Isolement des noyaux de cardiomyocytes post-mortem des tissus

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les noyaux de cardiomyocytes à partir de tissu post-mortem. Cela est réalisé en homogénéisant d'abord le tissu à l'aide d'un homogénéisateur à sonde et d'un broyeur en verre, suivi de plusieurs étapes de filtration. La deuxième étape consiste à isoler la fraction nucléaire des autres fractions cellulaires par centrifugation de sédimentation en gradient de densité.

Ensuite, les noyaux de cardiomyocytes sont marqués par immunomarquage à l'aide d'un anticorps dirigé contre PCM1. La dernière étape consiste à isoler les noyaux de cardiomyocytes marqués par tri cellulaire activé par fluorescence. Enfin, juste avant toute manipulation ultérieure en aval, la pureté des noyaux de cardiomyocytes est confirmée par une réanalyse des fractions nucléaires triées.

Le principal avantage de cette technique est que les noyaux de cardiomyocytes peuvent être analysés avec une efficacité équivalente à partir de tissus frais ou congelés, de manière haut débit. Les études basées sur l'ADN dans les cardiomyocytes sont particulièrement difficiles pour plusieurs raisons. Premièrement, les cardiomyocytes ne représentent qu'environ 20 à 30 % des cellules du cœur.

De plus, elles sont dans une large mesure nucléées. Par ailleurs, les cardiomyocytes sont dans une large mesure polyploïdes. Cette méthode décrite ici permet de surmonter tous ces obstacles.

Avant de commencer la procédure, enduire les tubes d'ultracentrifugation avec 10 millilitres d'une solution de revêtement contenant 1 % de BSA dans du PBS. Après avoir fait tourner les tubes pendant 30 minutes, éliminer la solution de revêtement et les laisser sécher à l'air.

Commencez la procédure d'isolement des noyaux cardiaques en utilisant un scalpel pour disséquer le ventricule gauche d'un cœur de souris congelé rapidement. Taillez l'échantillon disséqué en petits segments, puis transférez les morceaux de tissu dans un tube conique de 50 millilitres contenant 15 millilitres de tampon de lyse. Ensuite, homogénéisez le tissu cardiaque à l'aide d'un homogénéisateur à sonde à 24 000 tr/min pendant 10 secondes, puis diluez l'homogénat avec un volume équivalent de tampon de lyse jusqu'à 30 millilitres. Transférez l'homogénat dans un homogénéisateur en verre à piston en effectuant huit mouvements avec un pilon à jeu large afin de libérer les noyaux.

Ensuite, faites passer les noyaux bruts à travers un tamis à cellules de 100 microns, puis à travers un tamis à cellules de 70 microns, dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Centrifugez maintenant l'isolat de noyaux bruts pendant 10 minutes à 700 ×g et à 4 °C.

Retournez le tube pour éliminer soigneusement le surnageant, puis essuyez l'intérieur du tube avec un papier absorbant, en prenant soin de ne pas perturber le culot de noyaux. Passez la solution plusieurs fois dans la pipette afin de resuspendre les noyaux bruts.

Isoler dans cinq millilitres de tampon au saccharose, puis ajouter 25 millilitres supplémentaires de tampon au saccharose à la suspension de noyaux. Ensuite, ajouter 10 millilitres de tampon au saccharose fraîchement préparé dans l'un des tubes d'ultracentrifugation revêtus préparés précédemment. Puis recouvrir délicatement le tampon avec la solution de culot de noyaux remis en suspension.

Après avoir équilibré le tube dans un rotor à pendulums, placer le rotor dans une centrifugeuse à grande vitesse et centrifuger l'échantillon de noyaux pendant 60 minutes à 13 000 ×g et à 4 °C. Une fois la centrifugation terminée, retirer soigneusement les tubes du rotor et les retourner à nouveau. Pour éliminer le surnageant, essuyer les résidus restants à l'intérieur du tube avec un papier absorbant comme précédemment, puis resuspendre le culot de noyaux dans un millilitre de tampon de stockage des noyaux.

Avant de commencer la procédure de coloration immunohistochimique, transférez un aliquot de 20 microlitres de l'échantillon de noyaux dans un tube fax. Ajoutez 980 microlitres de tampon de conservation des noyaux à l'aliquot et étiquetez le tube comme témoin négatif. Ajoutez ensuite l'anticorps anti-PCM1 aux échantillons de noyaux et aux tubes témoins négatifs à une dilution de 1/500.

Incubez ensuite les deux tubes à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, après avoir lavé les tubes avec le tampon de conservation des noyaux et avoir éliminé le surnageant, resuspendez les culots de noyaux dans un autre millilitre de tampon de conservation des noyaux.

Ensuite, ajoutez un anticorps secondaire fluorescent anti-rabique aux échantillons cellulaires à une dilution de un à cent et incubez-les à quatre degrés Celsius pendant une heure. Après avoir lavé les tubes avec un tampon de conservation des noyaux, resuspendez les culots dans un millilitre de tampon de conservation des noyaux pour le tri et l'analyse cytométriques en flux, après avoir recouvert les noyaux et les tubes de collecte de BSA et de PBS comme au début de la vidéo, commencez par filtrer l'échantillon et le témoin négatif à travers des filtres cellulaires individuels de 30 microns. Juste avant le chargement, ajoutez un colorant d'ADN.

Ajoutez une dilution de un à 500 pour l'identification des populations de noyaux. Chargez le témoin négatif sur le cytomètre en flux. Utilisez les paramètres de diffusion avant et latérale pour placer la première grille afin de définir les noyaux cardiaques, de manière similaire au diagramme DOT illustré ici.

Ensuite, utilisez les paramètres de diffusion avant et de largeur d'impulsion de diffusion avant pour créer une deuxième fenêtre autour des noyaux en monoploïdie, similaire au graphique DOT illustré ici. Chargez maintenant l'échantillon marqué par immunofluorescence et placez une troisième fenêtre pour distinguer les noyaux de cardiomyocytes PCM1 positifs des noyaux de non-cardiomyocytes PCM1 négatifs. Utilisez la coloration nucléaire de l'ADN pour analyser la teneur en ADN et effectuer une analyse du cycle cellulaire, similaire à l'analyse illustrée par cet histogramme.

Après avoir trié les noyaux en fonction de leur positivité pour PCM1, placez les noyaux triés sur de la glace et réanalysez un aliquot de chaque échantillon trié afin de déterminer la pureté du tri. Enfin, centrifugez les noyaux triés dans leurs tubes de collecte pendant 15 minutes à 1500 × g et à 4 °C. Après avoir éliminé les surnageants, resuspendez les culots de noyaux dans un tampon compatible avec l'application en aval souhaitée.

Dans cette première figure, un cœur de souris adulte a été marqué avec un colorant nucléaire et des anticorps dirigés contre PCM1, le facteur de transcription cardiaque NKX2.5 et la chaîne lourde de myosine ou MHC. Ici, un agrandissement du chevauchement provenant de la figure précédente est présenté. Remarquez comment les noyaux marqués par PCM1 en blanc expriment le facteur de transcription NKX2.5 en rouge et sont entourés par le cytoplasme des cardiomyocytes en vert.

Ces données démontrent conjointement la précision avec laquelle la coloration par PCM un identifie les noyaux de cardiomyocytes. L'encart met en évidence le motif de coloration épinitronucléaire de PCM un dans les noyaux des myocytes, comme indiqué en outre par les flèches dans l'expérience illustrée dans les trois figures suivantes, où des isolats de noyaux cardiaques ont été colorés avec la coloration de l'ADN DRAC cinq et avec des anticorps dirigés contre PCM un. Ici, la superposition des deux figures précédentes montre à nouveau, grâce aux flèches, le motif de coloration épinitronucléaire de PCM un dans les noyaux de cardiomyocytes isolés.

Ce diagramme en points montre qu'environ 30 % des noyaux isolés par cette méthode sont des noyaux de cardiomyocytes, comme l'indique leur marquage par PCM1. Enfin, comme le montrent ces histogrammes, les noyaux de cardiomyocytes de souris sont principalement diploïdes, indiqué par le pic à 2N, et seule une petite sous-population est tétraploïde, indiquée par le pic plus petit à 4N. L'un des avantages de cette technique est qu'elle peut facilement être adaptée à d'autres espèces.

Chez les humains.