Name: La stimulation mécanique des chondrocytes-agarose hydrogels (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-27T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Découvrez la stimulation mécanique dynamique des chondrocytes encapsulés dans des hydrogels d'agarose à 2%. Cette méthode permet d'évaluer la synthèse du collagène et des protéoglycanes pour l'ingénierie tissulaire.

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1. Isolement des chondrocytes articulaires primaires Récolte 10-15 tranches complètes de cartilage épaisseur des surfaces articulaires des articulations des animaux (par exemple, l&#39;articulation métacarpo-phalangienne du squelette vaches matures obtenus à partir d&#39;un abattoir local). <ol><li> Tranches de cartilage dans un plat de Pétri de 100 mm et incuber dans 20 ml de protéase 0,5% de Ham F-12 (p / v) pendant 2 heures à 37 ° C. Rincer trois fois dans les médias Ham F-12 de la culture et incuber avec 20 ml de collagénase 0,15% A dans les médias Ham culture F-12 pendant la nuit à 37 ° C. </li><li> Filtrer la suspension de cellules à travers un filtre de 200 mesh écran dans un plat propre. Laver le filtre avec 5 ml de Ham F-12 et ajouter au plat. Transférer la suspension de cellules dans un tube de 50 ml conique. Laver la boîte de Pétri avec 10 ml de Ham F-12 et ajouter dans le tube conique. </li><li> Centrifuger le tube à 600-800 rcf pendant 6-8 min à température ambiante. </li><li> Aspirer le surnageant, en veillant à ne pas déranger ee culot de cellules et remettre en suspension dans 40 ml de milieu de culture de Ham F-12. </li><li> Centrifuger le tube à 600-800 rcf pendant 6-8 min. </li><li> Répétez les étapes 1,4 et 1,5 fois plus pour un total de 3 fois. Avant de centrifugation pour la troisième fois, reprendre le culot par une agitation et d&#39;obtenir une aliquote de 500 ul pour le comptage des cellules. </li><li> Compter les cellules viables en utilisant la méthode d&#39;exclusion du bleu trypan 9 avec un hématimètre et d&#39;un microscope optique inversé. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans un volume de Ham F-12 médias de doubler la densité de semis souhaitée (par exemple 20 x 10 6 cellules / ml pour une concentration finale de 10 x 10 6 cellules / ml après encapsulation). </li></ol> 2. Encapsulation Hydrogel chondrocytes agarose <ol><li> Heat 0,8 g autoclave de type VII agarose dans 20 ml de PBS 1x stérile (pH 7,4) sur une plaque chauffante réglée à 120 ° C jusqu&#39;à dissolution. Une fois dissous, baisser le feu à 60 ° C, des températures plus élevées will la viabilité des cellules. </li><li> Dans un tube conique de 50 ml, à fond mélanger des volumes égaux de la suspension de cellules avec le double de la concentration souhaitée de l&#39;agarose (par exemple une suspension de 4% d&#39;agarose d&#39;un hydrogel d&#39;agarose 2% finale). Eviter la formation de grosses bulles, car ils peuvent affecter la viabilité des cellules et de construire la fatigue. </li><li> Soigneusement aliquote de 10 ml du mélange chondrocytes agarose dans un plat de Pétri de diamètre 60 mm, tout en évitant la création de grosses bulles. </li><li> Laisser reposer pendant 30 min à température ambiante jusqu&#39;à gélifié. </li><li> Obtenir autant d&#39;échantillons d&#39;hydrogel chondrocytes agarose selon les besoins (en général 20-30) à l&#39;aide de 4 mm biopsie. </li><li> Mesurer et noter les dimensions physiques (diamètre et hauteur) d&#39;échantillons représentatifs à l&#39;aide d&#39;un micromètre. Constructions doit être d&#39;environ 5 mm de hauteur, rejeter tous les échantillons obtenus à partir d&#39;une région où la hauteur de la variance d&#39;échantillonnage est supérieure à 2%. </li><li> Transférer les échantillons dans un plat de 60 mm de Pétri frais et supplémentavec 10 ml de milieu complet (par exemple, 20% de sérum de veau foetal dans les médias Ham culture F-12 avec 20 mM d&#39;HEPES, 100 d&#39;acide ascorbique pg / ml, et les antibiotiques 2x / antimycotiques). </li></ol> 3. La stimulation mécanique et radiomarquage de chondrocytes-agarose hydrogels <ol><li> Autoclaver les composants métalliques de la plate-forme de compression. Stériliser les composants en plastique avec de l&#39;éthanol à 70% (la nuit) et de la lumière UV (pendant au moins 15 minutes). </li><li> Pour garder les constructions de tomber, en utilisant une pince, place 12 anneaux en plastique stériles de retenue (avec un diamètre intérieur plus grand que le diamètre construction) (n = 6, échantillons et contrôles) dans les puits d&#39;une plaque de culture de 24 puits. </li><li> En utilisant des pinces, transférer soigneusement les hydrogels chondrocytes-agarose de la boîte de Pétri à la plaque de 24 puits, la sécurisation chacun dans un anneau de retenue. </li><li> Transfert 400 pi de milieu complet (par exemple 20% de FBS dans les médias Ham culture F-12 avec 20 mM d&#39;HEPES, 100 pg / ml d&#39;acide ascorbique et2x antibiotiques antimycosiques /) pour chaque échantillon. </li><li> Monter la plate-forme de compression stérilisés (Figure 1) et fixer les plaques avec vis de réglage. Fixez la plate-forme de compression de la plaque de culture de 24 puits. </li><li> Relâchez et re-fixer les vis de réglage pour établir plateau-hydrogel de contact (zéro l&#39;état de contrainte). </li><li> Chargez la plate-forme de compression monté dans un interféromètre de Mach-1 Système de test micromécanique. Plate-forme sécurisée pour la phase verticale par goupille de positionnement et de verrouillage en place avec vis de réglage. Retirez le gabarit d&#39;espacement. </li><li> Appliquer une charge de compression dynamique à l&#39;amplitude désirée (p.ex. l&#39;amplitude de contrainte à 10% en fonction de la hauteur d&#39;origine des échantillons), la fréquence (par exemple, 1 Hz) et la durée ou le nombre de cycles (par exemple des intervalles de temps allant jusqu&#39;à 60 minutes). </li><li> À la fin de la stimulation mécanique, remplacer le gabarit d&#39;espacement, desserrer la vis goupille de positionnement et en retirer l&#39;appareil de compression et plaque de culture de la Mach-1 Système de test micromécanique. </li&gt; <li> Radiomarqueur cellules d&#39;hydrogel constructions en complétant les médias avec 5 pCi de l&#39;isotope désiré (par exemple [3 H]-proline étiquette protéines pour la synthèse du collagène chondrocyte spécifique et [35 S]-soufre pour la synthèse de protéoglycanes). </li><li> Incuber les constructions radiomarqués pour 24 heures à 37 ° C, 5% CO 2 10. </li><li> Récolter les constructions d&#39;hydrogel radiomarqués et rincer 3 fois dans du PBS 1X (pH 7,4) pour éliminer toute isotope non constituée en société. Digérer les échantillons en utilisant la papaïne (40 pg / ml dans 20 mM d&#39;acétate d&#39;ammonium, 1 mM d&#39;acide ethyldiaminetetraacetic et 2 mM de dithiothréitol à 65 ° C pendant 72 heures). </li><li> Essai Digest pour la teneur en ADN en utilisant le test PicoGreen colorant 11 et l&#39;activité des isotopes incorporé, normalisée par rapport à la teneur en ADN, en β-scintillation liquide compter 12,13 digestion par la papaïne qui suit immédiatement. </li></ol> Remarque: L&#39;achat et l&#39;élimination des matières radioactives (isotopes de déchets et des articlesqui ont pu entrer en contact avec des matières radioactives) doit suivre les dispositions institutionnelles pertinentes (et / ou gouvernementale) des politiques et procédures pour la manipulation et l&#39;élimination des substances radioactives. 4. Les résultats représentatifs Chondrocytes articulaires bovins-agarose constructions hydrogels (2% d&#39;agarose à 10 x 10 6 cellules / ml de cellules encapsulées) ont été stimulées mécaniquement à une amplitude de la contrainte de compression de 10% à une fréquence de 1 Hz pendant 20 à 60 min (1.200 à 3.600 ou cycles ) et analysés pour leur teneur d&#39;ADN et de synthèse de la matrice extracellulaire par incorporation de radio-isotopes. ADN et la synthèse de la matrice extracellulaire a été touchée d&#39;une manière dose-dépendante. La teneur en ADN a montré une diminution significative de 35% en raison de 20 ou 30 minutes de stimulation (p &lt;0,01), alors que 60 min de stimulation montré aucun effet (Figure 2). Cartilage spécifique synthèse du collagène et des protéoglycanes (déterminée par la [3 H]-proline et[35 S]-soufre constitution, respectivement) a montré une augmentation significative d&#39;environ 60% en réponse à 20 ou 30 minutes de stimulation (p &lt;0,01), avec 60 minutes de stimulation présentant aucun effet observable (Figure 3). <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig1.jpg" alt="Figure 1" /> . Figure 1 Schéma de l&#39;appareil de mesure intégré compression dynamique pour stimuler chondrocytes agarose constructions gauche:. Banc assemblé droite:. Vue éclatée montrant les composants individuels. <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Changements Figure 2. Teneur en ADN des chondrocytes stimulés mécaniquement hydrogels d&#39;agarose sous une amplitude de déformation à la compression de 10% à 1 Hz pendant 20 à 60 min (moyenne ± SEM, n = 6/groupe). Changements Figure 3. Dans la synthèse de la matrice extracellulaire (collagène et de protéoglycanes) de chondrocytes stimulés mécaniquement hydrogels d&#39;agarose sous amplitude de déformation à la compression de 10% à 1 Hz pendant 20 à 60 min (moyenne ± SEM, n = 6/groupe).

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<li>Chowdhury, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+regulation+of+chondrocyte+metabolism+in+agarose+constructs+subjected+to+dynamic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

<html> La méthode décrite pour appliquer des stimuli mécaniques contrôlées à la cellule tête de série agarose hydrogels permet d&#39;enquêter directement sur les effets des dynamiques des forces de compression sur le métabolisme des chondrocytes. L&#39;utilisation de la plate-forme de mesure de test en même temps que les bagues de retenue prévu contrainte latérale pour les constructions d&#39;éviter d&#39;éventuels problèmes de basculement échantillon. L&#39;utilisation de plateaux de chargement morts pondérés fixés par ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Le nom du réactif ou de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Ham F-12 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SH3001002 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase A </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> C0130 </td><td></td></tr><tr><td> Protéase </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> F1051 </td><td></td></tr><tr><td> Ascorbate </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A4034 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotiques / antifongiques </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A5955 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshop Canada Ltd </td><td> HEP001 </td><td></td></tr><tr><td> Bleu trypan </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> 93595 </td><td></td></tr><tr><td> Reichert Bright-ligne Hémacytomètre </td><td> Hausser scientifique </td><td> 1490 </td><td></td></tr><tr><td> Quant-iT PicoGreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7589 </td><td></td></tr><tr><td> La papaïne extraite de la papaye latex </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> P3125 </td><td></td></tr><tr><td> Acétate d&#39;ammonium </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A1542 </td><td></td></tr><tr><td> Acide Ethyldiaminetetraacetic </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> DL-dithiothréitol </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> 43819 </td><td></td></tr><tr><td> Faible point de fusion d&#39;agarose, de type VII </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A9045 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Moustiquaire (200) Filtre </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> S4145 </td><td></td></tr><tr><td> Mach-1 Testeur micromécanique </td><td> Biomomentum Inc </td><td> V500cs </td><td></td></tr><tr><td> Chargement de compression Jig </td><td> Fabriqués sur mesure </td><td></td><td> Produit similaire pourrait être fourni par Biomomentum Inc </td></tr><tr><td> Falcon 24 Plaque Culture Bien </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> B353047 </td><td></td></tr><tr><td> compteur à scintillation β-liquide </td><td> Beckman Coulter </td><td> LS6500 </td><td></td></tr><tr><td> [3H] proline </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NET323005MC </td><td></td></tr><tr><td> [35S] Soufre </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NEX041005MC </td><td></td></tr></tbody></table>

la stimulation mécanique des chondrocytes-agarose hydrogels

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Le cartilage articulaire souffre d&#39;une capacité limitée de réparation lorsqu&#39;il a été endommagé par l&#39;insulte mécanique ou dégradés par la maladie, comme l&#39;arthrose. Pour remédier à cette lacune, plusieurs interventions médicales ont été développées. Une de ces méthodes consiste à resurfacer la zone endommagée avec génie tissulaire du cartilage, mais l&#39;ingénierie tissulaire n&#39;a généralement les propriétés biochimiques et la durabilité du cartilage natif, remettant en question sa survie à long terme. Cela limite l&#39;application de l&#39;ingénierie tissulaire du cartilage à la réparation de petits défauts de coordination, en s&#39;appuyant sur les tissus environnants pour protéger le matériau implanté. Pour améliorer les propriétés du tissu développé, la stimulation mécanique est une méthode courante utilisée pour augmenter la synthèse de la matrice extracellulaire du cartilage ainsi que les propriétés mécaniques résultantes de l&#39;ingénierie tissulaire. La stimulation mécanique applique des forces sur le tissu construit analogue à ceux rencontrés in vivo. Cetteest basé sur la prémisse que l&#39;environnement mécanique, en partie, de réglementer le développement et la maintenance de 1,2 tissu natif. La forme la plus couramment utilisée dans la stimulation mécanique de l&#39;ingénierie des tissus cartilagineux est la compression dynamique des déformations physiologiques de l&#39;ordre de 5-20% à une fréquence de 1 Hz 1,3. Plusieurs études ont examiné les effets de la compression dynamique et ont montré qu&#39;elle ait un effet positif sur le métabolisme des chondrocytes et la biosynthèse, en influant finalement sur ​​les propriétés fonctionnelles de l&#39;4-8 tissu développé. Dans cet article, nous illustrons la méthode pour stimuler mécaniquement les constructions d&#39;hydrogel chondrocytes agarose sous compression dynamique et analyser les changements dans la biosynthèse par des dosages biochimiques et radio-isotope. Cette méthode peut également être facilement modifié pour évaluer les changements potentiellement induits dans la réponse cellulaire à la suite de stimuli mécaniques.

La biosynthèse de la matrice extracellulaire du cartilage par les chondrocytes peuvent être affectés par l&#39;application de stimuli mécaniques. Cette méthode décrit la technique d&#39;application dynamiques contraintes de compression de chondrocytes encapsulés dans des constructions 3D et l&#39;évaluation des changements induits dans le métabolisme des chondrocytes.

La stimulation mécanique des chondrocytes-agarose hydrogels

Le cartilage articulaire présente une capacité de réparation limitée lorsqu'il est endommagé par un traumatisme mécanique ou dégradé par une pathologie, telle que l'arthrose. Pour remédier à...

L'objectif général de cette procédure est d'appliquer un chargement compressif mécanique dynamique à des hydrogels ensemencés de cellules. Pour ce faire, des cellules primaires sont obtenues par dissection et digestion enzymatique de tranches de cartilage. Les cellules isolées sont encapsulées dans un hydrogel à 2 % agros, et des constructions ensemencées de cellules sont créées à l'aide d'un punch biopsique.Les échantillons sont ensuite placés dans le dispositif de chargement compressif et chargés dans un stimulateur micro-mécanique mach one. Un chargement compressif dynamique est ensuite appliqué aux constructions ensemencées de cellules afin d'évaluer la synthèse de collagène et de protéoglycanes. Les constructions sont marquées radioactivement après incubation incorporée.Les isotopes sont quantifiés par comptage en scintillation des données obtenues, lesquelles sont normalisées par rapport à l'ADN. Le contenu montre des modifications de la synthèse de la matrice extracellulaire suite à une stimulation mécanique. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la réponse du site opposé et la stimulation mécanique.Il peut également être appliqué à d'autres systèmes tels que les cellules souches, d'autres tissus conjonctifs ou des cellules mécanoréceptrices. Les articulations métacarpo-phalangiennes provenant de vaches adultes sur le plan squelettique, utilisées ici, ont été obtenues auprès d'un abattoir local, en travaillant dans une zone de dissection stérile. Dans une hotte à flux laminaire, placer les tranches de cartilage dans une boîte de Pétri de 100 millimètres de diamètre contenant 20 millilitres de milieu Ham's F12 additionné de 0,5 % de protéase, puis incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius.Après l'incubation sous vide, aspirez la solution de protéase et rincez les tranches en ajoutant doucement le milieu de culture Hams F12 en agitant légèrement, puis aspirez. Répétez ce lavage deux fois de plus ; après le troisième lavage, aspirez sous vide le milieu de culture.Ajoutez 20 millilitres de Hams F12 contenant 0,15 % de collagénase A et incubez les boîtes toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, aspirez la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette à travers un filtre tamis de 200 mailles vers une boîte de Pétri propre ; pour rincer le filtre, ajoutez cinq millilitres supplémentaires de Hams F12 en recueillant le filtrat dans la même boîte. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres.Lavez la boîte de Pétri avec 10 millilitres de Hams F12. Ajoutez ensuite la solution de lavage au tube conique. Centrifugez le tube à 600-800 RCF pendant six à huit minutes à température ambiante.Une fois la centrifugation terminée, aspirez le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot cellulaire. Resuspendez le culot dans 40 millilitres de milieu de culture. Centrifugez le tube à 600 à 800 RCF pendant six à huit minutes.Répétez l'aspiration, la resuspension et la centrifugation deux fois supplémentaires, pour un total de trois centrifugations avant la troisième rotation. Resusp. Suspendez le culot par agitation et prélevez un aliquot de 500 microlitres pour le décompte cellulaire. Lors de la troisième centrifugation, utilisez un hémocytomètre et un microscope inversé à lumière visible pour dénombrer les cellules viables dans l'aliquot par exclusion au bleu de trypan.Une fois le nombre de cellules déterminé et après la troisième centrifugation, aspirez le surnageant et resuspendez. Suspendez le culot dans un volume de milieu de culture double de la densité d'ensemencement souhaitée. Ici, les chondrocytes sont resuspendus à une concentration de 20 fois 10 à la puissance 6 cellules par millilitre.L'étape suivante de la procédure consiste à encapsuler les chondrocytes articulaires primaires isolés dans un hydrogel d'aros. Dans un bécher, suspendez 0,8 gramme d'aros dans 20 millilitres de PBS stérile. Placez le bécher sur un agitateur chauffant réglé à 120 degrés Celsius dès que l'aros est dissous.Réduire la température à 60 degrés Celsius dans un tube conique de 50 millilitres. Combiner des volumes égaux de suspension cellulaire avec une solution d'agaroase chauffée à deux fois la concentration souhaitée. Ici, cinq millilitres de suspension cellulaire sont ajoutés à cinq millilitres de suspension d'agaroase à 4 % pour obtenir un mélange final d'hydrogel à 2 %, en mélangeant soigneusement à l’aide d’une pipette tout en évitant la formation de grosses bulles, qui pourraient affecter la viabilité cellulaire.Ensuite, verser soigneusement 10 millilitres du mélange d'agros de chondrocytes dans une boîte de Petri de 60 millimètres de diamètre. Veiller à nouveau à éviter la formation de grosses bulles. Couvrir la boîte avec son couvercle.Ensuite, laissez le mélange reposer pendant 30 minutes à température ambiante. Une fois le mélange solidifié, utilisez un poinçon de biopsie de quatre millimètres pour obtenir autant d'échantillons d'hydrogel d'agrogels de chondrocytes que possible. Généralement, cela correspond à 20 à 30 échantillons.Placez les échantillons dans une boîte de Pétri propre à l’aide d’un micromètre et enregistrez le diamètre et la hauteur de chaque échantillon. Idéalement, le prélèvement doit avoir une hauteur d’environ cinq millimètres ; écartez tous les échantillons provenant d’une région où la hauteur excède de plus de 2 %. Transférez les échantillons vers une nouvelle boîte de Pétri de 60 millimètres contenant 10 millimètres de milieu complet. Dans cette étape du protocole, les prélèvements cellulaires seront stimulés mécaniquement par compression dynamique.Cela sera réalisé à l'aide d'un dispositif de compression conçu sur mesure, qui couple mécaniquement le chargement des PLA du montage à un système micro-mécanique simulé, contrôlant ainsi la quantité de compression appliquée aux montages. L'aspect le plus délicat de la procédure consiste à charger les échantillons dans le dispositif de compression. Il est essentiel d'ajuster correctement les plaques du dispositif afin de garantir une application adéquate d'un chargement compressif dynamique.Avant utilisation, stériliser les composants métalliques du dispositif de compression dans un autoclave. Stériliser les composants en plastique avec de l’éthanol à 70 % pendant une nuit et sous lumière UV pendant au moins 15 minutes. Pour empêcher les hydrogels contenant les chondrocytes de tomber.Utilisez une pince pour placer 12 anneaux de rétention en plastique stériles dans les puits d'une plaque de culture de 24 puits. Les diamètres intérieurs des anneaux de rétention doivent être plus grands que les diamètres des assemblages. Manipulez soigneusement à l'aide d'une pince.Transférez les hydrogels chondro aros de la boîte de Pétri à la plaque 24 puits en fixant chacun dans un anneau de rétention. Ajoutez 400 microlitres de milieu complet à chaque échantillon. Ensuite, assemblez le dispositif de compression stérilisé et, à l’aide de vis de réglage, fixez les PLA.Fixer le dispositif de compression sur la plaque de culture à 24 puits afin d'établir la libération du contact de l'hydrogel et de le réattacher. La déformation imposée par les vis de réglage sera appliquée à cet état de référence non chargé, ou état de déformation nulle. Charger le dispositif de compression assemblé dans un système d'essai mécanique micro Mécan un à l'aide de la goupille de positionnement.Fixez le dispositif sur la platine verticale, puis à l’aide d’une vis de blocage, verrouillez-le en place. Retirez le gabarit d’espacement. Utilisez l’interface logicielle Mach one pour régler la fréquence à un hertz, l’amplitude à 350 microns et le nombre de cycles à 1 200.Ceci applique une charge compressive dynamique avec une amplitude de déformation de 10 % par rapport à la hauteur initiale des échantillons. Pour commencer la stimulation mécanique, appuyez sur le bouton de démarrage, l'actuateur mach one. Le dispositif de chargement fixé à la plaque de culture comporte six indentations qui se déplacent vers le haut et vers le bas, stimulant ainsi six échantillons simultanément.Les échantillons témoins non stimulés se trouvent également dans la même plaque de culture, mais ne sont pas placés dans les puits présentant les indentations. Lorsque l'essai est terminé, la machine émettra un signal sonore et l'actionneur passera à l'état de référence sans charge. Une fois la stimulation mécanique terminée, remplacez le gabarit d'espacement.Desserrez la vis de blocage du manchon de positionnement et retirez le dispositif de compression ainsi que la plaque de culture du système d'essai. À côté de l'étiquette radioactive, pipetez dans chaque puits cinq microcuries de prolène protéique marqué au tritium pour la synthèse spécifique du collagène par les chondrocytes et du soufre 35 pour la synthèse des protéoglycanes. Incubez les constructions marquées radioactives pendant 24 heures à 37 degrés Celsius, sous 5 % de dioxyde de carbone, afin de récolter les constructions d'hydrogel marquées radioactivement. À l’aide de pinces, rincez chaque construction d’hydrogel trois fois par immersion dans du PBS afin d’éliminer tout isotope non incorporé, puis placez la construction rincée dans un tube de 1,5 millilitre.Ensuite, ajoutez 500 microlitres de solution pape dans des tubes de 1,5 millilitre. Placez-les sur un bloc chauffant et laissez-les digérer à 65 degrés Celsius pendant 72 heures. Une fois la digestion terminée, l'échantillon doit apparaître relativement clair.Immédiatement après la digestion par la protéinase K, prélevez des aliquotes de 100 microlitres de chaque échantillon pour déterminer la teneur en ADN à l’aide du test Pico Green D. Ensuite, prélevez une aliquote de 100 microlitres de chaque échantillon pour déterminer l’activité isotopique incorporée par comptage scintillation liquide bêta. L’activité isotopique obtenue doit ensuite être normalisée par rapport à la teneur en ADN pour l’analyse.Des constructions en hydrogel à base de chondrocytes articulaires bovins encapsulés dans de l’aros à 2 %, avec une concentration de 10 fois 10 à la puissance 6 cellules par millilitre, ont été stimulées mécaniquement selon une amplitude de 10 % de déformation compressive et une fréquence de un hertz, pendant une durée de 20 à 60 minutes, soit 1 200 à 3 600 cycles. Elles ont ensuite été analysées pour leur teneur en ADN et leur synthèse de matrice extracellulaire par incorporation d’isotopes radioactifs.Comme on peut le voir ici, la synthèse de l'ADN et de la matrice extracellulaire a été affectée de manière dépendante de la dose. La teneur en ADN a montré une diminution significative de 35 % suite à une stimulation de 20 ou 30 minutes, avec une valeur p inférieure à 0,01 ; une stimulation de 60 minutes n'a montré aucun effet. La synthèse du collagène et des protéoglycanes spécifiques au cartilage a été déterminée respectivement par l'incorporation de tritium, de proline et de soufre 35S.Ces échantillons ont présenté des augmentations significatives d’environ 60 % en réponse à une stimulation de 20 ou 30 minutes, avec une valeur p inférieure à 0,01 ; une stimulation de 60 minutes n’a pas produit d’effet observable. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment stimuler mécaniquement des cultures en hydrogel à l’aide d’une empreinte dynamique, ainsi que savoir adapter ce protocole à des applications similaires.

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