Un test galvanotaxie pour l'analyse de la cinétique précurseurs neuronaux migration des cellules dans un champ appliqué de l'extérieur électrique à courant continu

L’objectif global de cette procédure est de visualiser la migration de cellules précurseurs neurales dérivées d’adultes en présence d’un champ électrique à courant continu. Pour ce faire, on isole et cultive d’abord des cellules précurseurs neurales sous-épendymaires de souris adultes. L’étape suivante consiste à préparer les chambres de Galvan Axxis et à transférer les cellules précurseurs neurales dans les chambres.

La dernière étape consiste à appliquer un champ électrique à courant continu à travers la chambre Galvan Axxis et à effectuer une imagerie en accéléré pour observer la migration des précurseurs neurologiques. En fin de compte, la microscopie d’imagerie time-lapse capture les propriétés tactiques de Galvan des précurseurs neurologiques dans leurs états différenciés et indifférenciés. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’oasis galvanique des cellules de précurseurs neurologiques, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels qu’un modèle d’AVC de souris pour le recrutement de précurseurs neurologiques sur les sites de lésion afin d’améliorer la réparation neurologique.

Rob Pilley Post, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Au début de cette procédure, les NPC doivent avoir été en culture pendant sept jours, afin que les neurosphères primaires flottantes soient prêtes à être récoltées. Si nécessaire, commencez à préparer trois chambres Galvan Axxis en plaçant trois verres carrés.

Premièrement, le couvercle se glisse dans une bouteille de six acides chlorhydriques normaux pendant la nuit. Tôt le lendemain, installez le gel matra pour qu’il décongèle lentement sur de la glace. Au bout de quatre heures, il sera prêt à être utilisé pour construire la chambre.

Tout d’abord, utilisez un coupe-verre à pointe de diamant pour couper six bandes rectangulaires de verre dans un nouveau carré. Premièrement, les bordereaux de protection. Transférez les lamelles carrées et rectangulaires lavées à l’acide dans une hotte à flux laminaire.

Lavez les bandes de verre avec de l’éthanol à 70 %, puis de l’eau d’autoclave de qualité culture tissulaire. Laissez-les sécher à l’air libre ou sur du papier non pelucheux. Ensuite, appliquez de la graisse sous vide sur le périmètre d’une surface de chaque lame de verre carrée et scellez-les à la base de plastique de 60 millimètres.

Pétri. Appliquez de la graisse sous vide sur un côté des bandes de verre rectangulaires et scellez-les sur les bords opposés du carré. Glissières en verre pour créer des carrés avec une auge centrale au centre de chaque plat.

Stérilisez ces carrés ou chambres de verre modifié pendant au moins 15 minutes dans une hotte. Ensuite, pipetez 250 à 300 microlitres de polyol lysine sur l’auge centrale des chambres. Ensuite, incubez les chambres à température ambiante pendant deux heures, environ 15 minutes avant la fin de l’incubation.

Préparez la solution de matri gel après deux heures, aspirez le polyol lysine et lavez les auges centrales avec un millilitre d’eau d’autoclave. Ensuite, pipetez 250 à 300 microlitres de solution de gel Matri dans les auges centrales et incubez les chambres à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation, aspirez la solution de matrigel.

Ensuite, lavez délicatement les auges centrales avec un à deux millilitres de SFM. Maintenant, pipetez 100 microlitres de E-F-H-S-F-M ou F-B-S-S-F-M sur les auges centrales en préparation des cellules cultivées. Ensuite, pipetez quatre à cinq millilitres de la sphère neurologique contenant la culture dans une nouvelle boîte de Pétri de 60 millimètres.

Placez ensuite la boîte de Pétri sur la platine du microscope de comptage sous l’objectif de visualisation cinq x. À l’aide d’une pipette P 10, transférez doucement cinq à huit neurosphères entières dans l’auge centrale de chaque chambre. Jusqu’à quatre.

Les neurosphères peuvent être transférées en une seule fois, mais ne les dissociez pas avec les neurosphères dans les auges centrales. Étalez-les soigneusement sans perturber le substrat du matrigel. Ajoutez ensuite 150 microlitres supplémentaires d’E-F-H-S-F-M ou F-B-S-S-F-M sur les auges centrales.

Maintenant, la culture, les cellules dans un incubateur humidifié. Après 17 à 20 heures en culture, les PNJ indifférenciés seront disponibles après 69 à 72 heures. En culture, des PNJ différenciés seront disponibles.

Au microscope comptable, sélectionnez la chambre contenant les meilleures cellules pour l’analyse de migration d’imagerie de cellules vivantes. Les cellules devraient être rondes, presque complètement dissociées de leurs neurosphères et n’ont pas encore, ou viennent tout juste de commencer, à former des processus dans une capuche. Préparez un couvercle de chambre.

Lavez une lamelle carrée en verre avec de l’éthanol à 70 %, puis avec de l’eau autoclavée et appliquez une bande de graisse sous vide sur deux bords parallèles. Couvrez maintenant la chambre. Tout d’abord, aspirez le milieu de culture de l’auge centrale, puis scellez rapidement le couvercle, glissez-le sur les parois rectangulaires comme un toit.

Ensuite, à l’aide de l’action capillaire, chargez 100 microlitres de média frais dans l’auge centrale. Utilisez maintenant de la graisse sous vide pour créer des bordures pour les flaques de milieux de culture. À chaque extrémité de l’auge centrale du système d’imagerie de cellules vivantes, ont préparé des tubes de gel agros, de l’argent, des électrodes de chlorure d’argent et deux boîtes de Pétri de 60 millimètres à utiliser.

En tant que réservoirs de milieux de culture, laissez les chambres reposer dans l’environnement à 37 degrés Celsius 5 % de dioxyde de carbone pendant 20 à 30 minutes. Pendant ce temps, préparez les couvercles des deux boîtes de Pétri vides et le couvercle de la boîte de Pétri des chambres Galvan Axxis en y perçant des trous avec une pipette Dremel ou une pipette à outils, 1,5 à deux millilitres de média de chaque côté de l’auge centrale et ajoutez sept à huit millilitres de SFM dans chaque boîte de Pétri vide. Placez une boîte de Pétri de chaque côté de l’auge centrale de la chambre et placez une électrode dans chaque boîte.

Comblez l’espace entre la chambre et les boîtes de Pétri pour établir une continuité électrique. Avec les ponts en gel Agros, connectez les électrodes à une alimentation externe avec un compteur M en série pour mesurer le courant électrique et allumer l’alimentation. Utilisez un volomètre pour mesurer l’intensité du champ électrique directement à travers l’auge centrale.

Ajustez la sortie de l’alimentation selon vos besoins. Lancez maintenant le module time-lapse sur le système d’imagerie. Dans le logiciel de vision Axio, sélectionnez l’acquisition multidimensionnelle et cliquez sur voir.

Pour les canaux, sélectionnez le canal six, cliquez sur T pour le timelapse. Réglez les paramètres de l’intervalle de temps sur une minute, réglez la durée sur huit heures dans les champs de points de temps avant, après et sélectionnez le point de temps avant et après. Cliquez maintenant sur démarrer et laissez l’expérience se dérouler pendant la durée souhaitée après la fin du test, puis poursuivez avec l’analyse IHC.

L’analyse cinématique a révélé qu’en présence d’un DCEF de 250 millivolts par millimètre, des NPC indifférenciés présentent des axxis galvaniques hautement dirigés et rapides vers la cathode à cette intensité de champ, plus de 98 % des NPC indifférenciés ont migré pendant les six à huit heures pendant lesquelles ils ont été imagés. En l’absence de A-D-C-E-F. Un mouvement aléatoire des cellules a été observé.

Comme les cellules mortes ne migrent pas, cela suggère qu’elles restent viables pendant cette période. En l’absence ou la présence de A-D-C-E-F, les phénotypes différenciés ont subi une migration négligeable, à la fois en présence et en l’absence de sous-ensembles A-D-C-E-F de cellules différenciées. Des processus étendus qui avaient tendance à s’aligner perpendiculairement à la direction du DCEF, mais aucune translocation notable du corps cellulaire n’a été observée.

L’immunomarquage a vérifié que les NPC maintenaient une expression positive du nid du marqueur précurseur neural après six heures d’exposition aux FE DC. Dans les essais impliquant des NPC induits à se différencier en phénotypes matures, la majorité des cellules expriment le marqueur astrocytaire mature protéine acide fibrillaire gliale ou GFAP après six heures d’exposition au DCEF. À la suite de cette procédure, on peut acquérir des informations sur les mécanismes cellulaires impliqués dans la transduction du champ électrique à courant continu en motilité cellulaire en utilisant des modèles génétiques knock-out.

Ou monsieur, un par exemple.