Name: Spectrométrie de masse des antigènes glycosphingolipides (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Découvrez une méthode de spectrométrie de masse pour analyser les antigènes glycosphingolipides dans les cellules immunitaires. Cette technique sensible permet d'étudier l'expression lipidique et les biomarqueurs du cancer.

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DZ est pris en charge par MD Anderson Cancer Center et des subventions du NIH AI079232. MD Anderson Cancer Center est soutenu en partie par le NIH subvention CA16672.

1. Lab Problèmes de sécurité <ol><li> Tous les solvants organiques doivent être stockés dans des zones spécifiques avec un étiquetage clair. Voir les étiquettes par les fabricants pour les types d&#39;extincteurs requis. </li><li> Plusieurs réactifs utilisés sont potentiellement cancérigènes et peuvent causer la dépression mentale. Ces réactifs doivent être manipulés sous une hotte chimique avec ventilation (voir tableau des réactifs spécifiques et des équipements pour les détails). </li><li> Il est recommandé que lorsque l&#39;on travaille avec des solvants organiques et des cellules, équipement de protection individuelle tels que gants, blouse de laboratoire et une protection oculaire être utilisés à tout moment. </li></ol> 2. Extraction de Glycosphingolipides de cellules leucémiques de rat <ol><li> Boutique de cellules leucémiques de rat RBL 8 (de 10 millions à 100 millions) dans des tubes de verre 16x100 mm sous -80 ° C conditions. Les cellules sont comptées par un hémocytomètre après coloration au bleu trypan. La viabilité des cellules doit être supérieure à 95%. </li><li> Extraire les lipides en utilisant sonicat vasteions quatre fois pour 1-2 heures chaque polarité avec des solvants mixtes. Utiliser 6 ml de chloroforme-méthanol 1:1 (v / v) comme solvant premier et le dernier. Six millilitres d&#39;isopropanol: hexane: H 2 O 55:25:20 (v / v / v, retirer la phase supérieure par aspiration avant utilisation) peut alors être utilisé en tant que solvant seconde et troisième. Ce solvant est préparée par mélange isopropanol: hexane: H 2 O dans un rapport 55:25:20, en l&#39;agitant vigoureusement, et permettant une phase supérieure à apparaître, ce qui sera supprimé. Gardez la phase inférieure à l&#39;emploi. </li><li> Suivre sonication avec culot de centrifugation de la matière insoluble. Mettre en commun les surnageants. Séchez-les dans un Speedvac pendant 4 heures. Courant d&#39;azote ou d&#39;un évaporateur rotatif peut être utilisé si Speedvac n&#39;est pas disponible. Utilisez un bon piège à froid pour contenir des solvants organiques évaporés. La contamination de solvant organique dans l&#39;huile pompe à vide va se dégrader l&#39;efficacité de la pompe à vide. </li><li> Effectuer une analyse préliminaire à l&#39;aide de haute performance chromatographie sur couche mince (HPTLC). Pour quantifier les glycolipides, Préparer un Orcinol 0,2% dans une solution d&#39;acide sulfurique à 50% (100 mg dans 50 ml) et une norme galactose (40 mg dans 100 ml de solution). Préparer dans 30 pl de volume réactionnel une série de dilutions à utiliser en tant que courbe d&#39;étalonnage (à partir de 0 g / L à 20 g / L). Ajouter 20 ul de méthanol à chaque échantillon séries de dilution. Dissoudre chaque échantillon glycolipide dans 200 ul de méthanol, sonication, et utiliser 20 ul de mesure de la quantité de glycolipides. En tubes Eppendorf de 1,5 ml avec bouchon à vis (Sarstedt, 72.692.005), ajouter 0,4 ml de 0,2% en Orcinol solution d&#39;acide sulfurique 50% pour chaque échantillon, avec une série de galactose-H 2 O-méthanol solutions qui servent à la courbe d&#39;étalonnage . Faire bouillir pendant 5 min dans un bloc chauffant à 100 ° C. Lire la densité optique de la réaction colorée à 440 nm en utilisant Lever du lecteur de microplaques Tecan. À effectuer HPTLC, utiliser du chloroforme: méthanol: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) comme solvant pour les lipides neutres traités avec un mélange chloroforme-méthanol 1:1 (v / v). Utiliser isopropanol: hexane: H 2 O 55:25:20 (v / v / v)le solvant des lipides (acides gangliosides). Les GSL neutre isolé a été dissous dans 200 ul de chloroforme solvant: méthanol 1:1 (v / v) et chargé sur gel de silice Merck chromatographie sur couche mince plaque en Microcaps Drummond. Les plaques ont été réalisés dans le chloroforme solvant: méthanol: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) et séché. Les glycosphingolipides ont été visualisées par orcinol-acide sulfurique à 300 ° C. </li><li> Afin de séparer les lipides neutres des lipides acides, fraction sur les lipides neutres et acides par chromatographie échangeuse d&#39;anions sur une petite colonne de DEAE Sephadex A-25 [le DEAE Sephadex A25 résine peut être préparé en trempant Sephadex A-25 de résine poudre dans du chloroforme: méthanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) pendant une nuit. Aspirer le surnageant jusqu&#39;à ce que la résine Sephadex A25 est tout ce qui reste. Ajouter chloroforme frais: méthanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) pour laver la résine. Répétez trois fois pour éliminer les résidus chargés négativement de] Sephadex A25 résine. </li><li> Dissoudre, Soniquer (pas plus de 10 min), et remettre en suspension les lipides de l&#39;étape 2.1 dans le chloroforme: méthanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) en cas de besoin. </li><li> Préparer un petit DEAE Sephadex A25 (Cl) Formule colonne à l&#39;aide de laine de verre et un 9 &quot;pipette Pasteur. Paquet la laine de verre soigneusement afin que la poudre de résine ne passe pas à travers la colonne. Ajouter DEAE Sephadex A25 (formule Cl) à la résine&quot; cou &quot;de la 9&quot; pipette Pasteur sans laisser la colonne sèche. Assurez-vous que vous ne voyez pas toute résine dans l&#39;éluant. Les échantillons dissous dans le chloroforme: méthanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) ont été dissous. La fraction lipide neutre est la fraction d&#39;écoulement à travers. </li><li> Éluer la fraction lipidique acide (liée aux résines) avec 8 ml d&#39;acétate de sodium dans le méthanol. Séchez les deux fractions neutres et acides, les dessaler par dialyse, les sécher par Speedvac et de les analyser par HPTLC. </li></ol> La fraction acide contient gangliosides, qui peuvent être dialysés pour l&#39;étape de réaction directement 3.La fraction neutre contient non seulement les glycosphingolipides neutres, mais également les phospholipides (phosphatidylcholine et la sphingomyéline), qui doivent être éliminés par une réaction d&#39;acétylation. Dans notre expérience, la méthode d&#39;une cassette de dialyse, est plus efficace et plus pratique que d&#39;un tube de dialyse ou en phase inverse C18 colonne de chromatographie. <ol start="9"><li> La prochaine étape est l&#39;élimination des phospholipides de glycosphingolipides neutres par une acétylation et la réaction peracétylation. Sécher le Sephadex DEAE A-25 pass-through dans la fraction Speedvac (avec refroidissement) pendant 4 heures. Après les échantillons sont secs, remettez-les dans la Speedvac et sec pour un autre de 4 heures. Assurez-vous que ces échantillons sont complètement secs, comme toute l&#39;eau résiduelle permettra d&#39;éviter la réaction peracétylation. </li><li> Peracetylate les échantillons de 1 ml de pyridine et 0,5 ml d&#39;anhydride acétique dans l&#39;obscurité à température ambiante ou à 37 ° C pendant la nuit. Cette quantité d&#39;anhydride acétique et de la pyridine est bon pour un maximumà 200 ug de glycosphingolipides. Cette réaction peut être effectuée à 37 ° C, comme les GSL ont une meilleure solubilité. </li><li> Sécher la matière peracétylé par Speedvac pendant 3 heures, avec l&#39;ajout de 1 ml de toluène 3x (co-évaporation) pour assurer l&#39;évaporation complète. Si les échantillons ne sont pas encore complètement sec, Speedvac à sec. </li><li> Préparer un Florisil (Sigma-Aldrich) colonne (30-60 mesh, 10 × 80 mm) dans une pipette Pasteur avec de la laine de verre, en utilisant des perles Florisil. Perles Florisil doit être complètement sèche avant de l&#39;utiliser, par incubation dans un four à 110 ° C. Remplir les billes dans la pipette Pasteur jusqu&#39;à la nuque, et s&#39;équilibrer dans le 1,2-dichloroéthane-hexane 4:1 (v / v). </li></ol> Élution de la colonne Florisil est très rapide. La volatilité rapide des solvants peut conduire à un séchage colonnes. Ainsi, tous les mélanges de solvants doit être préparé avant d&#39;exécuter la colonne car il n&#39;est pas possible d&#39;arrêter la colonne pendant l&#39;élution. <ol start="13"><li> Appliquer le peracétyléchantillon ATED dans 1 ml de 1,2-dichloroéthane-hexane 4:1 (v / v), et laver la colonne avec 6 ml du même solvant, puis 10 ml de 1,2-dichloroéthane. Éluer neutres GSL peracétylés avec 6 ml de 1,2-dichloroéthane-acétone 1:1 (v / v). Cette étape supprime les phospholipides peracétylés de glycosphingolipides, parce que les glycosphingolipides peracétylés lier à la colonne Florisil, tout en phospholipides peracétylés pas. </li><li> Sécher les fractions par Speedvac pendant 2 heures et désacétyler avec 2 ml 0,5 M de méthylate de sodium [Sigma-Aldrich, 403067] dans 2 ml de méthanol pendant 3 heures à température ambiante. </li><li> Neutraliser le mélange avec 3 ml d&#39;acide acétique méthanolique [acide acétique / méthanol 15/85 v / v], sécher en Speedvac, dessaler par dialyse [Dissoudre les produits séchés dans 3 ml d&#39;eau, et les injecter dans le Slide-A-Lyzer Cassette dialyse, dialyse contre de l&#39;eau pendant 24 heures. Changer l&#39;eau au moins deux fois]. Sécher les GSL dialysés (en solution aqueuse) par Speedvac jusqu&#39;à ce que les échantillons soient complètement sèches. </li&gt; </ol> 3. Modification chimique (perméthylation) de Glycosphingolipides 13 <ol><li> Présentez GSL (1-20 mg) dans un tube en verre avec un bouchon à vis et un revêtement en Téflon, et ajouter le diméthylsulfoxyde (150 pi) sans utiliser des conditions particulières de séchage ou une atmosphère de gaz inerte. </li><li> Préparer l&#39;hydroxyde de sodium en poudre (40-60 mg) de particules d&#39;hydroxyde de sodium par broyage dans un mortier avec un pilon chimique. Prenez soin de stocker les poudres dans un environnement très sec et d&#39;être attentifs à faire le broyage dans la hotte chimique pour éviter de respirer les poudres. </li><li> Ajouter ensuite la poudre d&#39;hydroxyde de sodium à la solution d&#39;échantillon avec une spatule. Ajouter iodométhane (80 pi) avec une seringue de 100 microlitres Halmilton, [ou un VWR 100 microlitres calibré pipette liée à une seringue à travers un tube en caoutchouc peut être utilisé], et agiter le mélange à la température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Stopper la réaction de méthylation avec de l&#39;eau (2 ml). Extraire les produits perméthylés 3 fois parl&#39;addition de dichlorométhane (2 ml) [glycolipides sont dans la phase de dichlorométhane, qui est la phase inférieure, de sorte que la phase supérieure est transférée dans un nouveau tube en verre, et on extrait à nouveau avec du dichlorométhane]. </li><li> Laver le dichlorométhane combinés extrait 3 fois avec 2 ml d&#39;eau [la phase supérieure, qui est l&#39;eau, peuvent alors être éliminés]. Après le dernier lavage, transférer les échantillons dans un nouveau tube et sécher à l&#39;aide de la Speedvac. </li><li> Les échantillons peuvent ensuite être dissous dans 100 à 200 ul de méthanol pour analyse ESI-MS. </li></ol> 4. MALDI-TOF des Gycosphingolipids perméthylé <ol><li> Effectuer MALDI-TOF-MS et MALDI-TOF/TOF-MS/MS expériences sur un spectromètre MALDI TOF-TOF (Applied Biosystems 4700, Foster City, CA). Préparer la matrice en mélangeant un volume de 50% de 10 mg / ml d&#39;acide dihydroxybenzoïque (DHB) dans de l&#39;acétonitrile et 50% du volume d&#39;acide trifluoroacétique 0,1% (TFA) dans l&#39;eau. </li><li> La matrice DHB peut être repéré sur la targe MALDIt (1 pl), suivie d&#39;une pl 1 (contenant 100 ng GSL) place de l&#39;échantillon dissous dans le méthanol. Appliquer lentement et laissez-les sécher avant l&#39;analyse. </li></ol> 5. MS Ion Trap Analyse des Glycosphingolipides perméthylés <ol><li> Effectuer la spectrométrie de masse sur un spectromètre de masse à piège ionique linéaire (LTQ, ThermoScientific, San Jose, CA) en utilisant une source nanoelectrospray, 0,30 Débit l / min à 230 ° C de la température capillaire en mode ion positif avec une énergie de collision de 30-50%. Définir des énergies de collision de laisser une abondance résiduelle minimale de l&#39;ion précurseur. Détecter les ions comme produits d&#39;addition de sodium. </li><li> Identifier le iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) dans un mélange isobare de Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) et iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) les normes en comparant les différents modèles d&#39;ions MS produit 4 à partir de l&#39;ion moléculaire sodiated via le fragment glycane m / z 667 et le disaccharide terminal 1 - ène ion m / z 445 (c.-à-X → → 445 → 667, X désigne l&#39;ion moléculaire détectée à MS 1) de pures perméthylés iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) par l&#39;intermédiaire de normes ESI-LIT-MS avec ceux de perméthylée Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer). </li></ol>

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</ol>

DZ est consultant pour Biotex, Houston, TX, et un inventeur impliqués dans les brevets liés aux technologies mentionnées dans cet article, délivrés ou en application.

Le glycome, un terme inventé par analogie avec le génome et du protéome, se réfère à toutes les structures saccharidiques d&#39;un organisme. Pour bien comprendre les multiples fonctions de glycosylation exigera une approche intégrée incluant deux études fonctionnelles et structurales glycomique. Les deux sont compliquées par la nature non-template axé sur la biosynthèse des glycanes, la complexité qui en résulte et la diversité des structures des glycanes, la participation fréquente de la structure aglycone dans la modulation des glycanes interactions ligand-récepteur au niveau moléculaire, et l&#39;importance fonctionnelle de ligands de faible abondance. Il est généralement admis que la spectrométrie de masse (MS) est une méthode indispensable pour les études en glycomique structurelles, en particulier pour l&#39;identification et la caractérisation des ligands de faible abondance. Pour observer glycanes ou glycoconjugués que les espèces moléculaires, on utilise souvent un très efficace, la méthode d&#39;ionisation faible énergie, appelée ionisation par électrospray (ESI). Pour plus d&#39;detailed caractérisation de la structure glycane, il est essentiel de choisir des espèces moléculaires individuelles et de briser les glycanes en petits morceaux. Cela se fait normalement par dissociation induite par collision, ce qui implique l&#39;activation des glycanes par collision avec les molécules de gaz inertes. L&#39;énergie a augmenté induit rupture de liaison, et l&#39;analyse systématique des fragments résultants fournit des informations sur la structure moléculaire du glycane. Souvent, &quot;signature&quot; fragments peuvent être générés qui sont de diagnostic pour certains glycanes caractéristiques structurelles. En collaboration avec la masse moléculaire, ces fragments peuvent parfois suffire pour identifier les glycanes, mais dans le passé beaucoup plus d&#39;informations a été nécessaire de bien les caractériser, en particulier si la structure est nouvelle. Ces méthodes comprennent l&#39;analyse la composition en sucre, chromatographie en phase gazeuse spectrométrie de masse partiellement méthylés acétates d&#39;alditol pour l&#39;analyse de liaison, et la digestion glycosidase spécifique 17. 18-19, plusieurs tours de la fragmentation de faible énergie, qui peut être efficacement réalisé dans un spectromètre de masse à trappe d&#39;ions (IT-MS), améliore considérablement le rendement de l&#39;analyse des informations glycane spectrométrie de masse . Avec quatre ou cinq tours de fragmentation (qui ne peut être fait avec des instruments d&#39;autres EM), il est possible de distinguer glycanes isomères qui contiennent les composants de sucre mêmes disposées dans des liaisons sucre différents, même lorsque ceux-ci sont présents ensemble dans des mélanges de composants avec le même masse moléculaire (isobares). Pour cette analyse, les glycanes ont été dérivés, en remplacement de tous les groupes hydroxyles libres avec des groupes méthyliques à l&#39;aide perméthylation. Alors que l&#39;affectation de la structure des glycanes est possible sans perméthylation, le perméthylation augmente la sensibilité à 17. Levery et Zhou, ont combiné tous les avantages potentiels de la TI-MS méthodologie, y compris la détection des isomères strumages utilisant des ions signature de diagnostic, observables seulement dans MS 4 et MS 5 spectres, pour l&#39;identification et la quantification très sensible de glycosphingolipides présents sous forme de mélanges de plusieurs isobares 7-9. En théorie, nous pourrions être en mesure d&#39;identifier chaque structure existante glycolipide, dans l&#39;attente de la disponibilité des glycolipides standard, qui peuvent être synthétisés chimiquement. Les étapes essentielles de cette analyse sont les taux de récupération de GSL à partir d&#39;échantillons biologiques. Typiquement 80 pg de GSL peuvent être récupérés à partir de 100 millions de cellules tumorales comme RBL. Pour générer suffisamment d&#39;ions moléculaires pour de multiples séries de fragmentation dans les spectromètres de masse d&#39;ions piège, au moins 10 microgrammes de GSL tumorales sont nécessaires. Faible rendement de GSL cours de la purification mènera à la faible abondance des ions, qui ne pouvaient pas être soumis à une nouvelle fragmentation. La réussite de l&#39;analyse est fonction de la quantité de GSL qui sont récupérés. En règle générale, concentration finaleentration de GSL perméthylés devrait atteindre 1 mg / ml en solution dans le méthanol, avant d&#39;être analysés sur une source de nano-électrospray. La limite pour une analyse approfondie MS n dépend de l&#39;abondance de l&#39;ion spécifique dans MS 1 profil. Une abondance d&#39;ions e typique 7 est requis pour un examen approfondi MS 5 analyse. Le faible rendement des GSL cours de la purification peut être causée par la perte de GSL lors de l&#39;étape peracétylation (qui supprime les phospholipides), lorsque les GSL par acétylés doit être liée à la colonne Florisil chromatographie sur résine, lavées et ensuite éluée. Afin d&#39;assurer la liaison de per-acétylés GSL de gel de silice, les échantillons doivent être rechargé deux fois pour la colonne de chromatographie après avoir traversé.

<table><tbody><tr><td>1,2 Dichlor&amp;#8211;thane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34872</td><td>Cancérigène </td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>VMR</td><td>JT9524-0</td><td></td></tr><tr><td>Anhydride acétique</td><td>Fluka</td><td>45830</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Fischer</td><td>A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme </td><td>Fischer</td><td>C606-1</td><td>Cancérigène</td></tr><tr><td>DEAE Sephadex A25 (forme Cl)</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>AB 17&amp;#8212;170-01</td><td>100 gramme</td></tr><tr><td>Décane (anhydre) : </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>457116</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Acide dichloroacétique</td><td>Sigma</td><td>D54702</td><td>Cancérigène</td></tr><tr><td>Cassette de dialyse </td><td>Fischer (Pierce)</td><td>66110</td><td>Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml </td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>20684</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d'éthyle </td><td>Fischer</td><td>UN1173</td><td></td></tr><tr><td>Florisil</td><td>Fluka</td><td>46384</td><td>pour le remplissage de colonne de chromatographie</td></tr><tr><td>Hexanes </td><td>EMD</td><td>HX0290-6</td><td></td></tr><tr><td>Iodométhane </td><td>Riedel de Haen, Allemagne</td><td>03810</td><td>stabilisé avec feuille d'argent, cancérigène</td></tr><tr><td>Méthanol </td><td>VWR/EMD</td><td>MXO475-1</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de glycosphingolipides neutres Qualmix </td><td>Matreya</td><td>1505</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de monosialogangliosides</td><td>Matreya</td><td>1508</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de disialogangliosides </td><td>Matreya</td><td>1509</td><td></td></tr><tr><td>Céramide lactosyl et dérivés sialosyl </td><td>Matreya</td><td>1510</td><td></td></tr><tr><td>Céramide gangliotétraosyl et dérivés sialosyl </td><td>Matreya</td><td>1511</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de Pasteur</td><td>Fischer</td><td>13-678-6A</td><td>9"''</td></tr><tr><td>Pyridine : </td><td>Sigma</td><td>270407</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium : </td><td>BDH</td><td>0292</td><td>500 grammes</td></tr><tr><td>Méthanoate de sodium </td><td>Sigma</td><td>404367</td><td>Solution 0,5 M dans le méthanol</td></tr><tr><td>Toluène </td><td>J.T. Baker</td><td>9351-03</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Pipettes de Pasteur</td><td>Fischer</td><td>13-678-6A</td><td>9"''</td></tr><tr><td>Fibre de verre (laine de verre)</td><td>Corning Incorporated</td><td>3950</td><td>Verre Pyrex 9989</td></tr><tr><td>Tubes en verre 12x75 mm</td><td>Fischer</td><td>14-962-10B</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes calibrées (100 microlitres)</td><td>VMR</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Tubes jetables en borosilicate 16x100 mm x1 000 </td><td>Fischer</td><td>14-961-29</td><td>Avec bouchons à vis</td></tr><tr><td>Bouchons pour tubes en verre</td><td>Kimble</td><td>40566C</td><td>Taille/13-415 </td></tr><tr><td>Plaques Merck de CCM</td><td>Sigma</td><td>Z 29, 301-6</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir en verre pour CCM</td><td>Sigma</td><td>Z 12,619-5</td><td></td></tr><tr><td>Microcaps Drummond </td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0100</td><td>10 &amp;mu;l, pour le chargement des échantillons de CCM</td></tr><tr><td>Lecteur d'absorbance de microplaque Sunrise</td><td>Tecan</td><td>A-5082</td><td></td></tr><tr><td>Papier à chromatographie Whatman</td><td>Fischer</td><td>05-716-3E</td><td>18 cm x 34 cm pour réservoir de CCM</td></tr><tr><td>Réactif de pulvérisation orcinol chlorure ferrique</td><td>Sigma</td><td>O7875</td><td>Pour la détection des glycosphingolipides sur les plaques de CCM</td></tr><tr><td>Unité de pulvérisation Prevel</td><td>Sigma</td><td>Z 36,555-6</td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur</td><td>Fischer</td><td>FS20</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac</td><td>Savant</td><td>AS160</td><td>Avec piège chimique pour solvants organiques</td></tr><tr><td>Spectromètre de masse MALDI TOF-TOF</td><td>Applied Biosystems</td><td>Proteomics 4700</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre de masse à ionisation piégeage</td><td>Thermo</td><td>LTQ</td><td></td></tr></tbody></table>

spectrométrie de masse des antigènes glycosphingolipides

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipides (GSL) appartiennent à la classe glycoconjugué de macromolécules biologiques, qui portent des informations structurales importantes pour les processus biologiques comme le développement embryonnaire, la transduction du signal, et la reconnaissance du récepteur immunitaire 1-2. Ils contiennent des groupements sucres complexes sous la forme d&#39;isomères, et des fractions lipidiques à des variations dont la longueur d&#39;acyle gras à chaîne, une insaturation, et l&#39;hydroxylation. Les deux parties d&#39;hydrate de carbone et de céramide peut être à la base de la signification biologique. Par exemple, les tri-hexosylceramides comprennent globotriaosylcéramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) et isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), qui ont des masses moléculaires identiques mais distincts de liaisons sucre résidu hydrate de carbone, complètement chargé de différentes fonctions biologiques 3-4. Dans un autre exemple, il a été démontré que la modification de la partie céramide de l&#39;alpha-galactosylcéramide, un ligand agoniste puissant pour invaant les cellules NKT, les changements de leur profil de sécrétion de cytokines et de fonctions dans des modèles animaux de cancer et de maladies auto-immunes 5. La difficulté à effectuer une analyse structurale des isomères dans les organes immunitaires et les cellules servent de barrière pour la détermination de nombreuses fonctions biologiques 6. Ici, nous présentons une version visualisée d&#39;une méthode d&#39;analyse relativement simple, rapide et sensible des profils de glycosphingolipides dans les cellules immunitaires 7-9. Cette méthode est basée sur la modification de l&#39;extraction et chimiques (perméthylation, voir ci-dessous la figure 5A, tous les groupes OH des hexoses ont été remplacés par MeO après réaction perméthylation) de glycosphingolipides 10-15, suivie d&#39;une analyse ultérieure en utilisant laser assistée par matrice de désorption / ionisation temps de vol spectrométrie de masse (MALDI-TOF/MS) et la spectrométrie de masse à ions piège. Cette méthode nécessite 50 millions de cellules immunitaires pour une analyse complète. Les expériences peuvent être complétés d&#39;ici une semaine. L&#39;abondance relative des différents glycosphingolipides peut être délimitée par rapport aux normes de synthèse. Cette méthode a une sensibilité de mesure de 1% parmi les iGb3 Gb3 isomères, lorsque 2 fmol du total iGb3/Gb3 mélange est présent 9. Spectrométrie de masse des ions piège peut être utilisé pour analyser les isomères. Par exemple, pour analyser la présence de globotriaosylcéramide et isoglobtriaosylceramide dans le même échantillon, on peut utiliser la fragmentation de molécules structurellement glycosphingolipides à discriminer entre les deux (voir ci-dessous figure 5). En outre, la modification chimique des fractions de sucre (par le biais d&#39;une réaction perméthylation) améliore l&#39;efficacité d&#39;ionisation et de fragmentation pour une meilleure sensibilité et spécificité, et augmente la stabilité des résidus d&#39;acide sialique. La modification chimique d&#39;extraction et de glycosphingolipides peut être réalisée dans une hotte certifiée chimique classique, et la spectrométrie de masse peut être effectué par le noyauinstallations avec des instruments d&#39;ions MS piège.

Un exemple d&#39;une analyse MALDI MS des glycosphingolipides de la leucémie chez le rat lignée cellulaire RBL (un type de cellules présentant l&#39;antigène qui présente des antigènes de glycosphingolipides dans les cellules NKT) est illustré à la figure 3. Les ions peuvent être affectés à des structures de glycosphingolipides (figure 3A). Dans les cellules RBL traités par la NB-DGJ 16, un médicament qui inhibe la synthèse des glycosphingolipides, une réduction significative de tous les glycosphingolipides a été observée (figure 3B). Isomères structurels ne peuvent pas être distingués. La capacité de MS / MS de l&#39;Applied Biosystems 4700 permet la fragmentation des ions à MS1 MS 2 fragments, ce qui permet peu d&#39;information structurelle à générer. Cependant, l&#39;analyse MS2 n&#39;est souvent pas suffisante pour discriminer isomères oligosaccharides. L&#39;analyse Ion Trap MS de glycosphingolipides permet l&#39;étude des isomères, tels que iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) et Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) qui peuvent exister sous les ions détectés trihexosylcéramide sur la figure 3A. Pour détecter de tels isomères, standard iGb3 et Gb3 ont été analysés par plusieurs tours de fragmentation, jusqu&#39;à ce que les différences ont été trouvées (figure 4A et 4B). Dans l&#39;exemple présenté ici (figure 5C) iGb3 et Gb3 peut être discriminé en comparant la norme iGb3 et Gb3. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" /> Figure 1. Organigramme de la procédure d&#39;extraction des glycosphingolipides, et la modification chimique de glycosphingolipides (perméthylation). Glycosphingolipides ont été extraites de cellules par des solvants organiques. Pour éliminer les non-glycosphingolipides, les lipides peuvent être peracétylé et désacétylé. Deuxièmement, les glycosphingolipides ont été modifiés chimiquement par une réaction perméthylation, ce qui améliore la sensibilité et la spécificité de MS detection. Enfin, les profils de glycosphingolipides ont été déterminés par MALDI-TOF spectrométrie de masse et spectrométrie de masse des ions piège. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" /> Figure 2. Quantification des glycosphingolipides par la méthode de l&#39;acide sulfurique Orcinol: Quantification des glycosphingolipides l&#39;aide d&#39;un Orcinol 0,2% dans une solution d&#39;acide sulfurique à 50% et une courbe standard de glucose. <img alt="Figure 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" /> Figure 3. Glycosphingolipidomics de cellules leucémiques de rat A. Représentant du spectre de masse MALDI;. Chaque ion représente une structure spécifique glycosphingolipides, les isomères structuraux ne peuvent être distingués B. NB-DGJ, un médicament qui inhibe la synthèse des glycosphingolipides, art.réduit ignificantly tous les glycosphingolipides produites dans des cellules RBL. <img alt="Figure 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" /> Figure 4. Spectrométrie de masse en tandem d&#39;isomères de Glycosphingolipides. A. voies de décomposition caractéristiques pour la spectrométrie d&#39;ions mode positif masse à piège de GSL perméthylés FR 3 Cer et IGB 3 Cer. Gb 3 et IGB 3 sont clairement séparés par leurs patrons de fragmentation. Les différences dans les liens se reflètent dans les 4 ions MS des produits compatibles avec les isobares m / z 445 précurseurs. B. Les résultats représentatifs montrant iGb3 peut être mesurée dans un mélange d&#39;isomères iGb3/Gb3. Les étoiles indiquent les ions diagnostiques pour iGb3 seulement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour</a>Agrandir la figure. <img alt="Figure 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" /> Figure 5. Piège à ions MS permet l&#39;analyse des isomères de glycosphingolipides. A. Norme iGb3 et la différence spectacle Gb3 du profil de fragmentation après 4 tours de la fragmentation dans un piège à ions LTQ spectromètre de masse. B. Caractéristique MS 4 Profil d&#39;ions provenant de iGb3 ou Gb3. C. Trihexosyleramides sont des mélanges d&#39;isomères Gb3 iGb3 et qui peuvent être identifiés par la méthode MS piège à ions (Figure Dapeng par Zhou). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

Une méthode spécifique et sensible pour mieux comprendre le profil d&#39;expression des antigènes de glycosphingolipides dans les organes et les cellules immunitaires est décrite. La méthode tire parti de la spectrométrie de masse à piège ionique permettant progressive fragmentation de molécules de glycosphingolipides pour l&#39;analyse structurelle par rapport aux normes synthétisés chimiquement.

Spectrométrie de masse des antigènes glycosphingolipides

Les glycosphingolipides (GSL) appartiennent à la classe des glycoconjugués des biomacromolécules, lesquelles portent des informations structurales pour des processus biologiques significatifs...

L'objectif général de cette procédure est de créer une méthode spécifique et sensible permettant d'obtenir des informations sur le profil d'expression des antigènes lipidiques glyco fing dans les organes et cellules immunitaires. Cela est réalisé en extrayant d'abord les lipides glyco fing à partir des cellules. La deuxième étape consiste à séparer les lipides glyco fing neutres des lipides glyco fing acides.Après élimination des phospholipides à partir des lipides neutres, les glycolipides extraits sont modifiés chimiquement par une réaction de perméthylation au cours de laquelle tous les groupes hydroxyle des hexoses sont remplacés par des groupes méthoxy. Enfin, les glycolipides extraits sont analysés par spectrométrie de masse à ionisation laser assistée par matrice, désorption, temps de vol, abrégée en MALDI-TOF MS, ainsi que par spectrométrie de masse en piège à ions. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la CLHP analytique et la coloration par anticorps est que la spectrométrie de masse est plus sensible et permet de mesurer avec précision la masse des molécules.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, comme la mesure de faibles abondances d'antigènes glycolipidiques. Les implications de cette technique s'étendent vers le traitement ou le diagnostic du cancer, car de nombreux antigènes glycolipidiques tels que GD deux et global H sont exprimés comme biomarqueurs du cancer. Je vais démontrer la procédure en tant qu'étudiant de premier cycle du laboratoire du professeur DA pen Zoe.Le Dr. David Hawk effectuera des procédures sur les instruments de spectrométrie de masse. Avant de commencer cette procédure, préparez des cellules de leucémie basophile du rat en comptant les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Après coloration au bleu de trypan, la viabilité des cellules doit être supérieure à 95 %. Extrayez les lipides en ajoutant d'abord six millilitres d'un mélange de chloroforme et de méthanol en rapport volumétrique de un pour un aux cellules.Utilisez une sonication prolongée pendant une à deux heures avec le solvant à polarité mixte. Répétez cette procédure deux fois avec un rapport volumétrique de 55 à 25 à 20 d’isopropanol, d’hexane et d’eau préparé comme décrit dans la procédure écrite, en tant qu’extraction finale. Ajoutez six millilitres de chloroforme, de méthanol, puis effectuez une sonication.Après la sonication, effectuez une centrifugation pour former un culot du matériau insoluble à 4 000 tr/min pendant cinq minutes. Récupérez le surnageant avant de le sécher dans un évaporateur sous vide pendant quatre heures. Afin de séparer les lipides neutres des lipides acides, utilisez une chromatographie d'échange d'anions sur une petite colonne de de A e sedex A 20.Après avoir préparé le DEAE SEDEX A 25 comme décrit dans la procédure écrite accompagnant cette vidéo, préparez la colonne en utilisant un mur de verre et une pipette à pâte de neuf pouces. Emballez soigneusement le mur de verre afin que la poudre de résine ne traverse pas la colonne. Ajoutez la résine DEAE SEDEX A 25 dans le col de la pipette à pâte de neuf pouces sans laisser la colonne sécher.Veillez à ce qu'il n'y ait aucune résine dans l'eent. Dissoudre, soniquer et resuspendre les lipides dans un rapport volumétrique de 30 à 60 à 8 de chloroforme, méthanol, eau, puis appliquer les échantillons dissous sur la colonne. Les lipides neutres traverseront la colonne, tandis que les lipides chargés resteront dans la colonne ; éluerez la fraction de lipides acides avec huit millilitres d'acétate de sodium dans le méthanol.La fraction sèche chargée négativement après traitement par l'acétate de sodium est montrée ici. Désalez les fractions par dialyse en utilisant la cassette de dialyse Slide Eliza. Séchez les fractions par évaporation sous vide avant l'analyse préliminaire des lipides par chromatographie sur couche mince à haute performance ou CCM-HP, afin d'effectuer la CCM-HP, dissolvez les lipides neutres glycosylés isolés ou LGL dans 200 microlitres d'un solvant de chloroforme-méthanol en rapport volumétrique un pour un.Déposer l'échantillon sur une plaque de chromatographie sur couche mince en gel de silice. Faire migrer les plaques dans un mélange de chloroforme, de méthanol et d'eau dans un rapport volumétrique de 60:35:8 après séchage de la plaque. Visualiser les lipides glyco-finger à l'aide d'acide sulfurique arsénié à 300 degrés Celsius pour les lipides acides ou les gangliosides.Utilisez un rapport volumétrique de 55 à 25 à 20 d'isopropanol, d'hexane et d'eau comme solvant et effectuez la chromatographie en H-P-T-L-C de la même manière. À ce stade, la fraction neutre contient non seulement des lipides glycosylés neutres, mais aussi des phospholipides, qui doivent être éliminés par une réaction d'acétylation et de para-acétylation. Tout d'abord, séchez la fraction passée au DEAE sedex A 25 au moyen d'un évaporateur rotatif sous refroidissement pendant quatre heures.Une fois les échantillons secs, remettez-les dans le speed vac et séchez-les encore quatre heures. Veillez à ce que ces échantillons soient parfaitement secs, car toute trace d'eau empêcherait la réaction de para-acétylation. Ajoutez un millilitre de PERINE et 0,5 millilitre d'anhydride acétique aux échantillons pour la réaction de para-acétylation de jusqu'à 200 microgrammes de glycolipides, en incubant à l'abri de la lumière à 37 degrés Celsius pendant la nuit.Une température à laquelle les GSL présentent de meilleures performances nécessite d'ajouter un millilitre de toluène pour assurer une évaporation complète, puis de sécher le matériau paracétique par évaporation sous vide rapide pendant trois heures. Si les échantillons ne sont toujours pas complètement secs, poursuivre l'évaporation sous vide rapide jusqu'à séchage complet ; l'échantillon paracétique séché est montré ici. Pendant ce temps, préparer une colonne de Florisil en séchant complètement les billes de Florisil par incubation dans une étuve à 110 degrés Celsius.Ensuite, préparez la colonne dans une pipette Pasteur contenant de la laine de verre en remplissant la pipette avec les billes jusqu'au col et en équilibrant selon un rapport volumétrique de quatre pour un de dichloroéthane/hexane. L'élution à partir d'une colonne de cellules à flux est très rapide. La volatilité rapide des solvants peut entraîner l'assèchement de la colonne. Par conséquent, tous les mélanges de solvants doivent être préparés avant de faire fonctionner la colonne.Étant donné qu'il n'est pas possible d'arrêter la colonne pendant l'élution, appliquez l'échantillon pur à raison d'un millilitre pour un rapport volumétrique de quatre à un de dichloroéthane sur hexane. Lavez la colonne avec six millilitres du même solvant, suivis de 10 millilitres de dichloroéthane pour l'élution.Neutralisez le GSL avec six millilitres d’un mélange éthanolique à un rapport volumétrique un pour un de dichlorométhane et d’acétone. Cette étape élimine les phospholipides du percet des lipides glycosylés, car les lipides glycosylés du percet se lient à la colonne de fluorure tandis que les phospholipides du percet ne s’y lient pas. Après avoir séché les fractions par centrifugation sous vide pendant deux heures, procédez à la déacétylation avec deux millilitres de méthoxyde de sodium 0,5 molaire et deux millilitres de méthanol pendant trois heures à température ambiante.Après l'incubation, neutraliser le mélange avec trois millilitres de méthanol, d'acide acétique et sécher par centrifugation sous vide, puis dialyser en dissolvant les produits séchés dans trois millilitres d'eau et en injectant dans la cassette de dialyse Eliza suivie d'une dialyse contre l'eau pendant 24 heures, en changeant l'eau au moins deux fois. Sécher le GSL dialysé par évaporation sous vide jusqu'à ce que les échantillons soient complètement secs. Pour la perméthylation, introduire d'abord le GSL dans un tube en verre à vis et garniture en téflon avec 150 microlitres de diméthylsulfoxyde, sans utiliser de conditions spéciales de séchage ni d'atmosphère inerte. Dans la hotte chimique, préparer de l'hydroxyde de sodium en poudre à partir de pastilles d'hydroxyde de sodium en les broyant dans un mortier chimique à l'aide d'un pilon. Ensuite, ajouter la poudre d'hydroxyde de sodium à la solution échantillon à l'aide d'une spatule.Ensuite, ajouter 80 microlitres de méthane IO à l’aide d’une seringue Hamilton de 100 microlitres. Agiter le mélange à température ambiante pendant une heure, puis arrêter la réaction de méthylation par l’ajout de deux millilitres d’eau, et extraire les produits perméthylés par l’ajout de deux millilitres de dichlorométhane. Les glycolipides se trouvent dans la phase de dichlorométhane, qui est la phase inférieure ; la phase supérieure peut donc être transférée dans un nouveau tube en verre.Les produits méthylés peuvent ensuite être extraits à nouveau par le chlorométhane, pour un total de trois extractions. Laver les extraits combinés de chlorométhane trois fois avec deux millilitres d'eau, en éliminant la phase aqueuse supérieure après chaque lavage. Après le dernier lavage, transférer les échantillons dans un nouveau tube et les sécher. À l'aide du speed vac, les échantillons peuvent ensuite être dissous dans 100 à 200 microlitres de méthanol pour une analyse en spectrométrie de masse réalisée comme décrit dans la procédure écrite. Les échantillons ont été soumis à la plateforme de protéomique du Centre du cancer MD Anderson de l'Université du Texas et analysés par un spectromètre de masse MALDI en tandem MS/MS ainsi que par un spectromètre de masse à piège ionique LTQ.On voit ici un exemple d'analyse par spectrométrie de masse MALDI des glycolipides « finger » provenant de la lignée cellulaire de leucémie de rat RBL, un type de cellule présentatrice d'antigène qui présente des antigènes glycolipidiques « finger » aux cellules NKT. Les ions peuvent être attribués à des structures spécifiques de glycolipides « finger » dans les cellules RBL traitées avec le médicament inhibant la synthèse des glycolipides « finger ». Une réduction significative de tous les glycolipides « finger » a été observée.Les isomères structuraux ne peuvent pas être distingués. La capacité msms du biosystème 4 700 appliqué permet la fragmentation des ions MS un en fragments MS deux, ce qui permet d'obtenir des informations structurales limitées. Toutefois, l'analyse MS deux n'est souvent pas suffisante pour discriminer les isomères d'oligosaccharides, tandis que l'analyse en spectrométrie de masse à ionisation par piège à ions des lipides glyco-finger permet l'étude des isomères d'oligosaccharides afin de détecter ces isomères.L'IGB trois et le GB trois standards ont été analysés par plusieurs cycles de fragmentation jusqu'à la détection de différences, comme illustré dans cette caractéristique. Un profil MS quatre des ions dérivés de l'IGB trois ou du GB trois peut être obtenu lorsque différents rapports d'IGB trois et de GB trois sont mélangés. Une courbe standard peut être établie en fonction de l'abondance ionique des ions caractéristiques dérivés de chaque isomère. Dans l'exemple présenté ici, l'IGB trois et le GB trois ont pu être discriminés par comparaison avec les standards.Ce spectre représente l'analyse MS4 de 1 3 2 5, le fer moléculaire représentant les ions caractéristiques des IMR de GB trois et d'IGB trois pour IGB trois et les ions caractéristiques de GB trois ont été détectés, suggérant la présence d'un mélange des deux isomères. Le rapport d'IGB trois à GB trois a été calculé par comparaison avec une courbe étalon. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de bien récupérer les glycolipides en totalité lors de la chromatographie avant la perméthylation des glycolipides.Veillez à récupérer au moins 80 microgrammes de glycolipides lors de la purification. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment analyser les glycolipides selon une méthode de spectrométrie de masse semi-quantitative. Vous maîtriserez les étapes clés de l'extraction des glycolipides, de leur séparation en fractions neutres et acides, de leur modification par réaction de perméthylation, ainsi que la soumission des glycolipides modifiés à votre plateforme de spectrométrie de masse.N'oubliez pas que le travail avec le dichloroéthane, le chloroforme, l'acide chloracétique et l'iodométhane peut être extrêmement dangereux en raison de leur caractère cancérogène, et que des précautions telles que le port de gants et d'une blouse de laboratoire doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure. Respectez les règles et profitez de votre découverte.

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Glycosylation métabolique de l’acide sialique à l’aide de N-acyl-modification Mannosamines

Un dosage de microarray de sialoglycane peut être utilisé pour évaluer les anticorps anti-Neu5Gc dans des sérums humains, ce qui en fait un test de diagnostic potentiel à haut débit pour le cancer et d'autres maladies chroniques à médiation par inflammation chronique.

Profilage anti-Neu5Gc IgG dans les sérums humains avec un dosage de microarray de sialoglycan

Ce protocole détaille la méthode de glycoprotéomique guidée par la glycomique, une technologie omique intégrée qui offre des informations complètes sur le glycoprotéome hétérogène dans les microenvironnements tumoraux complexes nécessaires pour mieux comprendre la glycobiologie des cancers.

La glycoprotéomique guidée par Glycomics facilite le profilage complet du glycoprotéome dans les microenvironnements tumoraux complexes 

Nous présentons ici un protocole détaillé pour la libération d’O-glycanes à partir des mucines, ainsi que le dessalage, la perméthylation et l’analyse ultérieurs à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF.

Profilage des O-glycanes de mucine perméthylée à l’aide de la spectrométrie de masse à temps de vol par désorption/ionisation laser assistée par matrice

Un protocole a été mis au point pour la préparation de mitochondries purifiées à partir de cellules microgliales, l’isolement de protéines mitochondriales pour la libération de N-glycanes et la détection rapide de glycanes mitochondriaux subcellulaires à l’aide d’une désorption laser assistée par une matrice infrarouge couplée à une spectrométrie de masse précise à haute résolution.

Préparation mitochondriale à partir de microglie pour l’analyse des glycanes

Ce protocole détaille les étapes clés permettant une mesure rigoureuse et reproductible des glycanes liés au glycogène et aux glycans liés à l’Atomogène grâce à l’imagerie par spectrométrie de masse.

Imagerie moléculaire spatiale du Glycome à l’aide de la spectrométrie de masse

Découvrez une méthode de spectrométrie de masse pour analyser les antigènes glycosphingolipides dans les cellules immunitaires. Cette technique sensible permet d'étudier l'expression lipidique et les biomarqueurs du cancer.

Spectrométrie de masse des antigènes glycosphingolipides

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