La purification et l'agrégation de la protéine précurseur amyloïde domaine intracellulaire

Le but de cette procédure est de purifier le domaine intracellulaire de la protéine précurseur de l’amyloïde, également connu sous le nom de A ICD, et de présenter un protocole d’agrégation thermique et de caractérisation de l’A ICD par microscopie à force atomique. Ceci est accompli en exprimant d’abord une fusion GST de A ICD dans les bactéries. Ensuite, la protéine G-S-T-A-I-C-D est purifiée clivée avec de la thrombine pour séparer la GST de A ICD et la GST est éliminée.

Ensuite, l’agrégation thermique de A ICD est induite. Enfin, les agrégats A ICD sont imagés à l’aide de la microscopie à force atomique. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent que le CIM A peut être purifié jusqu’à ce qu’il soit homogène en quantité suffisante pour l’analyse biochimique et biophysique.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, qui nécessitent des étapes de chromatographie complexes, est qu’elle est très pure et soluble. Un DCI peut être isolé sur la paillasse à l’aide de réactifs et d’équipements standard. Un DCI produit par ce protocole convient à une caractérisation biochimique et biophysique plus poussée.

La démonstration de la procédure sera Amina ti. Un ancien postdoctorant de mon laboratoire, le Dr Andres Oberer, démontrera comment effectuer l’imagerie par microscopie à force atomique d’un ICD pour exprimer le domaine intracellulaire recombinant A PP ou A ICD. Commencez avec des cellules BL 21 transformées avec le vecteur pgx 41, hébergeant l’ICD A humain fusionné à l’extrémité C de GST avec une seule colonie, inoculez 10 millilitres de bouillon LB avec de l’ampicilline et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius avec des secousses vigoureuses le lendemain matin.

Incuber 400 millilitres d’ampicilline LB dans une fiole d’un litre avec cinq millilitres de culture de nuit. Incuber à 37 degrés Celsius en secouant vigoureusement jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres ait atteint 0,4 à 0,6. Cela prendra normalement de deux à 2,5 heures pour induire l’expression de G-S-T-A-I-C-D.

Nous ajoutons 0,4 millimolaire d’IPTG et incubons 37 degrés Celsius en secouant vigoureusement pendant cinq heures. Centrifugez les cellules à 6 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et stockez la pastille à moins 80 degrés Celsius. Après avoir préparé la lyse, le tampon et jeté les bactéries sur la glace, ajoutez 20 millilitres de tampon à la pastille et en utilisant une combinaison de vortex et de tation sur la glace avec une pipette à fond.

Reese suspend la pastille bactérienne et fait passer le lysat bactérien en suspension Reese à travers un émulsifiant pré-refroidi ou une presse française. À 30 000 PSI, faites passer le lysat à travers l’émulsifiant une deuxième fois et recueillez le lysat dans un tube pré-refroidi de 50 millilitres. Centrifugez le lysat de 15 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.

Séparez et transférez le supinate dans un tube pré-refroidi de 50 millilitres. Ajoutez 500 microlitres d’une suspension de glutathion à 50 %. Tournez pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius pendant que l’échantillon tourne.

Préparez un tampon d’élution frais après l’incubation. Versez le lysat et la boue dans une colonne de chromatographie en polystyrène jetable de cinq pouces avec des filtres de cours. Lavez la colonne cinq fois avec trois millilitres de PBS.

Boucher le bas de la colonne et ajouter 500 microlitres de tampon d’élution à température ambiante. Fermez le haut de la colonne et tournez-le pendant cinq minutes à température ambiante. Recueillez le poids initial dans un micro-tube à déchets réfrigéré de 1,5 millilitre.

Répétez l’élution deux fois de plus. Dialysez l’éluat dans une membrane de dialyse de coupure de 10 000 poids moléculaire dans quatre litres de PBS pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain. Dialyse contre quatre litres supplémentaires de PBS à quatre degrés Celsius pendant une heure.

Retirez la protéine de la cassette de dialyse et effectuez un test de quantification des protéines pour déterminer le rendement de G-S-T-A-I-C-D. Une purification typique à partir de 400 millilitres de culture donnera des rendements supérieurs à 20 milligrammes de protéines purifiées à des concentrations de 10 à 20 milligrammes par millilitre. Aliquote la protéine en 200 microlitres, aliquotes et congélation de moins 80 degrés Celsius.

Pour libérer l’A ICD de la décongélation GST, 200 microlitres de G-S-T-A-I-C-D purifié et ajouter 20 micro-libérations d’une unité par microlitre de thrombine incubent pendant la nuit à 37 degrés Celsius le lendemain, éliminent tout matériau agrégé par centrifugation à 20 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le SUPINATE dans un microtube pré-refroidi pour éliminer la GST et la thrombine. Ajoutez respectivement 50 microlitres de lisier de glutathion aro 50 % et 50 microlitres, 50 % p et wino zaine aro slurry.

Incuber à rotation pendant cinq minutes à température ambiante. Centrifugez brièvement pour sédimenter les billes agricoles et retirez le supinat dans un tube frais. Extrayez la GST quatre fois de plus avec du glutathion.

Aros a effectué un test de quantification des protéines sur cinq microlitres de l’ICD A purifié. Les rendements typiques d’une culture de 400 millilitres sont de 50 à 100 microgrammes à une concentration de 0,2 à 0,5 milligramme par millilitre. Après avoir dilué un DAI A fraîchement préparé dans du PBS à une concentration de 0,1 milligramme par millilitre, l’agrégation thermique induite par l’incubation des échantillons à 43 degrés Celsius à 800 tr/min dans un agitateur chauffé pendant 48 heures.

Diluez l’échantillon 20 fois avec de l’eau désionisée et placez deux microlitres sur fraîchement clivé. Le mica sèche l’échantillon dans un dessiccation pendant la nuit pour visualiser l’ICD A agrégé Utilisez la microscopie à force atomique en mode tapotement avec de l’or goté. Micro porte-à-faux en nitrure d’affût avec un rayon d’extrémité nominal de deux nanomètres.

Amplitudes de tapotement typiques lors de l’imagerie, de 10 à 20 nanomètres à la fréquence de résonance des porte-à-faux. L’expression et l’enrichissement relatif de G-S-T-A-I-C-D sont illustrés ici. Après la lyse, la majorité de la protéine de fusion est présente dans la fraction soluble, et l’extraction à partir des corps d’inclusion n’est donc pas nécessaire.

Le matériau auquel il est fait allusion à partir de la colonne de glutathion est pur à plus de 95 %. Dans la préparation présentée ici, la concentration de protéines à laquelle il est fait allusion dans la colonne était de 14,5 milligrammes par millilitre et le rendement était de 22 milligrammes. Le clivage de 200 microlitres de cette préparation pendant la nuit avec 20 unités de thrombine a entraîné un clivage de près de 100 % de la protéine de fusion.

La quantité de thrombine utilisée est suffisamment faible pour ne pas être détectable par kumasi. La coloration bleue, l’élimination de la thrombine et de la GST ont entraîné une certaine perte de matière. Cependant, il était pur à plus de 90 % avec un rendement dans cette préparation de 70 microgrammes de A ICD à une concentration de 0,35 milligramme par millilitre.

Les agrégats d’un CIM, imagés par un FM, sont généralement amorphes stéroïdiens et leur taille varie de 50 à 100 nanomètres. Le matériel agrégé n’est pas détectable lorsqu’une quantité équimolaire de l’équimolaire du chaperon UBI Quillin one est ajoutée à la réaction d’agrégation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier l’EICD induire son agrégation et l’agrégation d’images de la baie A-F-M-E-I-C-D.

La purification par cette technique peut être appliquée à d’autres méthodes telles que la diffusion de la lumière et les tests de pièges à filtre pour répondre aux questions concernant l’effet des chaperons moléculaires sur l’agrégation de l’EACD.