Les réponses de calcium dans les neurones d'imagerie GFP-marqués de hypothalamiques tranches de cerveau de souris

L'objectif général de cette procédure est de surveiller les réponses calciques induites par un stimulus, à la fois dans les neurones marqués par la GFP, de manière spatiale et temporelle, dans des tranches de cerveau à l'aide d'un colorant calcique fluorescent non vert. Ceci est réalisé en extrayant d'abord le cerveau d'une souris transgénique exprimant la GFP dans des cellules spécifiques. La deuxième étape consiste à préparer des tranches de tissu à l'aide d'un microtome.

Ensuite, la solution de chargement du colorant indicateur de calcium est pipetée sur les tranches afin que le colorant soit capté par les cellules cérébrales. La dernière étape consiste à effectuer un enregistrement temporel des cellules fluorescentes à l’aide de la microscopie confocale. En définitive, les réponses calciques dans les neurones marqués par la GFP sont visualisées à l’aide d’une analyse d’imagerie calcique multicolore.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes de microscopie confocale est que nous pouvons visualiser le calcium dans des neurones exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) à l'aide d'un colorant indicateur de calcium fluorescent décalé vers le rouge. Le grand décalage Stokes du colorant rouge nous permet d'effectuer une analyse multicolore de la fluorescence rouge en combinaison avec la GFP verte en utilisant une seule longueur d'onde d'excitation. Nous avons eu l'idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons été confrontés au problème de la surveillance des signaux calciques dans des neurones que nous ne pouvions identifier qu'à l'aide d'une technique génétique fluorescente, à savoir la protéine fluorescente verte.

Je vais maintenant démontrer plusieurs étapes critiques de cette procédure. Commencez la procédure en versant la solution d'agar chauffée dans une boîte de Pétri carrée jusqu'à une hauteur d'un centimètre ; après refroidissement, le gel d'agar à 4 % est découpé en blocs d'un centimètre cube et placé dans un flacon pour stockage. Après avoir décapité la souris, incisez le cuir chevelu à l’aide d’un scalpel à lame unique dans le sens sagittal médian, depuis l’os frontal jusqu’à la protubérance occipitale externe.

Ouvrir ensuite davantage le cuir chevelu incisé d'abord dans la direction latérale rostrale, puis dans la direction ventrale. Effectuer ensuite deux incisions latérales et une incision rostrale.

Dans le foramen magnum, détacher soigneusement le crâne à l’aide d’une petite paire de ciseaux à ressort. À ce stade, les os occipital, interpariétal et pariétaux doivent être détachés. Si la dure-mère est encore présente, la retirer délicatement à l’aide d’une pince pour éviter tout dommage au cerveau.

Ensuite, retirez l'os squameux, le foramen ethmoïdal antérieur et le foramen frontal. Le cerveau peut alors être facilement extrait à l’aide d’une spatule microscopique en forme de cuillère inversée, et les nerfs crâniens peuvent être sectionnés. Le cerveau doit reposer sur sa face ventrale, placée vers le bas, sur une surface résistante aux coupures.

Utilisez un rasoir à lame unique pour retirer le cervelet. Cette surface de coupe droite servira de base pour monter le cerveau sur une plaque afin de permettre la sectionnement coronal du cerveau. Ensuite, collez le cerveau par la surface de coupe sur la plaque de base du microtome à l’aide d’une petite quantité de colle cyanoacrylate super-rapide à haute performance.

Ensuite, fixer à l'aide d'une colle un bloc de gel d'agar d'un centimètre cube sur la face ventrale du cerveau, directement sur la platine du microtome, afin de soutenir et immobiliser le cerveau pendant la découpe. Une fois que l'adhésion est sèche, placer la platine dans le bain du microtome contenant une solution extracellulaire oxygénée refroidie à six degrés Celsius. Puis découper le cerveau en tranches d'une épaisseur de 300 microns à faible vitesse de sectionnement ; les tranches cérébrales coronales sont collectées jusqu'à ce que l'ensemble du cerveau soit complètement sectionné.

Préparez maintenant une solution de F1 27 onique à 20 % dans le DMSO en ajoutant une solution de DMSO à la poudre de F1 27 onique. Ensuite, dissolvez-la en soumettant directement la solution à une sonication pendant deux minutes. Après cela, ajoutez cinq microlitres de la solution de F1 27 onique à 20 % à un tube contenant 50 microgrammes de furred am perméable aux cellules.

Mélangez la solution avec une pipette. Ajoutez ensuite 45 microlitres de solution extracellulaire au mélange et vortexez. Ajoutez brièvement 325 microlitres supplémentaires de solution extracellulaire et soniquez le tube pendant trois minutes supplémentaires.

Après la sonication, ajouter 1,156 millilitres de solution extracellulaire oxygénée afin d'obtenir la solution finale de chargement avec l'indicateur calcique D. Transférer les tranches coronales de cerveau dans une plaque de culture cellulaire à six puits contenant de la solution extracellulaire oxygénée, jusqu'à six tranches par puits. Ensuite, aspirer délicatement la solution extracellulaire oxygénée des puits en prenant soin de ne pas endommager les tranches de cerveau.

Ensuite, pipetez 750 microlitres de la solution de chargement de l'indicateur calcique D directement dans chaque puits. Les tranches cérébrales doivent être recouvertes par la solution contenant le rore am. Incubez ensuite les tranches dans l'incubateur de culture cellulaire à oxygène et dioxyde de carbone pendant 45 à 60 minutes à 37 degrés Celsius.

À la fin de l'incubation, remplacez la solution de chargement de l'indicateur calcique DI par une solution extracellulaire fraîche et oxygénée afin d'éviter une surcharge des cellules. Pour surveiller les modifications induites par le stimulus dans le signal fluorescent, transférez une des tranches de cerveau chargées avec le fure rouge vers une chambre d'enregistrement et positionnez-la comme souhaité. Après avoir monté la chambre sur le dispositif de microscopie confocale, perfusez la tranche pendant 10 minutes avec une solution extracellulaire oxygénée afin d'éliminer tout excès de colorant indicateur calcique extracellulaire.

Après avoir quitté la chambre d'enregistrement, le PERFUSE huit est recueilli dans un flacon sous vide. Ensuite, observez la coupe au microscope avec un faible grossissement. Notez l'orientation de la coupe et repérez la zone d'intérêt dans la coupe, dans notre cas la région hypothalamique du cerveau.

Ensuite, passez à un grossissement élevé. Localisez la cellule d'intérêt dans la coupe en acquérant des images GFP tout en vérifiant simultanément l'intensité de fluorescence du signal rouge URA. Réglez la puissance du laser à une valeur permettant de mesurer les variations de l'intensité de fluorescence rouge URA, tout en évitant la décoloration des deux fluorophores.

Ensuite, commencez à acquérir des images à des fréquences comprises entre 0,5 et deux hertz afin de recueillir les signaux de la fure et de la GFP. Cette figure montre l'image confocale des neurones GN, RHR Tau GFP dans une coupe cérébrale coronale. Il s'agit du signal de fluorescence relativement uniforme observé après chargement de la coupe cérébrale avec la fure am, et ceci est l'image fusionnée montrant les neurones chargés avec le colorant indicateur de calcium.

Voici des exemples de réponses calciques induites par un stimulus somatique provenant de neurones individuels marqués par la GFP dans différentes régions cérébrales hypothalamiques. Les signaux calciques distincts entre les neurones exprimant le récepteur de l'GNRH appartenant à différents noyaux hypothalamiques peuvent être comparés à l’aide de la surface sous la courbe, utilisée comme estimation du changement total en calcium dans une cellule donnée pendant une période déterminée. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 90 minutes, préparation du colorant indicateur calcique, chargement et incubation des tranches incluses, à condition qu’elle soit effectuée correctement.