Name: Analyse cellulaire spécifique de Arabidopsis Feuilles en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Découvrez l'isolation de protoplastes spécifiques de feuilles d'Arabidopsis par tri cellulaire activé par fluorescence. Cette méthode permet d'étudier l'expression génique cellulaire en biologie végétale.

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Travailler dans le laboratoire Buchanan-Wollaston sur le profilage stade des cellules de type et de développement spécifique est prise en charge par le projet AGRON-OMICS (subvention n LSHG-CT-2006-037704) dans le cadre Progamme 6 ème de la Commission européenne. Travailler dans le laboratoire Gifford sur un type de cellule spécifique profilage est soutenu par une subvention de nouveau chercheur BBSRC (BB/H019502/1). Les KC274 KC464 et les lignes d&#39;Arabidopsis ont été obtenus à partir de l&#39;AAR Webb (Université de Cambridge).

1. Génération de protoplastes <ol><li> Matériel foliaire Récolte et les couper en lanières 1 mm de large (figure 1) avec une lame de rasoir. Pour les échantillons contenant plus d&#39;une seule feuille jusqu&#39;à 15 feuilles peuvent être facilement empilés avant de couper. </li><li> Transférer immédiatement les bandes de feuilles dans une boîte de Petri de 9 cm rond contenant 20 ml de solution A (400 mM de mannitol, 20 mM de MES hydrate, 20 mM KCl, CaCl2 10 mM, MgCl2 2 mM, BSA 0,1% et 2,5 mM de β-mercaptoéthanol, pH 5,7) y compris les enzymes protoplastes (1,2% de cellulose R-10, la cellulose 0,6% et 0,4% RS macerozyme R-10) et de RNase et d&#39;inhibiteurs de la transcription (1 × ProtectRNA et 10 pg / ml d&#39;actinomycine D); séparer délicatement les feuilles et bandes aspirateur infiltrer pour 2 x 5 min. </li><li> Lieu boîte de Pétri sur un agitateur orbital réglé à 90 tours par minute à la température ambiante et de protoplastes pour 3-4 heures. <ol><li> Au cours de l&#39;incubation, les bandes de feuille doivent être séparés les uns des autres, par utilisation d&#39;unjeu de pinces plates, les demi-heures. </li></ol></li><li> Placez un 70 um tamis cellulaire (Fisher Scientific) dans un tube de 50 ml et doucement filtrer la solution à travers protoplastes. Cela permettra d&#39;éliminer les bandes de feuilles, qui seront retenues par le tamis tout en permettant aux protoplastes à passer. </li><li> Laver les barrettes de feuilles avec 4 ml de solution A et doucement à travers le tamis de filtre même. </li><li> Transférez les protoplastes dans des tubes à fond rond et centrifuger la solution de protoplastes à 300 xg pendant 5 min à pellets les protoplastes. </li><li> Aspirer le maximum de surnageant sans déranger les protoplastes. </li><li> Laver les protoplastes avec 5 ml de solution A et centrifuger à 300 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant </li><li> Remettre en suspension les protoplastes dans un volume approprié de la solution A, à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur ou une pointe P1000 coupure. </li></ol> 2. FACS de protoplastes foliaires </p&gt; <ol><li> Immédiatement avant le triage, remettre en suspension les protoplastes en utilisant une liste (non coupé) P1000 pointe pour éviter les protoplastes s&#39;agglomérer. </li><li> Transférer des protoplastes à un tube de tri à travers un filtre 50 um Filcon (BD Biosciences) et le cas échéant diluer pour éviter le colmatage de la buse de la trieuse de cellules. Les protoplastes sont triés à l&#39;aide d&#39;une buse de 100 um à une pression de 20 psi (gaine) et de 21 à 21,5 psi (échantillon), une fréquence de 39,2 kHz et un taux d&#39;événements de &lt;4000 (ces paramètres sont optimales sur un trieur de cellules BD Afflux (BD Biosciences). Optimisation sur d&#39;autres machines de tri de cellules devrez peut-être ajuster ces paramètres). </li><li> Protoplastes GFP positives sont identifiées à l&#39;aide d&#39;un laser argon à 488 nm et le tracé de la sortie du passe-bande 580/30 de filtre (orange) par rapport au filtre 530/40 passe-bande (vert). Protoplastes GFP-positives sera dans la grande 530/low 580 de la population, avec les non-GFP protoplastes dans le bas 530/580 à faible population et de morts qui meurent / protoplastes et les débris de la grande population 580ment (Figure 2). <ol><li> Lors du tri des protoplastes à partir de l&#39;ARN qui seront extraites, protoplastes doivent être triés directement dans au moins 4 volumes d&#39;un tampon de lyse contenant un agent réducteur (par exemple β-mercaptoéthanol). En outre, le temps de tri d&#39;un échantillon unique devrait être limitée à 20-30 min, et un maximum de deux à trois échantillons traités à un moment donné. </li><li> Pour la visualisation des protoplastes triés, les protoplastes doivent être triés directement dans au moins 8 volumes de la solution A, puis recueillies par centrifugation pour concentrer les protoplastes. </li></ol></li></ol> 3. Les résultats représentatifs Ce protocole décrit un procédé d&#39;obtention de protoplastes de feuilles d&#39;Arabidopsis, qui sont utilisés pour le tri de cellules activé par fluorescence (figure 1). Génération de protoplastes en présence de RNase et d&#39;inhibiteurs de la transcription empêche le f cellulesrom montage d&#39;une réponse transcriptionnelle. Cela ne veut avoir pour conséquence de donner lieu à de nombreuses protoplastes morts et mourants, qui ont un niveau élevé d&#39;auto-fluorescence. Lors du tri des protoplastes préparés avec cette méthode, il est donc très fréquent de voir plusieurs populations distinctes dans les graphes des 580 nm contre 530 nm fluorescence utilisés pour le tri. Des exemples de ce qui, avec les portes de tri utilisés dans ce protocole sont présentés dans la figure 3. Les protoplastes peuvent être classés en 8 volumes de la solution A et recueilli pour la visualisation de vérifier l&#39;enrichissement. Figure 2G montre un exemple de cette utilisation de la ligne TP382, qui exprime la GFP dans les cellules de garde. Exemples de rendements obtenus en utilisant cette méthode, à la fois avant et après amplification, sont présentés dans le tableau 1. Les montants obtenus sont suffisants pour l&#39;amplification en utilisant le système Ovation Pico WTA (500 pg-50 ng) et donc subsequent analyse par qPCR soit (figure 4), le séquençage de prochaine génération ou puces à ADN. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig1.jpg" /> Figure 1. Flux de travail globale de l&#39;expérience. 1) Récolte des feuilles de l&#39;intérêt d&#39;une ligne exprimant la GFP Arabidopsis. 2) rapidement coupé en ~ 1 mm larges bandes et transférer immédiatement dans la solution de ces protoplastes et le vide s&#39;infiltrer. 3) Incuber pendant 3-4 heures. 4) doucement filtrat protoplastes solution à travers un tamis 70 pm, transfert à arrondir les tubes à fond et les protoplastes par centrifugation. 5) Immédiatement avant le triage, remettre les protoplastes et le transfert d&#39;un tube de tri à travers un filtre 50 um. 6) Trier GFP positives et négatives GFP protoplastes viables. 7) Les protoplastes peuvent maintenant être analysées visuellement ou en utilisant des techniques telles que qPCR, séquençage de nouvelle génération ou puces à ADN. Figure 2. Les lignes KC464, KC274 et TP382 utilisées dans cette étude. A) Coupe transversale d&#39;une feuille KC464 montrant l&#39;expression de la GFP dans l&#39;épiderme ventral. B) Les protoplastes provenant de feuilles KC464. C) Coupe transversale d&#39;une feuille KC274 montrant l&#39;expression de la GFP dans le système vasculaire. D) Les protoplastes issus de KC274 feuilles. E) feuille TP382 montrant l&#39;expression de la GFP dans les cellules de garde. F) provenant de protoplastes TP382 feuilles. G) Exemple de l&#39;enrichissement obtenu par FACS de la GFP exprimant des cellules de garde à l&#39;arrière-plan complexe de cellules de la feuille, montrant GFP contenant des protoplastes de la 530/low 580 de population de protoplastes issus de TP382 feuilles. AF: les images microscope confocal; G: image Microscope à fluorescence. Barres d&#39;échelle dans les images sont de 50 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig3.jpg" /><html> Figure 3. Typiques parcelles FACS points d&#39;acquisition de la sortie de la 580/30 nm (orange) vs 530/40 nm (vert) filtres passe-bande (trieur de cellules BD Influx). Les portes de tri indiquées sont celles généralement utilisées pendant le tri. A) en points de protoplastes Col-4 feuilles dérivés, protoplasted en l&#39;absence d&#39;inhibiteurs, montrant une seule 530/low bas 580 habitants. B) en points de poids Col-4 feuilles de protoplastes dérivés, protoplasted en présence d&#39;inhibiteurs, montrant un changement de la fluorescence 580 à cause du stress et la coloration par les inhibiteurs. CE) Dot parcelles de feuilles protoplastes dérivés à partir des lignes KC74, KC464 et TP382, respectivement, protoplasted en présence d&#39;inhibiteurs de la GFP, montrant contenant populations dans le haut 530/low 580 populations. Les pourcentages des événements dans les GFP (haute 530/low 580) les populations sont donnés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . e_content &quot;fo: keep-together.within pages =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig4.jpg" /> Figure 4. Expression de la GFP dans les fractions représentatives de la population dépendants comme le montre la figure 3. Deux biologique reproduit ont été obtenus pour chaque type de fraction, amplifié en utilisant le système Ovation Pico WTA et qPCR utilisant des amorces spécifiques de la GFP (tableau 2) a été effectuée. Les valeurs indiquées sont les plus élevées (rouge), le plus bas (vert) et la moyenne des valeurs relatives. La population était élevée 580 dans ce cas divisée en deux, une faible 530/low 580 et haute 530/low 580, dont une réplique biologique unique a été utilisé afin que la seule valeur est indiquée. ACT2 (At3g18780) a été utilisé comme un standard pour tous les échantillons. Feuille: Feuilles entières. Unsorted: protoplastes non triés. GFP1: haute 530/low 580 et REST1: faible 530/low 580, GFP2: 530/high haute 580 et REST2: faible 530/high 580, tel que décrit à la figure 3 et l&#39;insert. Les résultats sont un o vérificationf évaluations optiques du contenu de la cellule GFP dans les fractions triées (2G figure, par exemple). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Échantillon </td><td> Nombre de feuilles </td><td> Nombre de cellules </td><td> ARN rendement (Ng) </td><td> ARN rendement (Amplifié; ng) </td></tr><tr><td> Une feuille entière B Feuilles entières </td><td> 1 1 </td><td> - - </td><td> 8001 10525 </td><td> 4623 *** 4572 *** </td></tr><tr><td> Un protoplastes Unsorted Unsorted B protoplastes </td><td> 5 5 </td><td> - - </td><td> 2433 2625 </td><td> 1152 *** 3321 *** </td></tr><tr><td> Un GFP1 Un REST1 </td><td> 15 </td><td> 6039 (0.39% *) 55389 (6.40% *) </td><td> - ** - ** </td><td> 861 489 </td></tr><tr><td> GFP1 B REST1 B </td><td> 15 </td><td> 10.783 (0.63% *) 57 040 (7,49% *) </td><td> - ** - ** </td><td> 537 420 </td></tr><tr><td> GFP2 Rest2 </td><td> 15 </td><td> 18337 (1.49% *) 62 405 (73,49% *) </td><td> - ** - ** </td><td> 360 411 </td></tr></tbody></table> Les échantillons Tableau 1. Recueillies à l&#39;aide FACS et analysées par qPCR afin de déterminer quelle fraction contenait vivantes exprimant GFP-protoplastes. Sont également inclus dans ce tableau est le rendement d&#39;ARN total en ng avant et après amplification avec le système Ovation Pico WTA (NuGen). Fractions GFP1, GFP2, REST1 REST2 et sont indiquées dans l&#39;insert de la figure 4. * Le pourcentage de cellules de la course de tri cellulaire total est donné entre parenthèses à côté du nombre de cellules dans la fraction. Ces pourcentages ne sont pas corrélées àl&#39;autre pour chaque échantillon, le type FACS fonctionne pour les fractions «repos» ont été arrêtés plus tôt que pour les fractions GFP en raison du nombre beaucoup plus élevé de cellules de repos collectées. ** 50 ng utilisé comme entrée pour les réactions d&#39;amplification, selon le protocole du fabricant. <table border="1"><tbody><tr><td> Apprêt </td><td> Séquence </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.fw </td><td> GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.rv </td><td> TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT </td></tr><tr><td> ACT2.fw </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr><tr><td> ACT2.rv </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Amorces qPCR.

<ol><li>Efroni, I., Eshed, Y., Lifschitz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+Simple+and+Compound+Leaves%3A+A+Critical+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of Simple and Compound Leaves: A Critical Review.</a> Plant Cell. 22, 1019-1032 (2010).</li>
<li>Kleber, R., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Quality+Assessment+of+RNA+From+Cell-Specific+Samples+Obtained+by+Laser+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation and Quality Assessment of RNA From Cell-Specific Samples Obtained by Laser Microdissection.</a> Methods Mol. Biol. 323, 367-377 (2006).</li>
<li>Birnbaum, K., Shasha, D. E., Wang, J. Y., Jung, J. W., Lamberts, G. M., Galbraith, D. W., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gene+Expression+Map+of+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Gene Expression Map of the Arabidopsis root.</a> Science. 302, 1956-1960 (2003).</li>
<li>Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Tissue-+and+Organ-specific+Phytochrome+Responses+using+FACS-assisted+Cell-type+Specific+Expression+Profiling+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. (39), e1925(2010).</li>
<li>Beal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Method+For+Gene+Expression+and+Chromatin+Profiling+of+Individual+Cell+Types+Within+a+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A Simple Method For Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types Within a Tissue.</a> Dev. Cell. 18, 1030-1040 (2010).</li>
<li>Mustroph, A., Zanetti, M. E., Jang, C. J. H., Holtan, H. E., Repetti, P. P., Galbraith, D. W., Girke, T., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> PNAS. 106, 18843-18848 (2009).</li>
<li>Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+Root+Expression+Patterns+Revealed+in+a+High-Resolution+Spatiotemporal+Expression+Map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dominant Root Expression Patterns Revealed in a High-Resolution Spatiotemporal Expression Map.</a> Science. 318, 801-806 (2007).</li>
<li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> PNAS. 105, 803-808 (2008).</li>
<li>Dinneny, J. R., Long, T. A., Wang, J. Y., Jung, J. W., Mace, D., Pointer, S., Barron, C., Brady, S. M., Schiefelbein, J., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+identity+mediates+the+response+of+Arabidopsis+roots+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress.</a> Science. 320, 942-945 (2008).</li>
<li>Peterson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li>
<li>Yadav, R. K., Girke, T., Pasala, S., Xie, M., Reddy, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+map+of+the+Arabidopsis+shoot+apical+meristem+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche.</a> PNAS. 106, 4941-4946 (2009).</li>
<li>Harkins, K. R., Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+photosynthesis-related+gene+fusions+is+restricted+by+cell+type+in+transgenic+plants+and+in+transfected+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Expression of photosynthesis-related gene fusions is restricted by cell type in transgenic plants and in transfected protoplasts.</a> PNAS. 87, 816-820 (1990).</li>
<li>Yang, Y., Costa, A., Leonhardt, N., Siegel, R. S., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+strong+Arabidopsis+guard+cell+promoter+and+it%27s+potential+as+a+research+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and it's potential as a research tool.</a> Plant Methods. 4, 6(2008).</li>
<li>Gardner, M. J., Baker, A. J., Assie, J. -M., Poethig, R. S., Haseloff, J. P., Webb, A. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+GFP+enhancer+trap+lines+for+analysis+of+stomatal+guard+cell+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal guard cell development and gene expression.</a> J. Exp. Bot. 60, 213-226 (2009).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons décrit une méthode qui permet l&#39;utilisation de plantes d&#39;Arabidopsis exprimant la GFP dans les feuilles pour la production de protoplastes et tri cellulaire ultérieure à l&#39;aide FACS. Cette méthode donne des quantités suffisantes d&#39;ARN à être utilisées pour l&#39;amplification et l&#39;analyse subséquente par conséquent supporte qPCR ou puce à ADN. Les fractions triées sont hautement enrichi pour la GFP contenant des cellules, tel que démontré par qPCR (Figure 2). Pour obtenir des rendements élevés de protoplastes vivants, il est essentiel de travailler rapidement au cours des premières étapes de la procédure, jusqu&#39;à ce que les bandes de feuilles ont été infiltrées sous vide avec la solution de protoplastes contenant l&#39;inhibiteur. En outre, lors de la génération bandes de 1 mm feuilles, il est très important de trancher ou couper les feuilles plutôt que «chop» ou écrasez-les, car cela conduit à des dommages excessifs et donc un rendement inférieur de protoplastes. Une différence cruciale entre la méthode décrite ici et publishe autreméthodes d est l&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs de RNase et d&#39;inhibiteurs de la transcription. La plupart des méthodes sont développées pour les racines d&#39;Arabidopsis, dont protoplastes peuvent être générées plus facilement. Toutefois, lorsque vous travaillez avec des feuilles, à l&#39;exception du mésophylle, il est nécessaire d&#39;augmenter le temps de génération de protoplastes. Par conséquent, il est important d&#39;inclure ces inhibiteurs pour protéger contre les variations de l&#39;expression des gènes à la suite du traitement génération de protoplastes lui-même (données non présentées). Cependant, la présence des inhibiteurs conduit à une incapacité à monter une réponse transcription, soit par commutation des gènes ON ou OFF, ce qui est susceptible de rendre les protoplastes plus vulnérables car cela conduit à une perte de plasticité permet de contrer le stress de la protoplastes procédure. Nous avons utilisé la méthode décrite ici avec succès un certain nombre de lignes exprimant la GFP Arabidopsis. Surtout, nous avons utilisé cette méthode avec des lignes GFP exprimant la GFP soit fortementle noyau, ou beaucoup plus faiblement de manière non-localized/diffuse cytosolique, comme c&#39;est le cas avec les KC464 KC274 et lignes utilisées ici. Les deux types de lignes sont compatibles avec la méthode et le rendement des fractions hautement enrichi de GFP exprimant protoplastes (Figure 2 et 3). La méthode pourrait être facilement adaptée à d&#39;autres fluorophores, bien que le fluorophore doit être sélectionné pour que la fluorescence est significativement différente de l&#39;autofluorescence des cellules mortes / meurt afin de préserver la possibilité de sélectionner les cellules vivantes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Cellulase R-10 </td><td> Melford </td><td> C8001 </td></tr><tr><td> Cellulase RS </td><td> Melford </td><td> C8003 </td></tr><tr><td> Macerozyme R-10 </td><td> Melford </td><td> M8002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3912 </td></tr><tr><td> ProtectRNA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7397 </td></tr><tr><td> Actinomycine D </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1410 </td></tr><tr><td> 70 um tamis cellulaire </td><td> Pêcheur </td><td> FB35181 </td></tr><tr><td> 50 um tasse de filtres de type Filcon </td><td> BD Biosciences </td><td> 340630 </td></tr></tbody></table>

analyse cellulaire spécifique de<em&gt; arabidopsis</em&gt; feuilles en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Après le début de l&#39;ébauche de feuille, l&#39;accumulation de la biomasse est commandé principalement par la prolifération des cellules et de l&#39;expansion dans les feuilles 1. Toutefois, la feuille d&#39;Arabidopsis est un organe complexe composé de plusieurs types cellulaires différents et plusieurs structures. Dans le même temps, la feuille de plus en plus contient des cellules à différents stades de développement, les cellules les plus éloignées du pétiole Soyez le premier à arrêter l&#39;expansion et se soumettre à la sénescence 1. Les différentes cellules dans la feuille sont donc diviser, élongation ou de différenciation; actif, stressés ou morts, et / ou répondre à des stimuli dans les sous-ensembles de leur type cellulaire à un moment donné. Cela rend l&#39;étude génomique de la contestation feuille: par exemple lors de l&#39;analyse des données d&#39;expression de feuilles entières, des signaux de réseaux génétiques qui opèrent dans des zones distinctes de réponse cellulaire ou des types cellulaires seront confondus, résultant en un profil inexactes généré. Pour résoudre ce problème, slusieurs méthodes ont été décrites qui permettent les études d&#39;expression génique de cellules spécifiques. Il s&#39;agit notamment de capture microdissection laser (LCM) 2 ou les plantes exprimant la GFP utilisées pour la production de protoplastes et après le tri cellulaire par fluorescence (FACS) 3,4, le système a récemment décrit l&#39;état intact de précipitation nucléaire 5 et 6 immunoprécipitation de polysomes. FACS a été utilisé avec succès pour un certain nombre d&#39;études, notamment en montrant que l&#39;identité de la cellule et la distance de l&#39;extrémité de la racine a eu un effet significatif sur les profils d&#39;expression d&#39;un grand nombre de gènes 3,7. FACS de lignes GFP ont également été utilisées pour démontrer spécifique des cellules régulation transcriptionnelle lors des interventions d&#39;azote racines et le développement des racines latérales 8, 9 Répartition sel de stress auxine dans la racine 10 et de créer une carte d&#39;expression génique du méristème apical Arabidopsis 11. Bien queFACS a déjà été utilisée pour trier les protoplastes de feuilles d&#39;Arabidopsis dérivés fondés sur autofluorescence 12,13, jusqu&#39;à l&#39;utilisation de FACS sur des lignes d&#39;Arabidopsis exprimant la GFP dans les feuilles a été très limitée 4. Dans le protocole suivant, nous décrivons une méthode pour obtenir des protoplastes de feuilles d&#39;Arabidopsis qui sont compatibles avec FACS, tout en minimisant l&#39;impact du régime de production de protoplastes. Nous démontrons la méthode utilisant la ligne KC464 Arabidopsis, qui expriment la GFP dans l&#39;épiderme ventral 14, la ligne KC274, qui expriment la GFP dans le tissu vasculaire 14 et la ligne Arabidopsis TP382, qui expriment la GFP construction en double lié à un signal de localisation nucléaire les cellules de garde (données non présentées, figure 2). Nous sommes en train d&#39;utiliser cette méthode pour étudier à la fois l&#39;expression spécifique au type cellulaire au cours du développement et le stress, ainsi que des populations de cellules hétérogènes à différents stades de la sénescence.

Procédé de fabrication d&#39;<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Protoplastes de feuilles qui sont compatibles avec le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), ce qui permet l&#39;étude des populations cellulaires spécifiques. Cette méthode est compatible avec n&#39;importe quel<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Line qui exprime la GFP dans un sous-ensemble de cellules.

Analyse cellulaire spécifique de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Feuilles en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé

Après l'initiation du primordium foliaire, l'accumulation de la biomasse est contrôlée principalement par la prolifération et l'expansion cellulaires dans les feuilles1. Cependant, le...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler une population de protoplastes spécifiques à un type cellulaire à partir d'une feuille. Cela est réalisé en premier lieu en cultivant des plantes exprimant la GFP dans des types cellulaires spécifiques de la feuille. La deuxième étape consiste à récolter les feuilles et à générer des protoplastes par digestion enzymatique.Ensuite, les protoplastes sont filtrés et triés à l'aide du tri cellulaire activé par fluorescence, ou FACS. La dernière étape consiste à confirmer la précision du triage par microscopie à fluorescence. En définitive, les protoplastes triés peuvent être utilisés pour l'analyse de l'expression génique spécifique à un type cellulaire, pour une analyse protéomique ou pour un profilage métabolique.Le tri cellulaire activé par fluorescence a déjà été utilisé avec succès sur les racines, mais il l'est également pour l'isolement de cellules foliaires. L'étiquetage par GFP avant cette méthode a été limité en raison des interférences dues à la fluorescence de la chlorophylle. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la préparation rapide mais soigneuse des échantillons est cruciale pour minimiser les changements physiologiques importants pouvant survenir pendant le tri cellulaire.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car elles ne sauront pas comment configurer le trieur cellulaire ni comment confirmer la justesse du tri. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie systémique des plantes. Le problème lié à l'identification des réseaux de régulation génique dans des organes multicellulaires complexes, comme une feuille, est que les différents types cellulaires expriment des groupes de gènes distincts.Ces informations génétiques sont perdues lors de l'analyse de récolte d'une feuille entière illustrant la procédure. À mes côtés se trouveront Ellison As et Sanjeev Kuma, qui apportent un soutien technique pour ce travail dans notre laboratoire. Remplissez d'abord une boîte de Pétri ronde de neuf centimètres de diamètre avec 20 millilitres de solution A contenant des enzymes de protoplastation ainsi que des inhibiteurs de la transcription et des ARN.Ensuite, récoltez le matériel foliaire souhaité pour les échantillons contenant plus d'une feuille, comme l'échantillon illustré ici. Disposez les feuilles en pile d'un maximum de 15 feuilles. Puis utilisez une lame de rasoir pour couper les feuilles en bandes d'un millimètre de large.Transférez immédiatement les bandes de feuilles dans la boîte de Pétri à l’aide d’une pince plate, séparez délicatement les bandes, puis réalisez une infiltration sous vide des échantillons deux fois, cinq minutes à chaque fois. Ensuite, placez la boîte de Pétri sur un agitateur orbital réglé à 90 tr/min à température ambiante et incubez les échantillons pendant trois à quatre heures. Pendant l’incubation, utilisez la pince pour séparer les bandes de feuilles les unes des autres toutes les demi-heures.Après la digestion, filtrer délicatement la solution de protoplastes à l’aide d’un tamis cellulaire de 70 microns dans un tube de 50 millilitres. Pour éliminer les lamelles de feuille, les lamelles seront retenues. Les protoplastes passeront au travers du filtre.Utilisez maintenant quatre millilitres de solution A pour rincer délicatement les lamelles foliaires en recueillant le rinçage dans le tube de 50 millilitres. Transférez ensuite la suspension de protoplastes dans des tubes à fond rond et centrifugez les protoplastes pendant cinq minutes à 300 ×g et à température ambiante. En prenant soin de ne pas perturber le culot, aspirez délicatement autant que possible le surnageant, puis lavez les protoplastes avec cinq millilitres de solution A dans les mêmes conditions de centrifugation.Enfin, après avoir éliminé le surnageant natant, utilisez une pointe coupée de P 1000 pour resuspendre les PROTOPLASTES dans un volume approprié de solution A en vue d’un tri immédiat. Utilisez une pointe non coupée de P 1000 pour désagréger tout agrégat présent dans la solution de protoplastes. Dissociez davantage les cellules en filtrant les protoplastes dans un tube de prélèvement à travers un filtre de 50 microns.Ensuite, diluez la solution cellulaire de manière appropriée afin d'éviter l'obstruction de la buse de prélèvement des cellules. Après avoir déterminé les conditions optimales de prélèvement cellulaire, identifiez les protoplastes positifs pour la GFP (Proto plus) à l'aide d'un laser Argonne de 488 nanomètres en comparant le signal en sortie du filtre passe-bande 580/30 avec celui du filtre passe-bande 530/40. Notez que les protoplastes positifs pour la GFP apparaîtront dans la population à signal élevé à 530 et faible à 580.Avec les protoplastes non GFP dans la population basse à 530 et basse à 580, les protoplastes morts ou mourants et les débris apparaissent dans la population haute à 580. Pour visualiser les protoplastes triés par microscopie de fluorescence, trier directement les protoplastes dans au moins huit volumes de solution A après concentration. Les protoplastes peuvent être triés dans huit volumes de solution A, puis recueillis pour observation au microscope à fluorescence afin de vérifier l'enrichissement. Cette première image montre un exemple d'enrichissement de la lignée cellulaire TP 382, qui exprime la GFP dans les cellules de garde. Des exemples de rendements obtenus avec cette méthode, avant et après amplification, sont résumés dans ce tableau.Les quantités obtenues, comprises entre 500 picogrammes et 50 nanogrammes, sont suffisantes pour l'amplification par le système Ovation Pico WTA et pour l'analyse ultérieure par PCR quantitative, séquençage de nouvelle génération ou puces à ADN. Cette série d'images montre diverses lignées cellulaires de protoplastes isolées et triées selon la méthode décrite ci-dessus. Ces premiers protoplastes ont été obtenus à partir de KC 2 74, feuilles d'une coupe transversale d'un KC 2 74.La feuille montre que la GFP est exprimée dans le système vasculaire. Ces protoplastes ont été isolés à partir de feuilles KC 4 64 et une coupe transversale d'une feuille KC 4 64 montre que l'expression de la GFP se trouve dans l'épiderme adaxial. Enfin, ces protoplastes ont été obtenus à partir de feuilles TP 3 82 chez TP 3 82.La GFP est exprimée dans les cellules de garde ici. Des histogrammes typiques d'acquisition en fax illustrant les résultats obtenus avec les filtres passe-bande de 5 80 30 nanomètres par rapport à ceux de 5 30 40 nanomètres sont présentés. La fenêtre de tri indiquée correspond à celle habituellement utilisée lors du tri.Ce premier graphique de dispersion de protoplastes issus de feuilles de coal four, protoplastés en l'absence d'inhibiteurs, montre une population unique à faible fluorescence 530 et faible fluorescence 580. En revanche, ce graphique de dispersion de protoplastes issus de feuilles de type sauvage coal four, protoplastés en présence d'inhibiteurs, démontre le décalage de la fluorescence 580 dû au stress et à la coloration provoqués par les inhibiteurs. Ces graphiques de dispersion proviennent respectivement de protoplastes issus de feuilles des lignées KC seven four, KC 4 64 et TP 3 82.Ces échantillons ont également été traités au plâtre en présence d'inhibiteurs, montrant que la GFP était contenue dans les populations hautes à 530 et basses à 580. Pour cette expérience représentative de PCR quantitative, des échantillons ont d'abord été obtenus pour chaque type de fraction. Les échantillons ont ensuite été amplifiés à l'aide du système Ovation Pico WTA et de la PCR quantitative.Une amplification à l’aide d’amorces spécifiques de la GFP a été réalisée. Les valeurs indiquées sont les plus élevées en rouge et les plus faibles en vert ; les valeurs moyennes ou individuelles, normalisées par rapport au gène de référence actine deux, sont représentées par des barres horizontales jaunes. Les résultats confirment une nouvelle fois les évaluations optiques de la teneur en cellules GFP dans les fractions triées.La population haute 530 basse 580 présentait les niveaux mesurables les plus élevés d'expression de la GFP. Alors que la population haute 530 haute 580 présentait une expression de la GFP environ 1000 fois plus faible, les populations basse 530 basse 580 et basse 530 haute 580 présentaient de faibles niveaux d'expression de la GFP comparables à ceux des populations témoins de feuille entière et de protoplastes non triés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à cinq heures, de la plante à la population de cellules triées, si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de surveiller constamment le trieur cellulaire et de le recalibrer si nécessaire afin de maintenir la précision du tri.Voici la procédure trouvée. D'autres méthodes, telles que l'analyse par microréseaux, peuvent être réalisées afin de comparer les niveaux d'expression génique dans différents types cellulaires. Maintenant que cette technique est mise au point, nous analysons l'expression génique dans des types cellulaires foliaires spécifiques à différents stades de développement, et nous comparerons ces résultats aux données provenant du feuille entière, générées dans le cadre du projet d'agronomie.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des types cellulaires uniques de feuilles en utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence.

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