Analyse cellulaire spécifique de Arabidopsis Feuilles en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé

L'objectif général de cette procédure est d'isoler une population de protoplastes spécifiques à un type cellulaire à partir d'une feuille. Cela est réalisé en premier lieu en cultivant des plantes exprimant la GFP dans des types cellulaires spécifiques de la feuille. La deuxième étape consiste à récolter les feuilles et à générer des protoplastes par digestion enzymatique.

Ensuite, les protoplastes sont filtrés et triés à l'aide du tri cellulaire activé par fluorescence, ou FACS. La dernière étape consiste à confirmer la précision du triage par microscopie à fluorescence. En définitive, les protoplastes triés peuvent être utilisés pour l'analyse de l'expression génique spécifique à un type cellulaire, pour une analyse protéomique ou pour un profilage métabolique.

Le tri cellulaire activé par fluorescence a déjà été utilisé avec succès sur les racines, mais il l'est également pour l'isolement de cellules foliaires. L'étiquetage par GFP avant cette méthode a été limité en raison des interférences dues à la fluorescence de la chlorophylle. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la préparation rapide mais soigneuse des échantillons est cruciale pour minimiser les changements physiologiques importants pouvant survenir pendant le tri cellulaire.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car elles ne sauront pas comment configurer le trieur cellulaire ni comment confirmer la justesse du tri. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie systémique des plantes. Le problème lié à l'identification des réseaux de régulation génique dans des organes multicellulaires complexes, comme une feuille, est que les différents types cellulaires expriment des groupes de gènes distincts.

Ces informations génétiques sont perdues lors de l'analyse de récolte d'une feuille entière illustrant la procédure. À mes côtés se trouveront Ellison As et Sanjeev Kuma, qui apportent un soutien technique pour ce travail dans notre laboratoire. Remplissez d'abord une boîte de Pétri ronde de neuf centimètres de diamètre avec 20 millilitres de solution A contenant des enzymes de protoplastation ainsi que des inhibiteurs de la transcription et des ARN.

Ensuite, récoltez le matériel foliaire souhaité pour les échantillons contenant plus d'une feuille, comme l'échantillon illustré ici. Disposez les feuilles en pile d'un maximum de 15 feuilles. Puis utilisez une lame de rasoir pour couper les feuilles en bandes d'un millimètre de large.

Transférez immédiatement les bandes de feuilles dans la boîte de Pétri à l’aide d’une pince plate, séparez délicatement les bandes, puis réalisez une infiltration sous vide des échantillons deux fois, cinq minutes à chaque fois. Ensuite, placez la boîte de Pétri sur un agitateur orbital réglé à 90 tr/min à température ambiante et incubez les échantillons pendant trois à quatre heures. Pendant l’incubation, utilisez la pince pour séparer les bandes de feuilles les unes des autres toutes les demi-heures.

Après la digestion, filtrer délicatement la solution de protoplastes à l’aide d’un tamis cellulaire de 70 microns dans un tube de 50 millilitres. Pour éliminer les lamelles de feuille, les lamelles seront retenues. Les protoplastes passeront au travers du filtre.

Utilisez maintenant quatre millilitres de solution A pour rincer délicatement les lamelles foliaires en recueillant le rinçage dans le tube de 50 millilitres. Transférez ensuite la suspension de protoplastes dans des tubes à fond rond et centrifugez les protoplastes pendant cinq minutes à 300 ×g et à température ambiante. En prenant soin de ne pas perturber le culot, aspirez délicatement autant que possible le surnageant, puis lavez les protoplastes avec cinq millilitres de solution A dans les mêmes conditions de centrifugation.

Enfin, après avoir éliminé le surnageant natant, utilisez une pointe coupée de P 1000 pour resuspendre les PROTOPLASTES dans un volume approprié de solution A en vue d’un tri immédiat. Utilisez une pointe non coupée de P 1000 pour désagréger tout agrégat présent dans la solution de protoplastes. Dissociez davantage les cellules en filtrant les protoplastes dans un tube de prélèvement à travers un filtre de 50 microns.

Ensuite, diluez la solution cellulaire de manière appropriée afin d'éviter l'obstruction de la buse de prélèvement des cellules. Après avoir déterminé les conditions optimales de prélèvement cellulaire, identifiez les protoplastes positifs pour la GFP (Proto plus) à l'aide d'un laser Argonne de 488 nanomètres en comparant le signal en sortie du filtre passe-bande 580/30 avec celui du filtre passe-bande 530/40. Notez que les protoplastes positifs pour la GFP apparaîtront dans la population à signal élevé à 530 et faible à 580.

Avec les protoplastes non GFP dans la population basse à 530 et basse à 580, les protoplastes morts ou mourants et les débris apparaissent dans la population haute à 580. Pour visualiser les protoplastes triés par microscopie de fluorescence, trier directement les protoplastes dans au moins huit volumes de solution A après concentration. Les protoplastes peuvent être triés dans huit volumes de solution A, puis recueillis pour observation au microscope à fluorescence afin de vérifier l'enrichissement. Cette première image montre un exemple d'enrichissement de la lignée cellulaire TP 382, qui exprime la GFP dans les cellules de garde. Des exemples de rendements obtenus avec cette méthode, avant et après amplification, sont résumés dans ce tableau.

Les quantités obtenues, comprises entre 500 picogrammes et 50 nanogrammes, sont suffisantes pour l'amplification par le système Ovation Pico WTA et pour l'analyse ultérieure par PCR quantitative, séquençage de nouvelle génération ou puces à ADN. Cette série d'images montre diverses lignées cellulaires de protoplastes isolées et triées selon la méthode décrite ci-dessus. Ces premiers protoplastes ont été obtenus à partir de KC 2 74, feuilles d'une coupe transversale d'un KC 2 74.

La feuille montre que la GFP est exprimée dans le système vasculaire. Ces protoplastes ont été isolés à partir de feuilles KC 4 64 et une coupe transversale d'une feuille KC 4 64 montre que l'expression de la GFP se trouve dans l'épiderme adaxial. Enfin, ces protoplastes ont été obtenus à partir de feuilles TP 3 82 chez TP 3 82.

La GFP est exprimée dans les cellules de garde ici. Des histogrammes typiques d'acquisition en fax illustrant les résultats obtenus avec les filtres passe-bande de 5 80 30 nanomètres par rapport à ceux de 5 30 40 nanomètres sont présentés. La fenêtre de tri indiquée correspond à celle habituellement utilisée lors du tri.

Ce premier graphique de dispersion de protoplastes issus de feuilles de coal four, protoplastés en l'absence d'inhibiteurs, montre une population unique à faible fluorescence 530 et faible fluorescence 580. En revanche, ce graphique de dispersion de protoplastes issus de feuilles de type sauvage coal four, protoplastés en présence d'inhibiteurs, démontre le décalage de la fluorescence 580 dû au stress et à la coloration provoqués par les inhibiteurs. Ces graphiques de dispersion proviennent respectivement de protoplastes issus de feuilles des lignées KC seven four, KC 4 64 et TP 3 82.

Ces échantillons ont également été traités au plâtre en présence d'inhibiteurs, montrant que la GFP était contenue dans les populations hautes à 530 et basses à 580. Pour cette expérience représentative de PCR quantitative, des échantillons ont d'abord été obtenus pour chaque type de fraction. Les échantillons ont ensuite été amplifiés à l'aide du système Ovation Pico WTA et de la PCR quantitative.

Une amplification à l’aide d’amorces spécifiques de la GFP a été réalisée. Les valeurs indiquées sont les plus élevées en rouge et les plus faibles en vert ; les valeurs moyennes ou individuelles, normalisées par rapport au gène de référence actine deux, sont représentées par des barres horizontales jaunes. Les résultats confirment une nouvelle fois les évaluations optiques de la teneur en cellules GFP dans les fractions triées.

La population haute 530 basse 580 présentait les niveaux mesurables les plus élevés d'expression de la GFP. Alors que la population haute 530 haute 580 présentait une expression de la GFP environ 1000 fois plus faible, les populations basse 530 basse 580 et basse 530 haute 580 présentaient de faibles niveaux d'expression de la GFP comparables à ceux des populations témoins de feuille entière et de protoplastes non triés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à cinq heures, de la plante à la population de cellules triées, si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de surveiller constamment le trieur cellulaire et de le recalibrer si nécessaire afin de maintenir la précision du tri.

Voici la procédure trouvée. D'autres méthodes, telles que l'analyse par microréseaux, peuvent être réalisées afin de comparer les niveaux d'expression génique dans différents types cellulaires. Maintenant que cette technique est mise au point, nous analysons l'expression génique dans des types cellulaires foliaires spécifiques à différents stades de développement, et nous comparerons ces résultats aux données provenant du feuille entière, générées dans le cadre du projet d'agronomie.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des types cellulaires uniques de feuilles en utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence.