Electricité-libre, l'acide nucléique et séquentielle isolement des protéines

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des acides nucléiques prêts pour la PCR et des protéines immunoréactives à partir d'un échantillon, sans nécessiter d'électricité ni d'infrastructure de laboratoire. L'isolement des acides nucléiques en présence de protéines commence par le mélange de l'échantillon avec de la guanidine et du thiocyanate afin de lyser l'échantillon, puis par le passage du mélange sur le sorbant contenu dans la pipette d'extraction. Après le cinquième et dernier passage sur le sorbant, transférez le mélange dans un tampon d'extraction des protéines et mettez-le de côté pour l'isolement de la protéine immunoréactive.

Ensuite, le sorbant et les acides nucléiques liés sont lavés en faisant passer de l'éthanol à 95 % sur le sorbant. À plusieurs reprises, le sorbant et les acides nucléiques liés sont ensuite séchés en faisant passer de l'air ambiant sur le sorbant pendant cinq minutes. La dernière étape pour l'isolement d'acides nucléiques prêts pour la PCR consiste à éluer les acides nucléiques du sorbant en utilisant 250 microlitres de tris ou une autre solution aqueuse similaire pour l'isolement de la protéine immunoréactive.

Après avoir mélangé l'échantillon et le tampon d'extraction des protéines, utilisez une deuxième pipette d'extraction et faites passer le mélange sur le sorbant 15 fois. L'étape suivante consiste à laver le sorbant contenant la protéine liée en faisant passer de l'éthanol à 95 % plusieurs fois à travers le sorbant. Ensuite, le sorbant et la protéine liée sont séchés en faisant passer de l'air ambiant sur le sorbant pendant cinq minutes.

La dernière étape du protocole consiste à éluer la protéine à partir du sorbant. En fin de compte, la pipette d'extraction utilisée dans cette procédure permet l'isolement, sans électricité, d'acides nucléiques prêts pour la PCR et de protéines immunoréactives. Bonjour, je m'appelle Dave Pawlowski.

Je suis scientifique principal à Kubrick Incorporated à Buffalo, New York, et nous allons apprendre aujourd'hui une technique permettant d'isoler simultanément les protéines et les acides nucléiques en continu, sans avoir besoin de centrifugeuse, de vortex ou de tout autre équipement de laboratoire supplémentaire. Avant la lyse de l'échantillon, assurez-vous que les échantillons sont sous forme liquide. Si l'échantillon est solide, par exemple de la nourriture ou des selles, il doit être mis en suspension dans un milieu liquide tel que de l'eau ou une solution saline tamponnée au phosphate.

Mélanger 500 microlitres de l'échantillon avec 500 microlitres de thiocyanate de guanidine six molaire dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, appuyer sur l'ampoule d'une pipette d'extraction pour en chasser l'air ambiant. Aspirer l'intégralité de l'échantillon d'un millilitre dans la pipette d'extraction, en la faisant passer au-dessus du matériau absorbant, en laissant l'ampoule se dilater lentement.

Retourner l'outil d'extraction de manière à ce que les billes de sorbant et l'échantillon s'écoulent dans l'ampoule. Broyer les billes de sorbant avec l'échantillon dans l'ampoule, en prenant soin de ne pas expulser l'échantillon hors de la pipette d'extraction.

Retournez la pipette d'extraction et expulsez l'échantillon dans le tube d'origine de 1,5 millilitre. Aspirez l'intégralité de l'échantillon d'un millilitre dans la pipette d'extraction en le faisant passer sur le sorbant à vitesse modérée. En prenant soin de maintenir le sorbant dans le col de la pipette d'extraction, expulsez l'intégralité de l'échantillon dans le tube de 1,5 millilitre en appuyant sur la poire.

Répétez ce processus en faisant passer l'échantillon sur le sorbant quatre fois supplémentaires, pour un total de cinq passages. Après le cinquième passage sur le sorbant, éjectez l'ensemble de l'échantillon d'un millilitre dans quatre millilitres de tampon d'extraction des protéines dans un tube conique de 15 millilitres. Mélangez le tube par retournement, puis fermez-le et mettez-le de côté pour une utilisation ultérieure.

Lavez les acides nucléiques isolés en faisant passer un millilitre d'éthanol à 95 % sur le sorbant trois fois de suite, en renvoyant l'éthanol dans son tube d'origine. Lors du dernier passage, répétez le lavage trois fois en utilisant un deuxième millilitre d'éthanol à 95 %. L'étape suivante de la procédure consiste à sécher le sorbant ; la récupération des acides nucléiques est optimale lorsque le sorbant est sec.

Je sais que cette étape est fastidieuse. Toutefois, si vous la réalisez dans le délai recommandé, vos résultats seront meilleurs. Appuyez et relâchez l’ampoule pendant cinq minutes.

Faites passer de l'air ambiant à travers la pipette d'extraction pour sécher les acides nucléiques et le lit du sorbant, puis essuyez l'éthanol résiduel à l'extrémité de la pipette d'extraction. À l'aide d'un essuie-tout Kim, récupérez les acides nucléiques en faisant passer 250 microlitres de triss à 10 millimolaire sur le sorbant cinq fois. Le tampon triss peut être remplacé par toute autre solution aqueuse appropriée, comme le PBS.

La solution obtenue contient les acides nucléiques extraits. Pour effectuer d'abord l'extraction des protéines, mélanger l'échantillon dans le tampon d'extraction des protéines qui avait été mis de côté auparavant, en inversant le tube. Faire passer environ deux à trois millilitres de cet échantillon de cinq millilitres sur le sorbant d'une nouvelle extraction. À l’aide d’une pipette, expulser entièrement l’échantillon dans le même tube conique de 15 millilitres, en prenant soin de maintenir le sorbant dans le col de la pipette d’extraction.

Répétez ce processus en faisant passer l'échantillon sur le sorbant 15 fois. Lavez le sorbant et la protéine liée en faisant passer un millilitre d'éthanol à 95 % sur le lit de sorbant trois fois, puis éjectez l'éthanol dans son tube d'origine. Effectuez trois nouveaux lavages à l'aide d'un deuxième millilitre d'éthanol à 95 %.

L'étape suivante de la procédure consiste à sécher à nouveau le sorbant. Comme pour les acides nucléiques, la récupération des protéines est optimale lorsque le sorbant est sec. Pendant une période plus longue.

Appuyez sur la poire et relâchez-la pendant cinq minutes, en faisant circuler l'air ambiant à travers la pipette d'extraction. Pour sécher le lit du sorbant protéique, essuyez l'éthanol résiduel à l'extrémité de la pipette d'extraction. À l'aide d'un essuie-tout Kim, récupérez la protéine en faisant passer 250 microlitres de PBS sur le sorbant cinq fois.

Le tampon PBS peut être remplacé par toute autre solution aqueuse appropriée, comme le tris à 10 millimolaire, pH 6,8. La solution obtenue contient la teneur en protéines de l'échantillon. Les gènes de la toxine Shiga associés à la souche d’*Escherichia coli* entérohémorragique O157:H7 EDL 933 ont été amplifiés à partir d'une procédure d'extraction d'acides nucléiques et de protéines en utilisant la pipette d'extraction.

Les gènes de la toxine Shiga, la toxine Shiga 1 et la toxine Shiga 2, se trouvent sur des bactériophages tempérés de type lambda et sur des bactériophages défectueux sous le contrôle du promoteur PR. L'activation de la réponse SOS chez E. coli entraîne l'induction du prophage et/ou la production de toxine. Dans ce cas, on observe une forte augmentation de l'amplification du gène de la toxine Shiga 2 lorsque la réponse SOS est induite par la mitomycine C, par rapport au témoin non traité.

Ceci suggère une induction de prophage et une réplication du génome phagique. La protéine récupérée lors des expériences d'isolement de protéines acides nucléiques décrites dans la vidéo est immunoréactive. La fraction protéique isolée a été appliquée sur des bandes de test rapide immunochromatographique pour Escherichia coli O157.

Les témoins montrent une identification positive dans tous les échantillons contenant E. coli O157 avec ou sans induction de la toxine Shiga, comme visualisé par la présence de deux bandes rouges. Les données montrent également des résultats positifs pour les échantillons contenant E. coli O157 qui ont été traités pour les acides nucléiques et les protéines à l’aide de la pipette d’extraction. Ces données indiquent que la protéine isolée de chaque échantillon est immunoréactive, déclenchant ainsi une réponse positive.

La protéine isolée est adaptée à l'électrophorèse, comme illustré ici sur un gel d'acrylamide à 8 % coloré au kumasi, chargé avec de l'albumine sérique bovine (BSA) isolée à partir d'isothiocyanate de gudina six molaire. Grâce au protocole d'extraction, de pipetage et aux procédures associées, la mobilité électrophorétique de la protéine isolée est identique à celle des échantillons témoins. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 20 minutes.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension claire de la manière d'isoler des protéines et des acides nucléiques à partir de l'appareil simple. Merci d'avoir pris le temps de regarder notre vidéo.