Name: Drug faciliter la découverte: Un test automatisé inflammation Haute-contenu chez le poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Découvrez un test d'inflammation haut-contenu automatisé chez les larves de poisson zèbre pour identifier des composés immunomodulateurs. Cette méthode combine microscopie automatisée et analyse logicielle personnalisée.

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<p class="jove_content"&gt; Nous remercions Nadeshda Wolf, Nadine Eschen et Susanne Delong pour l&#39;élevage excellente. CW a été soutenue par une bourse de doctorat de l&#39;Helmholtz programme<em&gt; BioInterfaces</em&gt; Diplômé de l&#39;école internationale »(BIFIGS). Un soutien supplémentaire a été fourni par une subvention KIT-RISC et par une subvention Marie Curie international réintégration au sein de la 7e Programme-cadre européen de la Communauté (PIRG07-GA-2010-267552) à CG. PAPA a été soutenue par BOLD (biologie du foie et du pancréas et les maladies du développement) - Marie Curie Réseau de formation initiale (238 821). UL a été soutenu par le 7e PC Dopaminet (septième programme-cadre) (223 744).</p&gt;

1. Manipulation des animaux Pour le dosage de l&#39;utilisation Chin 3 larves dpf résultant de croisements entre des groupes homozygote cldnB double transgénique :: GFP / lysC :: DsRed2 et AB (type sauvage) du poisson. Recueillir des embryons par la reproduction naturelle et de les élever à 29 ° C dans un milieu E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, et 0,1% de méthylène bleu, équilibrée à pH 7,0) dans des boîtes de Pétri. Il est essentiel de maintenir une densité d&#39;embryons ne dépassant pas 50-70 par plaque. 2. Tri Larve Vérifiez toutes les larves sous un stéréoscope de fluorescence pour l&#39;expression rapporteur fluorescent, l&#39;inflammation spontanée et le développement liés à l&#39;âge approprié. 3. Préparation moyen de dépistage (Toujours préparer une nouvelle) Préparer le milieu E3 sans bleu de méthylène additionné de DMSO (1% final) et MS222 (0,05 g / l). 4. CuSO4Préparation (Toujours préparer une nouvelle) D&#39;abord peser CuSO 4 (M r = 159,6 g / mol) et de préparer une solution stock à 20 mM dans dH 2 O. Préparer 120 um CuSO solution de travail 4 (de 20 solution stock mM) dans E3/DMSO (1%) / MS-222. Protéger CuSO 4 solution de la lumière. 5. La préparation des plaques de 384 puits (Greiner microplaques 384 puits) Pré-ajouter 20 ul de E3/DMSO (1%) / MS-222 à chaque puits avec une pipette inverse. Une augmentation de la pointe de pipette alésage est nécessaire pour traiter les embryons soigneusement sans infliger aucune blessure, ce qui est fait en coupant la pointe de 2 mm alésage. Transfert seule larve dans 74 ul de milieu dans chaque puits (84 pi pour le contrôle non traité). Si nécessaire, les larves d&#39;orienter dans une position latérale à l&#39;intérieur du puits en utilisant une pipette souple Eppendorf Microloader Astuce (Eppendorf; 5242 956.003). Effectuer toutes les étapes suivantes de manipulation des liquides avec un liquide de robotla manipulation poste de travail pour assurer le traitement simultané de toutes les larves. 6. Traitement de la toxicomanie Mélanger des composés de la plaque des stocks de médicaments 5 fois par aspiration et refoulement. Ajouter 16 ul de la plaque de drogue stock de 7,5 x à chaque puits et mélanger 5 fois. Ajustez la position de pointe dans les puits pour prévenir les blessures de larves et de passer le milieu à 10 pi / s. Mélanger moyennes dans les puits 4 fois pour assurer une distribution homogène de la drogue dans le puits. 7. Incubation Incuber plaque de blindage pendant 1 h à 29 ° C recouverts d&#39;une feuille d&#39;aluminium pour protéger les composés ainsi que CuSO 4 de la lumière. 8. Blessures chimique Ajouter 10 ul de 120 uM CuSO 4 solution de travail à chaque puits, sauf pour les contrôles négatifs, mélange 4 fois et incuber à nouveau pendant 1 h à 29 ° C. 9. Lavage Enlever et échanger 80 pi de moi<html> dium de chaque puits deux fois (en 20 étapes ul) pour éliminer les composés et CuSO 4. 10. Acquisition d&#39;image Démarrer l&#39;acquisition d&#39;images sur un microscope inversé automatisé (ex: Olympus scan ^ R) à 90 minutes après traitement au cuivre initial. Première série z-niveau afin que neuromastes de droite et de gauche de la ligne latérale postérieure sont visibles. Image dans chaque puits une fois par heure dans le fond clair canaux, Cy3 et la GFP dans 4 plans focaux (une distance de 50 um) en utilisant un objectif 4x (NA = 0,13). Informations supplémentaires sur l&#39;image et le traitement des données sont disponibles sur demande. 11. Traitement d&#39;image 1. Les données de tri Les images brutes sont traitées avec notre script de logiciels personnalisés LabView. La première opération dans le pipeline de traitement d&#39;image est le tri des images du microscope premières données générées par le dossier de canal, et le temps et une information de point. ove_step &quot;&gt; 2. accent étendue Par la suite, le logiciel crée des images de discussion prolongée de 4 plans focaux pour chacun des canaux. 3. RVB-incrustation Dans une dernière étape, les images de discussion élargie des 3 canaux sont fusionnés pour donner lieu à une finale RGB-superposition d&#39;image. 4. La détection automatique neuromastes Un outil de reconnaissance de formes (LabView rapide IA prototypage de l&#39;outil) identifie neuromastes dans les images de superposition RGB et crée une zone d&#39;intérêt définie empiriquement autour des neuromastes. 5. Quantification Dans la zone d&#39;intérêt définie empiriquement entourant neuromastes blessés rouges leucocytes fluorescentes reflète sous forme de pixels rouges) sont marqués en résulte dans une lecture primaire de p ourcentage un o rea ccupied par eukocytes l (Paol). En moyenne 95,27 ± 2,11% (FDA1) et 95,12 ±1,56% (FDA2) du puits (larves) ont été détectés correctement et ont ensuite été soumis à un traitement ultérieur des données. La sortie de données brutes (Paol pour chaque neuromastes détectée) est stocké dans un fichier texte et sert d&#39;entrée de données pour les scripts MATLAB qui traitent les données brutes en outre. 12. Informatique 1. Imaps Évaluer le succès des expériences individuelles par la visualisation graphique de la sortie de Paol données brutes dans un code de couleur pourrait être réalisé avec des cartes inflammation soi-disant (IMAPS) (Figure 2). Vert clair reflète une haute indice inflammatoire initiale; noire indique l&#39;absence de l&#39;inflammation. Ce rapide survol permet d&#39;identifier rapidement des expériences ratées, qui peuvent ensuite être exclus de l&#39;analyse des données supplémentaires. 2. Calcul de la moyenne des contrôles Chaque plaque expérimentale contient 320 composés reflétant unede données unique point par composé et l&#39;heure du point ainsi que 32 contrôles positifs et négatifs, respectivement. La commande 32 répétitions sont moyennées et l&#39;écart type est calculé. Pour les contrôles des points de données au sein de seulement 2 écarts-types sont inclus. 3. Normalisation La normalisation est faite par analyse de feuille de calcul. La valeur moyenne de DMSO, étant le témoin négatif, est mis à 0 et la plus haute moyenne Paol pour le contrôle de cuivre est mis à 1, de sorte que la différence maximale entre le contrôle positif et négatif est mis à 1. Paol Chaque composé est interpolés ou extrapolés linéairement aux contrôles respectifs sur la plaque expérimentale. 4. Lecture finale: l&#39;indice inflammatoire Après des expériences répétées suffisantes (c.-à-15) ont été menées, normalisées données brutes à partir d&#39;expériences répétées sont en moyenne, entraînant une lecture finale - la réponse inflammatoireindex. L&#39;indice inflammatoire initiale de la commande de cuivre commence à 100% pour le temps du point zéro et est corrélée à l&#39;heure de début d&#39;acquisition d&#39;image (90 minutes après le traitement du cuivre initial). 5. Monotonic raccord de régression exponentielle En raison de la résolution inflammation au fil du temps nous procédons à une monotone raccord exponentielle de régression non linéaire vers l&#39;inflammation initiale à l&#39;aide <img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="L&#39;équation 1" /> - Un 0 est une mesure pour la réponse initiale à l&#39;instant t = 0, a 1 est liée à la pente de l&#39;amplitude dans le temps. 6. 2-D parcelle d&#39;espace caractéristique (Figure 4) À générer de l&#39;espace caractéristique, une régression non linéaire est appliquée et un groupe-analyse divise l&#39;espace caractéristique en régions caractéristiques, permettant ainsi l&#39;identification automatique de candidats intéressants à partir de différentes catégories immunitaire-modulateurs (anti-inflammatthéorie, anti-résolution, pro-inflammatoire, pro-résolution). Tous les composés sont affichés dans le tracé 2-D d&#39;après les paramètres a 0 et a 1. 13. Manipulation et stockage des données Nos données routines de gestion créer des pages Web pour visualiser et représenter de dépistage de drogues, assurant ainsi une vue d&#39;ensemble rapide de l&#39;image et de traitement de données des résultats des étapes, ainsi que d&#39;une vue détaillée à la demande de l&#39;utilisateur 10. Liens vers d&#39;autres soft pertinentes bases de données hétérogènes biologiques et chimiques sont intégrés aussi bien pour fournir une ressource précieuse pour les études comparatives et roman 11. Par ces routines, propres normes de données et métainformations sont fixés pour le stockage à long terme de ces données. 14. Les résultats représentatifs Dans un écran de pilote, nous avons analysé une bibliothèque constituée de 640 approuvé par la FDA connus composés bioactifs pour les effets sur l&#39;initiation, la progression ou la résolution d&#39;un Granulocytic réponse inflammatoire. Sur la base des effets observés que nous avons classées 4 types de phénotypes immunomodulateurs qui pourraient être indicatifs des différents modes d&#39;action: anti-inflammatoires (1), anti-résolution (2), pro-inflammatoire (3) et pro-résolution (4) , qui peut être décrite avec les paramètres a 0 et un 1, qui découlent d&#39;une installation de régression non linéaire monotone (e ao ​​+ alx -) vers l&#39;inflammation initiale. Un 0 représente l&#39;amplitude de la réponse inflammatoire tandis qu&#39;une 1 caractérise la pente de la courbe et donc décrit résolution l&#39;inflammation. Affichage tous les composés dans un tracé 2-D fonctionnalité espace (1 une par rapport à un 0) permet une identification automatisée de candidats frappées à partir des différentes catégories modulateurs immunitaires (figure 3). 45 sur 640 composés exercée significative effet anti-inflammatoire par la réduction de l&#39;indice inflammatoire initiale à 50% ou moins. Dans this catégorie nous avons trouvé 6 composés appartenant à la classe pharmacologique des non-stéroïdiens anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), confirmant la validité de notre approche. Toutefois, les AINS classé pas parmi les plus puissants anti-inflammatoires. Outre les AINS, nous avons trouvé plusieurs autres classes de médicaments pharmacologiques tels que par exemple pour les bloqueurs de récepteurs de l&#39;angiotensine (ARA), des antibiotiques et des inhibiteurs de la pompe à protons. 7 composés satisfait aux critères de seuil empiriquement définies pour d&#39;éventuels pro-résolution de la drogue. 18 médicaments ont exercé un effet pro-inflammatoire, ce qui entraîne le recrutement des leucocytes exagérée à neuromastes blessés par rapport à des témoins positifs. Seulement 2 composés empêché la résolution en temps opportun de la réponse inflammatoire. L&#39;effet anti-inflammatoire des candidats ont frappé plusieurs (candidats exemplaires mentionnés ci-dessus à partir de classes de médicaments pharmacologiques) de la coul écran piloted être confirmé d&#39;une manière dose-dépendante dans les prochains essais Chin secondaires (données non présentées). Répétition de 4 potentiels pro-résolution des médicaments n&#39;a pas confirmé le mode d&#39;action comme indiqué exercée dans l&#39;écran principal. 2 des médicaments a eu un léger potentiel anti-inflammatoire à des concentrations plus élevées (20 uM). Un troisième médicament présentait un marginal non dose-dépendante effet anti-inflammatoire à des concentrations de médicaments allant de 5 à 20 uM. Le quatrième médicament n&#39;a eu aucun effet sur la réponse inflammatoire aux concentrations testées. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" /> Figure 1. Flux de travail de l&#39;essai Chin. Individuel composé transgénique cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 larves (3 dpf) sont distribués manuellement dans des plaques de microtitration à 384 puits. Les médicaments sont ajoutés simultanément à chaque puits en utilisant un Zephyr station de travail compacte Liquid Handling. Plaques d&#39;essai sont ensuite incubées pendant 1 h à 29 ° C. Le traitement avec CuSO 4 </sub&gt; - Solution (10 uM de concentration finale) pendant 1 h inflige la blessure et déclenche une réponse inflammatoire aiguë. Enfin, une solution de cuivre et de médicaments sont éliminés par lavage et d&#39;acquisition d&#39;image automatique est démarré (90 minutes après le traitement du cuivre initial). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" /> Figure 2. . Aperçu image des images brutes La figure montre les images brutes de 4 plans focaux (Z = 0 - 3) à des distances de 50 um dans les canaux Cy3 (à gauche) et de la GFP (à droite), respectivement. Les flèches (Z = 1,2) indiquent neuromastes exemplaires, pointes de flèches (Z = 1,2) points à leucocytes groupés autour de neuromastes. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" /> Figure 3. Cartes Inflammation (IMAPS) Le succès des expériences individuelles peuvent être évalués en imaps reflétant la réponse inflammatoire (données brutes) dans un code de couleur: vert clair. Reflète une inflation initiale élevée<html> réponse mmatory; noire indique l&#39;absence de l&#39;inflammation imaps à timepoint 0 (à gauche) et le temps du point 5 (à droite) montrent clairement si une expérience doit être inclus dans le traitement ultérieur des données.. Contrôles de cuivre (la ligne 13 et 24) se présentent dans différents tons de vert, tandis que le DMSO puits de contrôle (ligne 1 et 12) apparaissent en vert foncé ou noir. Au moment du point 5, l&#39;inflammation est presque résolu dans les contrôles de cuivre, maintenant indiqué dans les tons sombres de vert ou noir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" /> Figure 4. 2-D parcelle d&#39;espace caractéristique de 320 composés d&#39;une bibliothèque et approuvé par la FDA leurs contrôles respectifs. Tous les puits composés peuvent être affichées dans une parcelle de 2-D fonction d&#39;espace sur la base des paramètres d&#39;un 0 et un 1, qui découlent d&#39;une non-linéaire Raccord de régression (d/4203/4203eq1.jpg &quot;alt =&quot; l&#39;équation 1 &quot;/&gt;) vers l&#39;inflammation initiale. Cette parcelle d&#39;espace caractéristique permet l&#39;identification automatisée des candidats intéressants appartenant à l&#39;un des 4 suivantes immunitaire modulateurs catégories qui peuvent être indicatifs des médicaments «mode d&#39;action:. anti-inflammatoire (1), anti-résolution (2), pro-inflammatoire (3) et pro-résolution (4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

<ol><li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).</li>
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<li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciencenet%27+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li>
<li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvester%27%3A+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

<p class="jove_content"&gt; Ici, nous présentons une stratégie de dépistage entièrement automatisé à haut débit permettant l&#39;identification du système immunitaire modulateurs composés dans un contexte animal entier. Surveillance permettant ainsi d&#39;une réponse inflammatoire aiguë<em&gt; In vivo</em&gt; Et en temps réel.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Nous fournissons un protocole à appliquer le poisson zèbre comme un organisme modèle précieux pour la découverte de médicaments ou de drogues efforts donner un nouveau but, car les effets des drogues sur le recrutement des leucocytes dans les blessures peuvent être étudiés avec une relative facilité dans le cadre d&#39;un système entièrement fonctionnel immunitaire innée. L&#39;avantage unique de notre approche réside dans le fait qu&#39;une blessure chimique rend la manipulation manuelle des larves obsolètes, ce qui permet l&#39;automatisation et de dépistage dans un format à haut débit.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; En outre, les effets indésirables ou toxiques ainsi que de fortes effets hors-cible peut être facilement évaluée par le projet de set-up. La bibliothèque approuvé par la FDA n&#39;a toutefois pas contenir de composés toxiques à des concentrations de dépistage. Néanmoins, nous proposons pour apparentes composés toxiques pour comparer l&#39;ensemble des données disponibles (par exemple phénotype modulateur immunitaire, la concentration du médicament) entre les membres de la même présent substance pharmacologique de classe dans la bibliothèque testée. Membres d&#39;une famille toxiques substance, qui exerce par ailleurs un phénotype modulateur immunitaire prometteuse, pourrait être testés à des concentrations plus faibles, si besoin est.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Nous avons démontré la possibilité de catégoriser automatiquement les médicaments en fonction de leur exercée immunitaire modulateur effet. Médicaments appartenant à la catégorie des composés anti-inflammatoires pourraient être validés dans des expériences indépendantes, la plupart des composés qui exercent leur effet d&#39;une manière dose-dépendante. Quatre composés identifiés comme potentiels pro-résolution des médicaments pourrait donc bien ne pas être confirmé en tant que telle. Il indique également que cette catégorie particulière de l&#39;immunité modulateur est difficile à décrire, car aucun médicament affectant uniquement la résolution ont jusqu&#39;à présent été décrit dans la littérature. Cependant, 3 des 4 médicaments ont réanalysé ont montré une tendance anti-inflammatoire à de plus hautes concentrations molaires. Optimiser les critères de seuil empiriquement définies devrait contribuer à réduire le nombre de faux positifs.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Par ailleurs, la technique présentée offre la possibilité d&#39;être utilisé pour l&#39;identification de mutations dans les gènes qui affectent le comportement migratoire des leucocytes<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; En conclusion, la méthode proposée peut faciliter et accélérer la découverte de médicaments ou de drogues réorientation des efforts en cédant potentiels des structures de plomb nouvelles informations disponibles sur la tolérance au médicament, la toxicité, la posologie ainsi que des éventuels effets hors-cible. Par conséquent, servant une stratégie simple, des coûts et gain de temps aux premiers stades de développement de médicaments.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td> Cuivre (II) sulfate anhydre </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> Approuvé par la FDA bibliothèque de médicaments </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384 microplaques non-contraignant, μClear </td><td> Greiner </td><td> 781906 </td><td> noir </td></tr><tr><td> Olympus scan ^ R </td><td> Olympe </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zephyr station de travail compacte Liquid Handling </td><td> Caliper </td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

drug faciliter la découverte: un test automatisé inflammation haute-contenu chez le poisson zèbre

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Larves poisson zèbre sont particulièrement favorables à l&#39;animal entier petite molécule écrans 1,2 en raison de leur petite taille et la facilité relative de la manipulation et l&#39;observation, ainsi que le fait que les composés peuvent être simplement ajoutés à l&#39;eau de baignade et sont facilement absorbés lorsqu&#39;ils sont administrés dans un &lt;solution à 1% DMSO. En raison de la clarté optique des larves de poisson zèbre et la disponibilité de lignes transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les leucocytes, le poisson-zèbre offrent l&#39;avantage unique de suivi d&#39;une réponse inflammatoire aiguë in vivo. Par conséquent, en utilisant le poisson zèbre pour haute teneur écrans de petites molécules visant à l&#39;identification du système immunitaire modulateurs composés avec un débit élevé a été proposé 3-6, suggérant des scénarios d&#39;induction par exemple l&#39;inflammation dans les tissus localisés pseudos fin, dommage laser dirigé vers la surface jaune d&#39; embryons 7 ou amputation tailfin 3,5,6. L&#39;inconvénient majeur de ces méthodes a toutefois étél&#39;exigence de la manipulation manuelle larve pour induire la blessure, empêchant ainsi criblage à haut débit. Introduction de l&#39;inflammation induite chimiquement (Chin) dosage 8 éliminé ces obstacles. Depuis blessure est infligée chimiquement le nombre d&#39;embryons qui peuvent être traitées simultanément est pratiquement illimitée. Traitement temporaire des larves du poisson zèbre avec du sulfate de cuivre induit sélectivement la mort cellulaire dans les cellules ciliées de la ligne latérale et les résultats en matière de recrutement de granulocytes rapide à neuromastes blessés. La réponse inflammatoire peut être suivie en temps réel en utilisant composé transgénique cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 6,9 larves du poisson zèbre qui expriment une protéine fluorescente verte dans les cellules neuromastes, ainsi que quelques rouges fluorescentes granulocytes d&#39;étiquetage de protéines. Afin de concevoir une stratégie de dépistage qui permettrait aux deux analyses de haut-contenu et à haut débit, nous avons introduit robotique de manipulation de liquide et combinée micr automatiséoscopy avec un script un logiciel développé sur mesure. Ce script permet de quantifier automatisé de la réponse inflammatoire en marquant la zone occupée par pour cent rouges fluorescentes leucocytes dans une zone définie de manière empirique entourant blessés verts fluorescents neuromastes. En outre, nous avons automatisé le traitement des données, la manipulation, la visualisation et de stockage tout fondé sur la coutume développé MATLAB et des scripts Python. En bref, nous introduisons un système automatisé HC / HT écran qui permet de tester des composés chimiques pour leur effet sur l&#39;initiation, la progression ou la résolution d&#39;une réponse inflammatoire granulocytaire. Ce protocole sert un bon point de départ pour plus de des analyses en profondeur des mécanismes de drogue et les voies impliquées dans l&#39;orchestration d&#39;une réponse immunitaire innée. Dans l&#39;avenir, il peut aider à identifier les intolérables effets toxiques ou hors cible lors des phases antérieures de la découverte de médicaments et de réduire ainsi les risques et les coûts de procédure pour le développement de médicaments.

Nous décrivons ici un roman à forte teneur en test l&#39;inflammation induite chimiquement visant à l&#39;identification du système immunitaire modulateurs bioactifs. Nous avons réussi à combiner la microscopie automatisée avec des scripts logiciels développés permettant la quantification automatique de la réponse inflammatoire ainsi que la poursuite du traitement des données, l&#39;analyse, l&#39;exploitation minière, et le stockage.

Drug faciliter la découverte: Un test automatisé inflammation Haute-contenu chez le poisson zèbre

Les larves de poisson-zèbre sont particulièrement adaptées aux cribles de petites molécules sur l'animal entier1,2 en raison de leur petite taille et de leur relative facilité de manipulation et...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser un criblage phénotypique afin d'identifier l'activité immunomodulatrice de composés à l'aide d'un test d'inflammation chez le poisson-zèbre in vivo. Cette étape est réalisée en répartissant d'abord des larves de poisson-zèbre dans une plaque de 384 puits, puis en ajoutant les composés à cribler aux larves afin de permettre la pénétration tissulaire.Ensuite, une solution de sulfate de cuivre est ajoutée pour induire des lésions spécifiques aux tissus. Enfin, les composés et le sulfate de cuivre sont remplacés par un milieu frais. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant l'ampleur de l'afflux de leucocytes spécifique aux tissus au fil du temps, grâce à l'analyse de données de microscopie en temps réel in vivo.Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet l'induction simultanée de l'inflammation chez des centaines d'individus, ce qui rend possible l'automatisation expérimentale et analytique. La procédure sera démontrée par Christina Whitman, étudiante au doctorat de mon laboratoire, pour le test du menton. Mettez en place des accouplements par groupe entre des poissons transgéniques doubles homozygotes et des poissons sauvages de souche AB, récupérez les embryons par ponte naturelle et élevez 50 à 70 embryons par plaque dans du milieu E3 à 29 degrés Celsius jusqu'à trois jours après la fécondation.Vérifiez toutes les larves au stéréomicroscope à fluorescence pour détecter l'expression du marqueur fluorescent, une inflammation spontanée et un développement adapté à l'âge. Après avoir préparé le milieu de criblage et ajouté 20 microlitres dans les puits d'une plaque de 384 puits, transférez une larve anesthésiée dans 74 microlitres de milieu dans chaque puits. Utilisez une pointe de pipette dont l'orifice a été coupé à une taille de deux millimètres à l'aide d'une pointe de micropipette flexible.Positionnez la larve en position latérale dans le puits. Effectuez toutes les étapes suivantes de manipulation des liquides à l’aide d’une station robotisée de manipulation des liquides afin d’assurer un traitement simultané de toutes les larves pour l’administration du médicament. Pipetez cinq fois vers le haut et vers le bas pour mélanger les composés dans une plaque de stock de médicament. Ajoutez 16 microlitres de la plaque de stock de médicament à 7,5 x dans la plaque de criblage et mélangez cinq fois à raison de 10 microlitres par seconde.Couvrez la plaque de criblage avec du papier d'aluminium et incubez-la pendant une heure à 29 degrés Celsius. Pour induire une blessure chimique. Ajoutez 10 microlitres de solution travail de sulfate de cuivre à 120 micromolaire à chaque échantillon.Acceptez le mélange des témoins négatifs quatre fois et incubez à nouveau pendant une heure à 29 degrés Celsius. Lavez les embryons en éliminant et en remplaçant deux fois 80 microlitres de milieu de chaque puits, en commençant 90 minutes après. Après le traitement initial au cuivre, acquérez des images sur un microscope automatisé inversé en utilisant un objectif Forex.Définissez le niveau Z initial de manière à ce que les masses neuronales des lignes latérales postérieures droite et gauche soient visibles, puis imagez chaque puits une fois par heure. Utilisez le canal en champ clair trois et le canal GFP sur quatre plans focaux. Le logiciel personnalisé de visualisation en laboratoire crée des images à focus étendu à partir des quatre plans focaux pour chacun des canaux.Les images sont ensuite fusionnées pour créer une image finale en superposition RVB. Un outil de reconnaissance de motifs identifie les neuromes au sein des images en superposition RVB et délimite une zone d'intérêt définie empiriquement autour des neuromes. Les leucocytes fluorescents rouges entourant les neuromes lésés sont quantifiés, fournissant ainsi un paramètre principal correspondant au pourcentage de surface occupé par les leucocytes ou la pale. En moyenne, 95 % des larves sont correctement détectées et peuvent ensuite être soumises à un traitement supplémentaire des données.La réussite des expériences individuelles est évaluée à l’aide de cartes de l’inflammation ou de cartes oculaires. Les données pâles sont codées en couleur avec un vert vif, représentant un indice inflammatoire initial élevé, tandis que le noir indique l’absence d’inflammation. Cette vue d’ensemble rapide permet d’identifier promptement les expériences ayant échoué, qui peuvent ensuite être exclues de toute analyse complémentaire des données.Les iMaps aux temps 0,0 et 0,5 montrent clairement si une expérience doit être incluse dans le traitement ultérieur des données. Les témoins au cuivre apparaissent en différentes nuances de vert, tandis que les puits témoins au DMSO sont visibles en vert foncé ou en noir au temps 0,5. L'inflammation est presque résolue dans les témoins au cuivre, désormais indiqués en nuances foncées de vert ou en noir, afin de traiter les témoins.Les 32 réplicats témoins sont moyennés et l'écart type est calculé. Seuls les points de données situés dans un intervalle de deux écarts types sont inclus. La valeur moyenne du témoin négatif DMSO est fixée à zéro et la valeur moyenne maximale de PAOL pour le témoin cuivre est fixée à un ; le PAOL de chaque composé est ensuite interpolé ou extrapolé linéairement par rapport aux témoins respectifs sur la plaque expérimentale.Les données brutes normalisées provenant d'expériences répétées sont moyennées, produisant un résultat final : l'indice inflammatoire dû à la résolution de l'inflammation. Au fil du temps, un ajustement de régression non linéaire exponentielle monotone est effectué en direction de l'inflammation initiale. En utilisant cette formule où un zéro représente la mesure de la réponse initiale au temps égal à zéro et un un est associé à la pente de l'amplitude au cours du temps pour générer l'espace des caractéristiques, une régression non linéaire est appliquée et une analyse de regroupement divise l'espace des caractéristiques en régions caractéristiques, permettant ainsi l'identification automatisée de candidats intéressants appartenant à différentes catégories de modulation immunitaire.Tous les paramètres sont affichés dans le tracé 2D en fonction des paramètres ACE de zéro et ace de un. Les routines de traitement des données créent des pages web qui offrent un aperçu rapide des résultats, ainsi qu'une vue détaillée demandée par l'utilisateur. Des liens symboliques vers d'autres bases de données hétérogènes, biologiques et chimiques pertinentes sont également intégrés afin de fournir une ressource précieuse pour des études comparatives et novatrices par le biais de ces routines.Des normes adéquates de données et des méta-informations sont établies pour le stockage à long terme de ces données dans un écran pilote ; une analyse a été réalisée sur une bibliothèque de 640 composés bioactifs connus approuvés par la FDA, afin d'évaluer leur effet sur l'initiation, la progression ou la résolution d'une réponse inflammatoire granulocytaire. Sur la base des effets observés, quatre types de phénotypes immunomodulateurs ont été classifiés, pouvant indiquer des modes d'action différents : anti-inflammatoire, anti-résolution, pro-inflammatoire et pro-résolution. Parmi les 640 composés, 45 ont exercé des effets anti-inflammatoires significatifs en réduisant l'indice inflammatoire initial à 50 % ou moins.Dans cette catégorie, six composés ont été identifiés appartenant à la classe pharmacologique des médicaments anti-inflammatoires avérés. La validité de cette approche étant confirmée, après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière dont le criblage phénotypique in vivo de l'activité de composés immunomodulateurs peut être largement automatisé, permettant ainsi une acquisition et une analyse de données cohérentes dans un contexte d'organisme entier.

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