Drug faciliter la découverte: Un test automatisé inflammation Haute-contenu chez le poisson zèbre

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer un dépistage phénotypique pour identifier l’activité immunomodulatrice des composés à l’aide d’un test d’inflammation in vivo chez le poisson zèbre. Ceci est accompli en distribuant d’abord des larves de poisson zèbre à un 384. Les composés suivants à tamiser sont ajoutés aux larves pour permettre la pénétration dans les tissus.

Ensuite, une solution de sulfate de cuivre est ajoutée pour infliger des dommages spécifiques aux tissus. Enfin, les composés et le sulfate de cuivre sont remplacés par un milieu frais. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent l’étendue de l’afflux de leucocytes spécifiques aux tissus au fil du temps grâce à l’analyse de données de microscopie in vivo en temps réel.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’induire simultanément une inflammation chez des centaines d’individus et permet ainsi une automatisation expérimentale et analytique. La démonstration de la procédure sera faite par Christina Whitman, une étudiante au doctorat de mon laboratoire. Établissez des accouplements de groupe entre des poissons homozygotes, doubles, transgéniques et sauvages de type AB, collectez des embryons par ponte naturelle et élevez-en 50 à 70 par plaque en E trois milieu à 29 degrés Celsius à trois jours après la fécondation.

Vérifiez toutes les larves sous un stéréoscope fluorescent pour détecter l’expression du rapporteur fluorescent, l’inflammation spontanée et le développement approprié lié à l’âge. Après avoir préparé le milieu de criblage et ajouté 20 microlitres aux puits d’un 384, la plaque de puits a transféré une larve anesthésiée unique dans 74 microlitres de milieu vers chaque puits. À l’aide d’une pointe de pipette coupée à une taille de deux millimètres avec une pointe de micro-pipette flexible.

Orienter la larve en position latérale à l’intérieur du puits Effectuer toutes les étapes suivantes de manipulation des liquides à l’aide d’un robot de manipulation des liquides afin d’assurer le traitement simultané de toutes les larves pour le traitement médicamenteux. Pipette de haut en bas cinq fois pour mélanger les composés dans une plaque de stock de médicament. Ajoutez 16 microlitres de la plaque de stock de médicament 7,5 x à la plaque de criblage et mélangez cinq fois à 10 microlitres par seconde.

Couvrez la plaque de criblage d’une feuille d’aluminium et incubez-la pendant une heure à 29 degrés Celsius. Pour induire des lésions chimiques. Ajoutez 10 microlitres de solution de travail de sulfate de cuivre de 120 micromolaires à chacun.

Eh bien, acceptez les contrôles négatifs, mélangez quatre fois et incubez à nouveau pendant une heure à 29 degrés Celsius. Lavez les embryons en retirant et en échangeant 80 microlitres de milieu de chaque puits deux fois en commençant par 90 minutes. Après le traitement initial au cuivre, acquérez des images sur un microscope automatisé inversé à l’aide d’un objectif Forex.

Réglez le niveau Z initial de manière à ce que la masse neurologique des lignes latérales postérieures droite et gauche soit visible et imagez bien chaque puits une fois par heure. Utilisation du côté Brightfield à trois canaux et des canaux GFP dans quatre plans focaux. Le logiciel de vue de laboratoire personnalisé crée des images à mise au point étendue à partir de quatre plans focaux pour chacun des canaux.

Les images sont ensuite fusionnées pour créer une image de superposition RVB finale. Un outil de reconnaissance de formes identifie les névromes dans les images de superposition RVB et crée une zone d’intérêt définie empiriquement autour des névromes. Les leucocytes fluorescents rouges entourant les névromes blessés sont notés, ce qui permet d’obtenir une lecture primaire du pourcentage de surface occupée par les leucocytes ou pâles. En moyenne, 95 % des larves sont détectées correctement et peuvent ensuite être soumises à un traitement ultérieur des données.

Le succès des expériences individuelles est évalué à l’aide de cartes d’inflammation ou de cartes oculaires. Les données pâles sont codées en couleur avec un vert vif, représentant un indice inflammatoire initial élevé, et le noir indique l’absence d’inflammation. Cette vue d’ensemble rapide permet d’identifier rapidement les expériences qui ont échoué, qui peuvent ensuite être exclues d’une analyse plus approfondie des données.

Les iMaps à l’instant 0,0 et à l’instant 0,5 montrent clairement si une expérience doit être incluse dans le traitement ultérieur des données. Les commandes en cuivre apparaissent dans différentes nuances de vert, tandis que les puits de contrôle DMSO apparaissent en vert foncé ou en noir à l’instant 0,5. L’inflammation est presque résolue chez les témoins en cuivre, maintenant indiquée dans des tons foncés de vert ou de noir pour traiter les contrôles.

La moyenne des 32 répétitions de contrôle est calculée et l’écart-type est calculé. Seulement. Les points de données à l’intérieur de deux écarts-types sont inclus. La valeur moyenne du DMSO de contrôle négatif est fixée à zéro et le PAOL moyen le plus élevé pour le témoin cuivre est fixé à un PAOL de chaque composé est linéairement, interpolé ou extrapolé aux témoins respectifs sur la plaque expérimentale.

La moyenne des données brutes normalisées provenant d’expériences répétées produit une lecture finale, l’indice inflammatoire dû à la résolution de l’inflammation. Au fil du temps, un ajustement de régression exponentielle non linéaire monotone est effectué vers l’inflammation initiale. En utilisant cette formule où un zéro est la mesure de la réponse initiale au temps égal à zéro et un est lié à la pente de l’amplitude dans le temps pour générer l’espace des caractéristiques, une régression non linéaire est appliquée et une analyse en grappes divise un espace des caractéristiques en régions caractéristiques, permettant ainsi l’identification automatisée de candidats intéressants de différentes catégories immunomodulatrices.

Tous les paramètres sont affichés dans le graphique 2D basé sur les paramètres ACE de zéro et as de un. Les routines de traitement des données créent des pages Web qui fournissent un aperçu rapide des résultats, ainsi qu’une vue détaillée demandée par l’utilisateur. Des liens souples vers d’autres bases de données hétérogènes, biologiques et chimiques pertinentes sont également intégrés afin de fournir une ressource précieuse pour les études comparatives et nouvelles par ces routines.

Des normes de données appropriées et des méta-informations sont établies pour le stockage à long terme de ces données dans un écran pilote, une analyse a été effectuée dans une bibliothèque de 640 composés bioactifs connus approuvés par la FDA pour leur effet sur l’initiation, la progression ou la résolution d’une réponse inflammatoire granulocytaire. D’après les effets observés, quatre types de phénotypes immunomodulateurs ont été classés, qui peuvent indiquer différents modes d’action, anti-inflammatoire, anti-résolution, pro-inflammatoire et pro résolution. 45 des 640 composés ont exercé des effets anti-inflammatoires significatifs en réduisant l’indice inflammatoire initial à 50 % ou moins.

Dans cette catégorie, six composés ont été trouvés qui appartenaient à la classe pharmacologique des anti-inflammatoires de bonne foi. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont le dépistage phénotypique in vivo de l’activité des composés immunomodulateurs peut être largement automatisé, permettant à la fois une acquisition et une analyse cohérentes des données dans un contexte animal entier.