Name: Les réponses de calcium dans les neurones dimagerie GFP-marqués de hypothalamiques tranches de cerveau de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Découvrez l'imagerie calcique dans les neurones GFP-marqués de tranches hypothalamiques de cerveau de souris. Cette méthode utilise un indicateur rouge pour analyser spatialement et temporellement les signaux calciques par microscopie confocale.

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Nous remercions nos collègues qui ont participé aux travaux résumés ici. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), «l&#39;analyse intégrative de l&#39;olfaction» du DFG Schwerpunktprogramm 1392 et par la Fondation Volkswagen (TLZ). TLZ est professeur Lichtenberg de la Fondation Volkswagen.

<ol><li>Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+the+translocation+of+protein+kinase+Calpha-green+fluorescent+protein+hybrids+and+intracellular+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations.</a> Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).</li>
<li>Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+Ca2%2B+dyes+with+green+fluorescent+protein+and+its+variants%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions.</a> Biochem. J. 356, 345-352 (2001).</li>
<li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+GnRH+receptor+neurons%3A+a+new+model+for+studying+neural+circuits+underlying+reproductive+physiology+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain.</a> Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).</li>
<li>Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li>
<li>Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+internalization+and+surface+expression+of+a+functional%2C+fluorescently+tagged+G-protein-coupled+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor.</a> Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).</li>
<li>Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fura+red+as+an+intracellular+calcium+indicator+in+frog+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers.</a> Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).</li>
<li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropin-releasing+hormone+modifies+action+potential+generation+in+sheep+pars+distalis+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. Technique for setting up the perfusion of a recording chamber for physiological studies with cultured and acutely dissociated cells. , Avaliable from: 
	 <a target="_blank" href="
	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf">
	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf</a> (1998).</li>
<li>Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+noninvasive+intracellular+pH+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator.</a> Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+genetically+labeled+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of genetically labeled gonadotropes.</a> Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , 2nd edn, Academic Press. (2001).</li>
<li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pheromones+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li>
<li>Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+regulation+of+the+sexual+behavior+and+reproductive+physiology+of+the+laboratory+mouse%3A+effects+and+neural+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms.</a> ILAR J. 50, 28-42 (2009).</li>
<li>Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+inputs+to+hypothalamic+neurons+controlling+reproduction+and+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility.</a> Cell. 123, 669-682 (2005).</li>
<li>Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+loops+link+odor+and+pheromone+signaling+with+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction.</a> Cell. 123, 683-695 (2005).</li>
<li>Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+network+activity+in+XFP-expressing+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).</li>
<li>Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+near-atmospheric+concentrations+of+CO2+by+an+olfactory+subsystem+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse.</a> Science. 317, 953-957 (2007).</li>
<li>Perez, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).</li>
<li>Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loading+of+Rhod+2+into+mitochondria+shows+mitochondrial+Ca2%2B+transients+during+the+contractile+cycle+in+adult+rabbit+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).</li>
<li>Properties of Asante Calcium Red - a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Neuroscience Meeting Planner, , Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Une question majeure en neurosciences est de comprendre comment le cerveau traite l&#39;information sociale. Une source prédominante de l&#39;information nécessaire à la reconnaissance sociale est codé par des signaux olfactifs ou phéromones. La détection de ces signaux par des populations neuronales dans le nez et la reconnaissance des signaux dans le cerveau, en particulier l&#39;hypothalamus, jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus sociaux et les hormones influencent et d&#39;autres facteurs neuroendocrin...

There was a typo in the abstract of <a href="http://www.jove.com/video/4213">Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices</a>.

Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Cat. N ° </td></tr><tr><td> Gélose </td><td> Sigma </td><td> A1296 </td></tr><tr><td> Fura-red/AM </td><td> Invitrogen </td><td> F-3021 </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td></tr><tr><td> Le diméthylsulfoxyde </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP231 </td></tr><tr><td> Vibrante de la lame de microtome Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9770170 </td></tr><tr><td> Dispositif de refroidissement CU 65 pour Microtome Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9920120 </td></tr><tr><td> O 2 / CO 2 incubateur, CB210-UL </td><td> Liant </td><td> 0019389 </td></tr><tr><td> Super colle, Loctite 406TM </td><td> Henckel </td><td> 142580 </td></tr><tr><td> Spatules doubles, forme cuillère </td><td>Bochem </td><td> 3182 </td></tr><tr><td> Spatules Microspoon, forme cuillère </td><td> Bochem </td><td> 3344 </td></tr><tr><td> Ciseaux Spring, Moria Vannas-Wolff - Lames 7mm </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15370-52 </td></tr><tr><td> Ciseaux Spring, Vannas - Lames 3mm </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15000-00 </td></tr><tr><td> Ciseaux Wagner </td><td> Outils Fine Science </td><td> 14071-12 </td></tr><tr><td> Pince médicale, 7b Dumont </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11270-20 </td></tr><tr><td> Grande Chambre rectangulaire Open Bath (RC-27) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0238 </td></tr><tr><td> Confocale Radiance BioRad Microscope 2100 </td><td> Zeiss </td><td> na </td></tr></tbody></table>

les réponses de calcium dans les neurones d&#39;imagerie gfp-marqués de hypothalamiques tranches de cerveau de souris

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Malgré une augmentation considérable de nos connaissances sur les mécanismes qui sous-tendent l&#39;encodage de l&#39;information dans le cerveau, une question centrale concernant les mesures précises moléculaires ainsi que l&#39;activité des neurones spécifiques dans multi-fonctionnel des noyaux de zones du cerveau comme l&#39;hypothalamus reste. Ce problème comprend l&#39;identification des composants moléculaires impliqués dans la régulation des cascades de transduction du signal neurohormone différentes. Des élévations des intracellulaire de Ca 2 + jouent un rôle important dans la régulation de la sensibilité des neurones, tant au niveau de la transduction du signal et sur ​​les sites synaptiques. De nouveaux outils ont vu le jour pour aider à identifier les neurones dans la myriade de neurones du cerveau en exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle d&#39;un promoteur particulier. Pour surveiller à la fois spatialement et temporellement stimulus induit par Ca 2 + dans les réponses des neurones marqués GFP, un non-fluorescente verte Ca 2 + colorant indicateur needs à être utilisé. En outre, la microscopie confocale est une méthode préférée de neurones individuels d&#39;imagerie dans des tranches de tissu en raison de sa capacité de visualiser des neurones dans des plans distincts de profondeur dans le tissu et pour limiter l&#39;extérieur de la mise au point de fluorescence. La ratiométrique Ca 2 + indicateur fura-2 a été utilisée en combinaison avec GFP-1 marqué neurones. Toutefois, le colorant est excité par le rayonnement ultraviolet (UV). Le coût du laser et de la profondeur de pénétration limitée optique de la lumière UV empêché son utilisation dans de nombreux laboratoires. En outre, fluorescence de la GFP peut interférer avec les signaux de fura-2 2. Par conséquent, nous avons décidé d&#39;utiliser un rouge fluorescent Ca 2 + colorant indicateur. L&#39;énorme changement Strokes de fura-rouge permet une analyse de la fluorescence multicolore rouge en combinaison avec la GFP en utilisant une longueur d&#39;onde d&#39;excitation unique. Nous avons eu de bons résultats précédemment en utilisant le fura-rouge en combinaison avec GFP-étiqueté neurones olfactifs 3. Les protocoles de tranches de tissus olfactifs semble fonctionner eQually bien dans les neurones hypothalamiques 4. Fura-rouge à base de Ca 2 + imagerie a également réussi à combiner avec pancréatiques GFP-β-cellules marqués et étiquetés GFP-récepteurs exprimés dans des cellules HEK 5,6. Une petite bizarrerie de fura-rouge, c&#39;est que son intensité de fluorescence à 650 nm diminue une fois l&#39;indicateur fixe le calcium 7. Par conséquent, la fluorescence des neurones au repos avec une faible concentration de Ca 2 + a une intensité relativement élevée. Il est à noter, que les autres rouges Ca 2 + indicateurs de colorants existent ou sont en cours d&#39;élaboration, qui pourraient donner de meilleurs résultats ou améliorés dans les neurones du cerveau et de régions différentes.

Dans ce protocole, nous mettons à jour les progrès récents de l&#39;imagerie Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaux des neurones GFP-marqués dans les tranches de tissus du cerveau en utilisant un rouge fluorescent Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indicateur de colorant.

Les réponses de calcium dans les neurones d&#39;imagerie GFP-marqués de hypothalamiques tranches de cerveau de souris

Malgré l'augmentation considérable de nos connaissances sur les mécanismes sous-jacents au codage de l'information dans le cerveau, une question centrale concernant le ...

L'objectif général de cette procédure est de surveiller les réponses calciques induites par un stimulus, à la fois dans les neurones marqués par la GFP, de manière spatiale et temporelle, dans des tranches de cerveau à l'aide d'un colorant calcique fluorescent non vert. Ceci est réalisé en extrayant d'abord le cerveau d'une souris transgénique exprimant la GFP dans des cellules spécifiques. La deuxième étape consiste à préparer des tranches de tissu à l'aide d'un microtome.Ensuite, la solution de chargement du colorant indicateur de calcium est pipetée sur les tranches afin que le colorant soit capté par les cellules cérébrales. La dernière étape consiste à effectuer un enregistrement temporel des cellules fluorescentes à l’aide de la microscopie confocale. En définitive, les réponses calciques dans les neurones marqués par la GFP sont visualisées à l’aide d’une analyse d’imagerie calcique multicolore.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes de microscopie confocale est que nous pouvons visualiser le calcium dans des neurones exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) à l'aide d'un colorant indicateur de calcium fluorescent décalé vers le rouge. Le grand décalage Stokes du colorant rouge nous permet d'effectuer une analyse multicolore de la fluorescence rouge en combinaison avec la GFP verte en utilisant une seule longueur d'onde d'excitation. Nous avons eu l'idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons été confrontés au problème de la surveillance des signaux calciques dans des neurones que nous ne pouvions identifier qu'à l'aide d'une technique génétique fluorescente, à savoir la protéine fluorescente verte.Je vais maintenant démontrer plusieurs étapes critiques de cette procédure. Commencez la procédure en versant la solution d'agar chauffée dans une boîte de Pétri carrée jusqu'à une hauteur d'un centimètre ; après refroidissement, le gel d'agar à 4 % est découpé en blocs d'un centimètre cube et placé dans un flacon pour stockage. Après avoir décapité la souris, incisez le cuir chevelu à l’aide d’un scalpel à lame unique dans le sens sagittal médian, depuis l’os frontal jusqu’à la protubérance occipitale externe.Ouvrir ensuite davantage le cuir chevelu incisé d'abord dans la direction latérale rostrale, puis dans la direction ventrale. Effectuer ensuite deux incisions latérales et une incision rostrale.Dans le foramen magnum, détacher soigneusement le crâne à l’aide d’une petite paire de ciseaux à ressort. À ce stade, les os occipital, interpariétal et pariétaux doivent être détachés. Si la dure-mère est encore présente, la retirer délicatement à l’aide d’une pince pour éviter tout dommage au cerveau.Ensuite, retirez l'os squameux, le foramen ethmoïdal antérieur et le foramen frontal. Le cerveau peut alors être facilement extrait à l’aide d’une spatule microscopique en forme de cuillère inversée, et les nerfs crâniens peuvent être sectionnés. Le cerveau doit reposer sur sa face ventrale, placée vers le bas, sur une surface résistante aux coupures.Utilisez un rasoir à lame unique pour retirer le cervelet. Cette surface de coupe droite servira de base pour monter le cerveau sur une plaque afin de permettre la sectionnement coronal du cerveau. Ensuite, collez le cerveau par la surface de coupe sur la plaque de base du microtome à l’aide d’une petite quantité de colle cyanoacrylate super-rapide à haute performance.Ensuite, fixer à l'aide d'une colle un bloc de gel d'agar d'un centimètre cube sur la face ventrale du cerveau, directement sur la platine du microtome, afin de soutenir et immobiliser le cerveau pendant la découpe. Une fois que l'adhésion est sèche, placer la platine dans le bain du microtome contenant une solution extracellulaire oxygénée refroidie à six degrés Celsius. Puis découper le cerveau en tranches d'une épaisseur de 300 microns à faible vitesse de sectionnement ; les tranches cérébrales coronales sont collectées jusqu'à ce que l'ensemble du cerveau soit complètement sectionné.Préparez maintenant une solution de F1 27 onique à 20 % dans le DMSO en ajoutant une solution de DMSO à la poudre de F1 27 onique. Ensuite, dissolvez-la en soumettant directement la solution à une sonication pendant deux minutes. Après cela, ajoutez cinq microlitres de la solution de F1 27 onique à 20 % à un tube contenant 50 microgrammes de furred am perméable aux cellules.Mélangez la solution avec une pipette. Ajoutez ensuite 45 microlitres de solution extracellulaire au mélange et vortexez. Ajoutez brièvement 325 microlitres supplémentaires de solution extracellulaire et soniquez le tube pendant trois minutes supplémentaires.Après la sonication, ajouter 1,156 millilitres de solution extracellulaire oxygénée afin d'obtenir la solution finale de chargement avec l'indicateur calcique D. Transférer les tranches coronales de cerveau dans une plaque de culture cellulaire à six puits contenant de la solution extracellulaire oxygénée, jusqu'à six tranches par puits. Ensuite, aspirer délicatement la solution extracellulaire oxygénée des puits en prenant soin de ne pas endommager les tranches de cerveau.Ensuite, pipetez 750 microlitres de la solution de chargement de l'indicateur calcique D directement dans chaque puits. Les tranches cérébrales doivent être recouvertes par la solution contenant le rore am. Incubez ensuite les tranches dans l'incubateur de culture cellulaire à oxygène et dioxyde de carbone pendant 45 à 60 minutes à 37 degrés Celsius.À la fin de l'incubation, remplacez la solution de chargement de l'indicateur calcique DI par une solution extracellulaire fraîche et oxygénée afin d'éviter une surcharge des cellules. Pour surveiller les modifications induites par le stimulus dans le signal fluorescent, transférez une des tranches de cerveau chargées avec le fure rouge vers une chambre d'enregistrement et positionnez-la comme souhaité. Après avoir monté la chambre sur le dispositif de microscopie confocale, perfusez la tranche pendant 10 minutes avec une solution extracellulaire oxygénée afin d'éliminer tout excès de colorant indicateur calcique extracellulaire.Après avoir quitté la chambre d'enregistrement, le PERFUSE huit est recueilli dans un flacon sous vide. Ensuite, observez la coupe au microscope avec un faible grossissement. Notez l'orientation de la coupe et repérez la zone d'intérêt dans la coupe, dans notre cas la région hypothalamique du cerveau.Ensuite, passez à un grossissement élevé. Localisez la cellule d'intérêt dans la coupe en acquérant des images GFP tout en vérifiant simultanément l'intensité de fluorescence du signal rouge URA. Réglez la puissance du laser à une valeur permettant de mesurer les variations de l'intensité de fluorescence rouge URA, tout en évitant la décoloration des deux fluorophores.Ensuite, commencez à acquérir des images à des fréquences comprises entre 0,5 et deux hertz afin de recueillir les signaux de la fure et de la GFP. Cette figure montre l'image confocale des neurones GN, RHR Tau GFP dans une coupe cérébrale coronale. Il s'agit du signal de fluorescence relativement uniforme observé après chargement de la coupe cérébrale avec la fure am, et ceci est l'image fusionnée montrant les neurones chargés avec le colorant indicateur de calcium.Voici des exemples de réponses calciques induites par un stimulus somatique provenant de neurones individuels marqués par la GFP dans différentes régions cérébrales hypothalamiques. Les signaux calciques distincts entre les neurones exprimant le récepteur de l'GNRH appartenant à différents noyaux hypothalamiques peuvent être comparés à l’aide de la surface sous la courbe, utilisée comme estimation du changement total en calcium dans une cellule donnée pendant une période déterminée. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 90 minutes, préparation du colorant indicateur calcique, chargement et incubation des tranches incluses, à condition qu’elle soit effectuée correctement.

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Neurosciences

L'organe voméronasal (VNO) détecte des signaux chimiques intraspécifiques qui transmettent des informations sociales et reproductives. Nous avons réalisé des expériences d'imagerie Ca2+ en utilisant des souris transgéniques exprimant G-CaMP2 dans le tissu du VNO. Cette approche nous permet d'analyser les schémas complexes de réponse des neurones voméronasaux à un grand nombre de stimuli de phéromones.

Réponses d&#39;imagerie neuronale dans les préparations d&#39;organe voméronasal Slice Exprimant un capteur de calcium codées génétiquement

Source : Bancroft, E. A., et al. Quantification de Ca2+ flux et leurs effets en aval dans les neurones primaires du mésencéphale de la souris. J. Vis. Exp. (2020) &lt;p style='line-height :1.2 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;' dir='ltr'&gt;Cette vidéo démontre la visualisation en temps réel de l’afflux de calcium dans les neurones du mésencéphale ventral dérivé d’embryons de souris. À l’aide d’un vecteur viral pour exprimer un indicateur calcique, les neurones sont imagés au microscope...

Visualisation de l’afflux de calcium dans les neurones du mésencéphale ventral dérivé d’embryons de souris

Nous décrivons une procédure expérimentale pour mesurer l’activité neuronale à travers les fenêtres optiques doubles au-dessus corticies somatosensoriel primaire bilatérale (S1) en Thy1-GCaMP6s des souris transgéniques à l’aide de 2 photons (2p) microscopie in vivo.

Imagerie de l’activité neuronale dans le Cortex somatosensoriel primaire utilisant Thy1-GCaMP6s des souris transgéniques

Nous présentons une méthode combinant les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière et deux photons d’imagerie pour enregistrer des transitoires de Ca2 + en dendrites neuronales dans des tranches de cerveau aiguë.

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Nous présentons ici comment exposer le ganglion géniculé d’une souris de laboratoire vivante et anesthésiée et comment utiliser l’imagerie calcique pour mesurer les réponses d’ensembles de ces neurones aux stimuli gustatifs, permettant ainsi de multiples essais avec différents stimulants. Cela permet des comparaisons approfondies de quels neurones répondent à quels tastants.

Imagerie calcique in vivo des réponses des neurones ganglionnaires géniculés de souris aux stimuli gustatifs

Nous présentons un protocole pour exposer le tronc cérébral de la souris adulte du côté ventral. En utilisant une lentille à indice de réfraction gradient avec un microscope miniature, l’imagerie au calcium peut être utilisée pour examiner l’activité de la somata neuronale olive inférieure in vivo.

In vivo Imagerie du calcium chez la souris Olive inférieure

Ce protocole décrit l’exposition chirurgicale du ganglion radiculaire dorsal (DRG) suivi de GCaMP3 (indicateur Ca2+ codé génétiquement; Protéine fluorescente verte-calmoduline-protéine M13 3) Imagerie Ca2+ des ensembles neuronaux à l’aide de souris Pirt-GCaMP3 tout en appliquant une variété de stimuli à la patte postérieure ipsilatérale.

In vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions radiculaires dorsaux intacts

Ce protocole détaille la procédure d’imagerie des réponses calciques dans le colliculus supérieur (SC) des souris éveillées, y compris l’imagerie de l’activité d’un seul neurone avec la microscopie à deux photons tout en laissant le cortex intact chez les souris de type sauvage, et l’imagerie de l’ensemble du SC avec la microscopie à grand champ chez les souris mutantes à cortex partiel.

Imagerie calcique dans le colliculus supérieur de souris

Le présent protocole décrit l’imagerie calcique in vivo pour mesurer les réponses d’ensembles de neurones lombaires-6 DRG à des stimuli somatiques et viscéraux. Des comparaisons approfondies peuvent être faites entre les neurones répondant à différents stimuli. Ce protocole est précieux pour étudier les mécanismes de la douleur viscérale et de la stimulation somatique, comme l’acupuncture.

in vivo Imagerie calcique de la réponse des neurones des ganglions de la racine dorsale aux stimuli somatiques et viscéraux

Le gyrus denté de l’hippocampe remplit des fonctions essentielles et distinctes dans l’apprentissage et la mémoire. Ce protocole décrit un ensemble de procédures robustes et efficaces pour l’imagerie calcique in vivo des cellules granulaires dans le gyrus denté chez des souris se déplaçant librement.

Imagerie calcique in vivo de cellules granulaires dans le gyrus denté de l’hippocampe chez la souris 

Ce protocole décrit l’imagerie calcique GCaMP in vivo de neurones intacts du ganglion du trijumeau (TG). Cette description comprend la chirurgie d’exposition aux TG, l’imagerie par microscopie confocale in vivo des neurones TG, l’application de stimuli somatiques pendant l’imagerie microscopique des neurones TG et l’analyse des données d’imagerie calcique GCaMP in vivo .

In vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions du trijumeau intacts

Découvrez l'imagerie calcique dans les neurones GFP-marqués de tranches hypothalamiques de cerveau de souris. Cette méthode utilise un indicateur rouge pour analyser spatialement et temporellement les signaux calciques par microscopie confocale.

Les réponses de calcium dans les neurones d'imagerie GFP-marqués de hypothalamiques tranches de cerveau de souris

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