7 pinces courbes, en prenant soin de ne pas percer le tissu cérébral. </li><li> Insérez une spatule mince en dessous du cerveau à partir de sous le cervelet et avancer vers les bulbes olfactifs. Tout en tenant le crâne en place avec une pince, tirez doucement sur le cerveau du crâne et placez-la immédiatement dans de la glace-froid liquide céphalo-rachidien artificiel (voir les recettes ci-dessous). </li><li> Sous un microscope de dissection, en utilisant stériledes ciseaux et des pinces à dissection couper le cerveau en deux le long de la ligne médiane. Tournez chaque hémisphère de sorte que la médiane (couper) la surface orientée vers le haut. </li><li> Sélectionnez un hémisphère, et avec la surface interne tournée vers le haut, localisez le bourrelet du corps calleux (région postérieure du corps calleux). </li><li> Faire une incision de la surface du cortex pour le bourrelet du corps calleux long de l&#39;axe dorso-ventral. </li><li> Peler le cortex incisée vers le bulbe olfactif pour exposer les parois médiale et latérale du ventricule latéral. </li><li> Tournez l&#39;hémisphère sorte que la surface dorsale orientée vers le haut, et l&#39;utilisation microciseaux courbes à découper et à recueillir les murs exposés médial et latéral, qui contiennent la région périventriculaire où résident les PNJ 6. </li><li> Répétez les étapes 1.8 à 1.11 pour l&#39;autre hémisphère. </li><li> Pipeter le tissu isolé dans 7 ml de solution de trypsine (voir recette ci-dessous) dans un tube de 15 ml, et placer le tube sur une bascule dans un 37 ° Cincubateur pendant 25 min. </li><li> Centrifuger le tube à 1500 tours par minute pendant 5 minutes, aspirer le surnageant et remettre en suspension le tissu dans 2 ml de solution d&#39;inhibiteur de trypsine (voir recette ci-dessous). </li><li> Doucement triturer le tissu avec un petit trou de forage pipette Pasteur 30-50 fois avec soin pour éviter les bulles d&#39;air. </li><li> Centrifuger le tube à 1500 tours par minute pendant 5 minutes, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 1-2 ml de GDF (voir recette ci-dessous) en triturant le culot 3-5 fois. </li><li> Centrifuger le tube à 1500 tours par minute pendant 3 minutes, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de GDF + EFH. </li><li> Comptez vivre densité cellulaire avec un hémocytomètre et la plaque des cellules dans un flacon T25 culture à une densité de 10 cellules par ml dans GDF + EFH. </li><li> Permettre à la culture de se développer pendant 7 jours non perturbées pour produire flottants neurosphères primaires composées de PNJ. </li></ol> 2. Galvanotaxie Chambre Préparation <ol><li> Placez verre 3 carrés non. 1 lamelles (22 x 22 x 0,17 mm) ina bouteille d&#39;acide chlorhydrique 6N pendant la nuit. </li><li> Le lendemain, utilisez un diamant à pointe de verre cutter pour couper 6 bandes rectangulaires (22 x 5 x 0,17 mm) de verre à partir de carré. 1 lamelles. </li><li> Transférez les bordereaux lavés à l&#39;acide carrés et rectangulaires glisse dans une hotte à flux laminaire. Laver les barrettes rectangulaires et carrées d&#39;abord avec l&#39;éthanol à 70%, puis avec la culture de tissus de qualité de l&#39;eau en autoclave, et laisser sécher sur une Kim Wipe (pour la stérilité ajouté, le verre peut être autorisé à air sec). </li><li> Appliquer de la graisse à vide à la périphérie d&#39;une surface des lames de verre carrés, et les sceller à la base de boîtes de 60 mm de Pétri en plastique. </li><li> Appliquer de la graisse à vide le long de l&#39;axe long d&#39;une surface de la bande de verre rectangulaires, et les sceller aux bords opposés de la lame de verre carrés (de telle sorte qu&#39;ils soient parallèles les unes aux autres), afin de créer un creux central. </li><li> UV-stériliser les chambres pendant au moins 15 min dans la hotte à flux laminaire. </li><li> Pipette 250-300 ul de poly-L-Lysine sur la cuvette centrale des chambres et incuber à température ambiante pendant 2 heures. </li><li> Environ 15 min avant la fin de la période d&#39;incubation, préparer la solution de Matrigel (voir recette ci-dessous). </li><li> Aspirer le poly-L-lysine, se laver les bacs centrales avec 1 ml d&#39;eau autoclave, et la pipette 250-300 ul de solution de Matrigel sur les creux central. </li><li> Incuber les chambres à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Aspirer la solution de Matrigel et laver délicatement les creux central avec 1-2 ml de GDF. </li><li> Pipette 100 ul d&#39;EFH-GDF ou FBS-GDF sur les creux central et transférer les chambres galvanotaxie sur la scène d&#39;un comptage au microscope. </li><li> Pipette 3-4 ml de la culture contenant de neurosphères dans une boîte de Petri de 60 mm et transférer la boîte de Pétri à l&#39;étape de comptage au microscope. </li><li> Un objectif de vision de 5x, utiliser une pipette P10 pour transférer 5-8 neurosphères entiers (jusqu&#39;à quatre à la fois) sur la cuvette centrale de chaque galvanotaxiechambre sans les dissocier, et soigneusement répartis les neurosphères autour de la cuvette centrale, sans perturber le substrat Matrigel. </li><li> Ajouter un supplément de 150 à 200 pi d&#39;EFH-GDF ou FBS-GDF sur les creux central. </li><li> Transférez les chambres galvanotaxie dans un 37 ° C, 5% de CO 2, 100% incubateur humidifié pour 17-20 heures (si l&#39;analyse PNJ indifférenciées) pour permettre à l&#39;neurosphères à adhérer au substrat Matrigel et se dissocier en cellules individuelles comme le montre la figure 1 . Si l&#39;analyse de PNJ différenciés, la période d&#39;incubation devrait être étendu aux 69-72 h pour permettre la différenciation des cellules. </li></ol> 3. Vivez cellulaire imagerie time-lapse <ol><li> Permettre au système d&#39;imagerie de cellules vivantes s&#39;équilibrer à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant au moins 30 minutes avant le début de l&#39;enregistrement time-lapse. </li><li> Coupez deux 12 pièces de 1 cm de diamètre mm Argent fil, bobine eux d&#39;un bout, et les placer dans Clorox blixiviation pendant 20 min pour former électrodes Ag / AgCl. </li><li> Transférez les chambres galvanotaxie sur la scène d&#39;un comptage au microscope et sélectionnez cette chambre sera utilisé pour des cellules vivantes analyse de la migration d&#39;imagerie basée sur les critères suivants: i) les neurosphères devrait être presque complètement dissocié dans des cellules individuelles et ii) les cellules doivent posséder morphologies rondes avec petits-à-pas de processus qui s&#39;étend des corps cellulaires. </li><li> Transférer la chambre galvanotaxie sélectionné dans une hotte à flux laminaire, avec un pas de carré séparé. 1 lamelle de verre et de graisse à vide. </li><li> Laver le capot coulissant première à l&#39;éthanol 70%, puis avec de l&#39;eau en autoclave, et à appliquer une bande de graisse à vide sur deux bords parallèles de la lamelle. </li><li> Aspirer les milieux de culture à partir de la goulotte centrale de la chambre, puis de placer rapidement la lamelle (graisse du côté orienté vers le bas) sur la chambre de telle sorte que le reste des bandes de graisse sur les deux bandes parallèles de verre rectangulaires, créant ainsi un toità la chambre. </li><li> Pipeter 100 pi de frais EFH-GDF ou FBS-SFM dans le creux central par capillarité. </li><li> Utiliser la graisse à vide pour créer des bordures pour les piscines de milieux de culture sur chaque extrémité de la goulotte centrale, comme représenté sur la figure 2. </li><li> Coupez deux 15 pièces cm de tuyau en PVC, et d&#39;utiliser une seringue de 10 cc avec une aiguille de calibre 18 pour injecter la solution d&#39;agarose soigneusement dans le tube, veiller à ce qu&#39;aucune des bulles se forment dans les tubes, et laisser solidifier le gel pendant 5 min. </li><li> Transférer la chambre galvanotaxie pour le système d&#39;imagerie de cellules vivantes, ainsi que le gel d&#39;agarose à tubes, Ag / AgCl, et une paire de boîtes de Petri vides 60 mm qui sera utilisé comme milieu de culture et des réservoirs contient de l&#39;Ag / AgCl. Permettre à la chambre galvanotaxie à reposer à l&#39;intérieur de la 37 ° C, 5% CO 2 environnement de 20-30 min. </li><li> Pendant ce temps, préparez les couvercles des boîtes de Pétri vides 2 et le couvercle de la boîte de Petri de la chambre galvanotaxie par des trous de forageen y dermiques ou un outil similaire à celui représenté sur la figure 3. </li><li> Pipette 1-1,5 ml d&#39;EFH-GDF ou FBS-SFM sur chaque côté de la cuvette centrale, et 7-8 ml de la GDF dans chaque boîte de Pétri vide. Placez une boîte de Pétri de chaque côté de la cuvette centrale de la chambre galvanotaxie et placez un Ag / AgCl dans chaque boîte. Combler l&#39;écart entre la chambre galvanotaxie et les boîtes de Pétri à établir une continuité électrique avec les ponts gel d&#39;agarose, comme le montre la figure 4. </li><li> Connecter les électrodes Ag / AgCl à une alimentation externe, avec un ampèremètre en série pour mesurer le courant électrique, et allumez l&#39;alimentation. Utiliser un voltmètre pour mesurer la force du champ électrique directement à travers la cuvette centrale, et ajuster le débit de l&#39;alimentation en énergie jusqu&#39;à ce que l&#39;intensité du champ électrique souhaité est atteint (les dosages effectués dans ce laboratoire utiliser une résistance DCEF de 250 mV / mm courant électrique entre 1 et 1,5 mA). </li><li> Initiativete du module time-lapse sur le système d&#39;imagerie de cellules vivantes, et de permettre l&#39;expérience de courir pour la durée souhaitée. Après l&#39;achèvement de l&#39;essai, fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 4% pour une analyse immunohistochimique standard. </li></ol>

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<li>Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+competence+is+a+rare+property+of+neural+stem+cells+that+may+depend+on+genetic+and+epigenetic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations.</a> Nat. Med. 8, 268-273 (2002).</li>
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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Ce protocole a été adapté à partir des méthodes bien établies d&#39;études antérieures 7-9. Galvanotactic chambres peuvent être construits en utilisant une variété de techniques différentes, y compris la construction d&#39;un verre séparé bien pour le confinement de l&#39;ensemencement des cellules, ou par ablation laser CO 2 pour la microfabrication de la cuvette centrale 10,11. Certaines techniques peuvent être plus laborieux ou coûteux que d&#39;autres. Nous avons décrit un dosage sim...

<table border="1"><tbody><tr><td height="44"> Nom de l&#39;objet </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Neural Isolement de cellules précurseurs </td></tr><tr><td> 2M NaCl </td><td> Sigma </td><td> S5886 </td><td> 11,688 g dans 100 ml dH O 2 </td></tr><tr><td> 1M KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> 7,456 g dans 100 ml dH O 2 </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M2393 </td><td> 20,33 g dans 100 ml dH O 2 </td></tr><tr><td> 155 mM NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td><td> 1,302 g dans 100 ml dH O 2 </td></tr><tr><td> Glucose 0,5 M </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td> 9,01 g dissous dans 100ml dH 2 O </td></tr><tr><td> 108 mM de CaCl 2 </td><td> Sigma </td><td> C7902 </td><td> 1,59 g dans 100 ml dH O 2 </td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine pancréatique bovine </td><td> Sigma </td><td> T1005 </td><td></td></tr><tr><td> Sheep testicules hyaluronidase </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide Kynurenic </td><td> Sigma </td><td> K3375 </td><td></td></tr><tr><td> Ovomucoïde inhibiteur de trypsine </td><td> Worthington </td><td> LS003086 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100046 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 21700075 </td><td></td></tr><tr><td> Glucose à 30% </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td></td></tr><tr><td> 7,5% de NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td><td> 23,83 g dans 100 ml dH O 2 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> FEM </td><td> Invitrogen </td><td> PMG8041 </td><td> Reconstituer dans 1 ml de mélange d&#39;hormones et aliquote en 20 unités ul. </td></tr><tr><td> FGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0226 </td><td> Reconstituer dans 0,5 ml de mélange d&#39;hormones et aliquote en 20 unités ul. </td></tr><tr><td> L&#39;héparine </td><td> Sigma </td><td> H3149 </td><td></td></tr><tr><td> Apo-transferrine </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 3188-AT </td><td> 0,1 g dissous dans 4 ml dH 2 0 </td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> Sigma </td><td> P7505 </td><td> Dissoudre 9,61 mg dans Apo-transferrine afinlution </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> Sigma </td><td> I5500 </td><td> Dissolvez 25 mg dans 0,5 ml de HCl 0,1 N et ajouter à 3,5 ml de dH 2 0 </td></tr><tr><td> Sélénium </td><td> Sigma </td><td> S9133 </td><td></td></tr><tr><td> La progestérone </td><td> Sigma </td><td> P6149 </td><td></td></tr><tr><td> Outils de dissection standard </td><td> Outils Fine Science </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td> Zeiss </td><td> Stemi 2000 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Galvanotaxie Chambre Préparation </td></tr><tr><td> Carrés diapositives couvercle en verre </td><td> VWR </td><td> 16004 </td><td></td></tr><tr><td> Acide chlorhydrique 6N </td><td> VWR </td><td> BDH3204-1 </td><td></td></tr><tr><td> Graisse à vide élevé </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 60 mm boîtes de Pétri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> La poly-L-lysine </td><td> Sigma </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td> Décongeler et aliquote de 150 unités en pl </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td><td> N&#39;utiliser que si induction de la différenciation PNJ, sinon utilisez GDF + milieux de culture EFH comme indiqué ci-dessus </td></tr><tr><td> Compter microscope </td><td> Olympe </td><td> CKX41 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Vivez cellulaire imagerie time-lapse </td></tr><tr><td> Fil d&#39;argent </td><td> Alfa Aesar </td><td> 11434 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td></td></tr><tr><td> La chaleur inactivitéFBS ATED </td><td> Sigma </td><td> 16140071 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes en PVC </td><td> Fisher Scientific </td><td> 80000006 </td><td> 3/32 &quot;ID x 5/32&quot; OD </td></tr><tr><td> Javellisant </td><td> Clorox </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 10 cc </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguille 18 de calibre </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td></td></tr><tr><td> Perceuse Dremel </td><td> Dremel </td><td> Modèle 750 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope inversé équipé humidifié, chambre incubé </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert-200M </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Recettes <table border="1"><tbody><tr><td> Article </td><td> Volume </td></tr><tr><td> 2M NaCl </td><td> 6,2 ml </td></tr><tr><td>1M KCl </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 0,32 ml </td></tr><tr><td> 155mm NaHCO 3 </td><td> 16,9 ml </td></tr><tr><td> Le glucose 1M </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 108 mM de CaCl 2 </td><td> 0,09256 ml </td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> L&#39;eau autoclavée </td><td> 74 ml </td></tr></tbody></table> Liquide céphalo-rachidien artificiel <table border="1"><tbody><tr><td> Article </td><td> Volume ou de masse </td></tr><tr><td> Liquide céphalo-rachidien artificiel </td><td> 30 ml </td></tr><tr><td> Trypsine pancréatique bovine </td><td> 40 mg </td></tr><tr><td> Sheep testicules hyaluronidase </td><td> 22,8 mg </td></tr><tr><td> L&#39;acide Kynurenic </td><td> 5 mg </td></tr></tbody></table> &lt;strong&gt; Solution de trypsine <table border="1"><tbody><tr><td> Article </td><td> Volume ou de masse </td></tr><tr><td> GDF </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Ovomucoïde inhibiteur de trypsine </td><td> 10 mg </td></tr></tbody></table> Solution inhibiteur de la trypsine <table border="1"><tbody><tr><td> Article </td><td> Volume </td></tr><tr><td> L&#39;eau autoclavée </td><td> 37 ml </td></tr><tr><td> 10X DMEM/F12 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Glucose à 30% </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> 7,5% de NaHCO 3 </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> Transferrine, putrescine solution </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Une solution à 25 mg d&#39;insuline </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Sélénium </td><td> 100 &amp; mu; L </td></tr><tr><td> La progestérone </td><td> 100 pi </td></tr></tbody></table> Mix Hormone (100 ml au total, conserver à -20 ° C) <table border="1"><tbody><tr><td> Article </td><td> Volume </td></tr><tr><td> L&#39;eau autoclavée </td><td> 37,5 ml </td></tr><tr><td> DMEM/F12 10X (3:1) </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Glucose à 30% </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 7,5% de NaHCO 3 </td><td> 0,75 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> 0,25 ml </td></tr><tr><td> Mélange hormone </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> Sérum Free Media EFH-GDF: ajouter 10 ul d&#39;EGF, 10 pi de FGF, et 3,66 ul d&#39;héparine FBS-GDF: ajouter 0,5 ml de FBS <tafrontière ble = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Article </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> 150 pi </td></tr><tr><td> GDF </td><td> 3,6 ml </td></tr></tbody></table> Matrigel Solution Matrigel aliquote doit être placé dans une boîte de glace et de laisser se décongeler lentement au fil 4-5 heures pour former un liquide visqueux avant mélange avec l&#39;AFD. Cela permettra d&#39;assurer la formation d&#39;une fine couche de substrat Matrigel. Si ce n&#39;est pas décongelé lentement, le substrat résultant contiendra des touffes de Matrigel, éventuellement entraver la migration des cellules. <table border="1"><tbody><tr><td> Article </td><td> Volume ou de masse </td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> 300 mg dans 10 ml ddH 2 0 </td></tr><tr><td> GDF FBS inactivé chaleur </td><td> 8 ml 2 ml </td></tr></tbody></table> MatrigelSolution Mix 8 ml de GDF avec 2 ml de FBS inactivé de la chaleur dans un tube de 15 cc faucon. Mix d&#39;agarose avec 10 ml ddH 2 0 dans un erlenmeyer, et de la chaleur au micro-ondes pendant 30 secondes à 10 sec intervalles, en veillant à éliminer la solution du micro-ondes après chaque intervalle de 10 sec et bien mélanger. Suite à la dernière période de 10 secondes à micro-ondes, mélanger la solution d&#39;agarose avec la SFM / solution FBS et le ranger dans un bain de 57 ° C de l&#39;eau. </td></tr></tbody></table>

un test galvanotaxie pour l&#39;analyse de la cinétique précurseurs neuronaux migration des cellules dans un champ appliqué de l&#39;extérieur électrique à courant continu

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

La découverte des cellules souches et des cellules progénitrices neurales (collectivement appelées cellules précurseurs neurales) (PNJ) dans le cerveau des mammifères adultes a conduit à un ensemble de recherches visant à utiliser les propriétés multipotentes et de prolifération de ces cellules pour le développement de stratégies neuroregenerative. Une étape cruciale pour le succès de ces stratégies est la mobilisation des PNJ vers un site de lésion consécutive à une transplantation ou exogène pour améliorer la réponse des précurseurs endogènes que l&#39;on trouve dans la région périventriculaire du système nerveux central. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les mécanismes qui favorisent, d&#39;orienter et d&#39;améliorer la migration PNJ. Notre travail se concentre sur l&#39;utilisation du courant continu champs électriques (dcEFs) de promouvoir et de migration directe PNJ - un phénomène connu sous le nom galvanotaxie. Endogènes physiologiques des champs électriques fonctionnent comme des repères essentiels pour la migration cellulaire au cours du développement normal et la cicatrisation des plaies. La perturbation pharmacologique dutension du tube neural chez trans-embryons axolotl provoque de graves malformations du développement 1. Dans le contexte de la cicatrisation, le taux de réparation de la cornée blessés est directement corrélée à l&#39;ampleur du potentiel de blessure épithéliale qui se pose après une blessure, comme le montre l&#39;amélioration pharmacologique ou l&#39;interruption de ce dCEF 2-3. Nous avons démontré que les adultes subissent PNJ sous-épendymaires rapide et dirigé la migration cathodique in vitro lorsqu&#39;elles sont exposées à un dCEF appliqué de l&#39;extérieur. Dans ce protocole, nous allons décrire les techniques de notre laboratoire pour la création d&#39;un test galvanotaxie simple et efficace à haute résolution, observation à long terme de la translocation de cellule du corps dirigé (migration) sur un seul niveau de cellules. Ce test serait approprié pour étudier les mécanismes qui régulent la transduction dCEF dans la motilité cellulaire grâce à l&#39;utilisation de souris transgéniques ou knock-out, courts ARN interférents ou des agonistes / antagonistes des récepteurs spécifiques.

L&#39;analyse cinématique révèle que, en présence d&#39;une mesure de 250 mV / mm dCEF, les PNJ indifférenciées présentent galvanotaxie très rapide et dirigés vers la cathode (figure 5A, Film 1). En l&#39;absence d&#39;un dCEF, le mouvement aléatoire des cellules est observée (figure 5B, Film 2). A ce champ,&gt; 98% des PNJ indifférenciées migrer pour la de 6-8 heures pour lesquelles ils sont imagés, et depuis les cellules mortes ne migrent pas ce qui suggère qu&#39;ils restent viables ...

Dans ce protocole, nous allons montrer comment construire des chambres personnalisées qui permettent l&#39;application d&#39;un champ électrique à courant continu pour permettre imagerie time-lapse de cerveau adulte dérivé de neurones translocation cellule précurseur pendant galvanotaxie.

Un test galvanotaxie pour l&#39;analyse de la cinétique précurseurs neuronaux migration des cellules dans un champ appliqué de l&#39;extérieur électrique à courant continu

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser la migration de cellules souches neurales adultes en présence d'un champ électrique en courant continu. Cela est réalisé en isolant et en cultivant d'abord des cellules souches neurales subépendymaires provenant de la souris adulte. L'étape suivante consiste à préparer les chambres Galvan Axxis et à transférer les cellules souches neurales sur ces chambres.La dernière étape consiste à appliquer un champ électrique en courant continu à travers la chambre Galvan Axxis et à réaliser une imagerie en lapse de temps afin d'observer la migration des précurseurs neuronaux. En fin de compte, la microscopie d'imagerie en lapse de temps capture les propriétés galvanotactiques des précurseurs neuronaux dans leurs états différenciés et indifférenciés. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la galvanotaxie des cellules précurseurs neuronaux, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels qu'un modèle de stroke chez la souris pour le recrutement des précurseurs neuronaux vers les sites de lésion afin d'améliorer la réparation neuronale.La démonstration de la procédure sera effectuée par Rob Pilley, étudiant

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Nous démontrons que la surexpression du facteur de croissance épidermique récepteurs (EGFR) améliore la motilité des cellules souches neurales (NSC) en utilisant un roman sur gel d'agarose dispositif basé microfluidique. Cette technologie peut être facilement adaptable à d'autres systèmes cellulaires de mammifères où les sources de cellules sont rares, telles que des cellules souches neurales, et le tour autour du temps est critique.

Évaluer la motilité Neural Stem Cell utilisant un gel d&#39;agarose à base dispositif microfluidique

Imagerie laps de temps de culture de tissu en 3D permet d'étudier le comportement migratoire des cellules individuelles en provenance éminence ganglionnaire en réaction à extraire la protéine fractionnée à partir du cortex cérébral.

Comportement migratoire des cellules générées dans les cultures éminence ganglionnaire

Ce protocole illustre des méthodes utilisées pour établir des environnements 2D et 3D dans les chambres electrotactic conçus sur mesure, qui permettent de suivre les...

Champ électrique contrôlé par les migrations des Réalisé cellules progénitrices neurales dans des environnements 2D et 3D

Les chercheurs peuvent déclencher un mouvement à la demande chez C. elegans en appliquant un champ électrique que les vers détectent et auquel ils répondent. Cette vidéo présente le comportement électrotaxique et montre un exemple de protocole réalisé dans un dispositif microfluidique.

Dosage par électrotaxie : une méthode pour observer la locomotion chez C. elegans

la migration des neuroblastes est un événement fondamental dans la neurogenèse postnatale. Nous décrivons un protocole pour l'étiquetage efficace des neuroblastes par électroporation in vivo postnatale et la visualisation ultérieure de leur migration à l'aide de l'imagerie time-lapse de tranches de cerveau de courte durée. Nous incluons une description pour l'analyse quantitative de la dynamique des neuroblastes par suivi vidéo.

In vivo postnatale électroporation et imagerie time-lapse de neuroblaste migrations dans Souris aiguë tranches du cerveau

Nous présentons une méthode pour appliquer un champ électrique physiologique à des cellules prostatiques migratrices et immortalisées dans une chambre de galvanotaxie sur mesure. En utilisant cette méthode, nous démontrons que 2 lignées de cellules prostatiques non tumorigènes présentent différents degrés de directionnalité de migration sur le terrain.

Utilisant conçus sur mesure galvanotaxie Chambers à étudier directionnel migration des cellules de la prostate

De nombreux dispositifs microfluidiques ont été développés pour être utilisés dans l’étude de l’électrotaxie. Pourtant, aucune de ces puces ne permet d’étudier efficacement les effets simultanés des champs chimiques et électriques (FE) sur les cellules. Nous avons mis au point un dispositif à base de polyméthacrylate de méthyle qui offre une stimulation coexistante et chimique mieux contrôlée pour la recherche sur l’électrotaxie.

Électrotaxie l&#39;étude des cellules du cancer du poumon à l&#39;aide d&#39;un double-Multichannel champ électrique microfluidique Chip

Les forces mécaniques sont importantes pour contrôler la migration cellulaire. Ce protocole démontre l'utilisation d'hydrogels élastiques qui peuvent être déformés à l'aide d'une micropipette en verre et d'un micromanipulateur pour stimuler les cellules avec un gradient de rigidité local pour provoquer des changements dans la structure cellulaire et la migration.

Exemple de Durotaxis à cellule unique pour évaluer le contrôle mécanique du mouvement cellulaire et les événements de signalisation connexes

Nous présentons trois essais in vitro simples -l'analyse de migration à longue distance, l'analyse de migration de co-culture, et l'analyse de chimio-attraction--qui évaluent collectivement les fonctions des cellules souches humaines dérivées des cellules périventriculaires endothéliales et de leur interaction avec les interneurons GABAergic.

Migrations, Chemo-Attraction et Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons (en anglais)

Dans cette étude, nous présentons un protocole pour la différenciation des cellules souches neurales et progénitrices (PNJ) uniquement induite par la stimulation par impulsions à courant direct (DC) dans un système microfluidique.

Différenciation des cellules précurseurs neuronales induites par le champ électrique dans les appareils microfluidiques

Découvrez la galvanotaxie des précurseurs neuronaux adultes dans un champ électrique continu. Cette méthode utilise des chambres Galvan Axxis et l'imagerie en time-lapse pour étudier la migration cellulaire dirigée et ses applications en réparation nerveuse.

Un test galvanotaxie pour lanalyse de la cinétique précurseurs neuronaux migration des cellules dans un champ appliqué de lextérieur électrique à courant continu (Vidéo) | JoVE Journal

Un test galvanotaxie pour l'analyse de la cinétique précurseurs neuronaux migration des cellules dans un champ appliqué de l'extérieur électrique à courant continu

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