Name: Extraction des antigènes tissulaires de tests fonctionnels (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Découvrez une méthode d'extraction d'antigènes tissulaires pour les tests fonctionnels des lymphocytes T humains. Cette technique sans solvants toxiques permet de mesurer précisément la prolifération et la sécrétion de cytokines.

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Ce travail est soutenu par des subventions de l&#39;Australian National de Santé et Medical Research Council (NHMRC # 559007) et la Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) et le Programme d&#39;infrastructure opérationnelle du gouvernement de Victoria. Nous remercions les membres du Tom Mandel Islet programme de l&#39;équipe de transplantation d&#39;isolement des îlots de fournir les tissus humains. Tissus humains ont été recueillis et utilisés avec l&#39;approbation éthique local (Hôpital Saint-Vincent-de-HREC A 011/04 et de santé St. Vincent HREC-A 135/08).

1. Préparation de tissu de la rate <ol><li> Remarque-tout le matériel humain doit être traité comme potentiellement infectieux et toutes les procédures doivent être menées dans un cabinet à flux laminaire de classe II. Avec des ciseaux et des pinces stériles, retirer les tissus adipeux et fibreux issus de sections rate (~ 1-2 cm) et coupez autant de matériel que possible capsule externe. </li><li> Coupez un petit morceau (1-2 cm 3) de tissu de la rate et placer chaque morceau dans un tube stérile Falcon de 50 ml. </li><li> Snap-congeler les morceaux de tissu par immersion dans l&#39;azote liquide 2. </li><li> Conserver à -80 ° C. Un protocole analogue est adapté à un autre tissu (s). </li></ol> 2. Préparation Islet humaines pour le stockage <ol><li> Îlots de culture dans les médias cmLC. Recueillir des îlots dans un tube de 10 ml à fond conique et laver deux fois dans du PBS par centrifugation à 1500 rpm pendant 5 min. Verser le PBS et vider le tampon résiduel en plaçant le tube inversé brièvement sur une serviette en papier. Veillez à ne paspour déloger les îlots. </li><li> Une fois égoutté, replacez le capuchon du tube et snap-gel dans de l&#39;azote liquide et conserver à -80 ° C. </li></ol> 3. Préparation Extrait <ol><li> Préparer BAW mélange (10:30:60% v / v) et conserver à 4 ° C. </li><li> Retirer le tube de -80 ° C. Décongeler à température ambiante. </li><li> Ajouter suffisamment glacée BAW à couvrir la pièce de tissu. Pour utiliser îlots 3-5 ml. Pour tissu de la rate utiliser 10-20 ml en fonction de la taille de la pièce de tissu. </li><li> Assemblez l&#39;homogénéisateur tissulaire. Nettoyer par «homogénéisation» 10-20 ml d&#39;éthanol à 70% / eau. </li><li> Homogénéiser le tissu en salves multiples, après avoir placé la sonde dans le tube homogénéisateur avec le tissu et la solution BAW. Garder le tube dans un seau à glace par la suite. </li><li> Nettoyer soigneusement l&#39;homogénéisateur entre les échantillons, en homogénéisant 10-20 ml d&#39;éthanol à 70% / eau, puis tampon BAW. Cela permet d&#39;éviter la contamination croisée du tissu entre samples.Dismantleand propre avec 70% d&#39;éthanol / eau après nouse. </li><li> Si un extrait contenant uniquement des matières solubles est nécessaire, centrifuger l&#39;extrait de tissu homogénéisé à 4.000 tours par minute à température ambiante pendant 10 min. Si un extrait brut est plus nécessaire, tourner à 1000 tours par minute à température ambiante pendant 5 min. La technique la plus appropriée pour l&#39;extraction des protéines insolubles dans l&#39;BAW dépend de l&#39;analyse des protéines en aval. Pour une utilisation dans des dosages immunologiques fonctionnels nous vous suggérons de tenter de dissoudre la fraction insoluble dans l&#39;urée 8 M comme nous l&#39;avons déjà constaté que cela soit bien toléré 6. </li><li> Transférer le surnageant dans un tube propre et le mettre sur la glace. </li><li> Déterminer la concentration de protéines dans l&#39;extrait en utilisant un dosage BCA ou similaire. </li></ol> 4. Congelez Extraits de séchage <ol><li> En fonction de la masse de la protéine souhaitée (par exemple, 100 mg par tube), diluer l&#39;homogénat en conséquence et distribuer des aliquotes dans étiqueté stérile 5,0 ml, Falcon (12x75 mm) des tubes. Nous utilisons fréquemment 100 pg / tube. </li><li> Utilisez un 18-20 aiguille de seringue stérile de calibre pour faire 3 trous dans le couvercle de chaque tube. </li><li> Geler les tubes soit en les plaçant sur de la glace sèche pendant environ 10 min ou dans un congélateur à -80 ° C pendant&gt; 1 heure. Conserver à -80 ° C jusqu&#39;au moment de mettre sur le lyophilisateur. </li><li> Allumez le lyophilisateur et ramener la température (-100 ° C). Cela prend environ 30 minutes. </li><li> Selon le volume, la lyophilisation peut être accompli dans les 3 heures, mais nous avons l&#39;habitude laisser nos échantillons durant la nuit. </li><li> Après la fin du cycle de séchage, éteindre la pompe à vide et permettre lentement la pression dans la chambre. Enlever la grille. </li><li> Dans une hotte stérile, enlever les bouchons des tubes perforés et les remplacer par des piles neuves (Falcon 352 032). </li><li> Conserver les tubes à -20 ° C. Les échantillons peuvent être reconstitués dans des milieux de culture, ou des tampons d&#39;autres, et utilisés en fonction ou des essais biochimiques. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs La figure 1 montre la coloration d&#39;une protéinegel chargé avec de l&#39;extrait de la rate et du tissu des îlots pancréatiques appauvri (étiqueté acineuse) et purifié îlots humains (îlots étiquetés). Les résultats montrent une bonne représentation de protéines de poids moléculaire différent pour chaque tissu. La capacité de stimuler les extraits de tissus humains prolifération des cellules T a été testée en utilisant un test de prolifération CFSE base 7 (figure 2). Les PBMC utilisé dans cet essai ont été isolés à partir d&#39;une personne avec diabète de type 1. L&#39;ampleur de la réaction est exprimée comme un rapport entre le nombre de cellules CFSE sombres pour 5000 cellules CD4 + CFSE, lumineux sans antigène: des cellules CFSE sombres pour 5000 CD4 +, des cellules CFSE lumineuses avec un antigène provenant d&#39;échantillons en triple 7. Les résultats montrent une faible, mais détectable, en réponse à la prolifération des cellules acineuses (CD1 = 3,5) et une plus forte réponse à l&#39;extrait îlot (6,8). Virus de la grippe inactivé (CDI = 142,6) est inclus en tant quecontrôle positif. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig1.jpg" /> Figure 1. Gel de protéines. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig2.jpg" /> Résultats Figure 2. D&#39;un test de prolifération CFSE à base de contre acineuses et extrait îlot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4230/4230fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

<ol><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li>
<li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+CD4%2B+T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4%2B+T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li>
<li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy%2C+Pre-diabetic%2C+and+Diabetic+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li>
<li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li>
<li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+preparations+of+GAD65%2C+proinsulin%2C+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes%3A+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li>
<li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Ce protocole a été développé parce que nous voulions produire un extrait de tissu humain qui est exempt de produits chimiques toxiques tels que les détergents. Plus précisément, nous avons utilisé pour préparer des extraits de tissus humains qui peuvent être utilisés dans des tests de la fonction immunitaire humain in vitro. Les extraits préparés en utilisant ce protocole peut également être reconstitué dans une solution tampon et utilisé pour de nombreuses analyses biochimiques, telles que la chromato...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 5 ml 12 x 75 mm tubes en polystyrène stériles </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> Bouchons pour tubes tubes en polystyrène (ci-dessus) </td><td> BD Falcon </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ml tubes stériles </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Acétonitrile </td><td> Produits chimiques Mallinckradt </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-ol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> Homogénéisateur: PRO200 </td><td> Bio-stratégie </td><td> 01-01200 </td><td> 10 x 115 mm en dents de scie générateur </td></tr><tr><td> Lyophiliseur </td><td></td><td></td><td> Virtis, de laboratoire 4K </td></tr><tr><td> Aiguille stérile de calibre 18-20 </td><td> Becton Dickinson </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 Medium </td><td> Sigma </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Réactifs et équipements spécifiques.

extraction des antigènes tissulaires de tests fonctionnels

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

La plupart des antigènes cibles de la réponse immunitaire adaptative, reconnus par les cellules B et T, n&#39;ont pas été définis 1. Cela est particulièrement vrai dans les maladies auto-immunes et le cancer 2. Notre objectif est d&#39;étudier les antigènes reconnus par les lymphocytes T humains dans le type 1, diabète maladie auto-immune 1,3,4,5. Pour analyser des cellules T humaines réponses contre les tissus où les antigènes reconnus par les lymphocytes T ne sont pas identifiés, nous avons développé une méthode pour extraire les antigènes protéiques de tissus humains dans un format qui est compatible avec les analyses fonctionnelles 6. Réponses précédemment, des cellules T à des extraits de tissus non purifiés n&#39;a pas pu être mesurée, car les méthodes d&#39;extraction donner un lysat contenant des détergents qui étaient toxiques pour les cellules mononucléées du sang périphérique. Ici, nous décrivons un protocole d&#39;extraction de protéines à partir de tissus humains dans un format qui n&#39;est pas toxique pour les cellules T humaines. Le tissu est homogénéisé dans un mélange de butan-1-ol, l&#39;acétonitrile et water (BAW). La concentration en protéines dans l&#39;extrait de tissu est mesurée et une masse connue de protéine est mise dans des tubes. Après extraction, les solvants organiques sont éliminés par lyophilisation. Extraits de tissus lyophilisés peuvent être conservés jusqu&#39;à leur utilisation. Pour une utilisation dans des tests de la fonction immunitaire, une suspension de cellules du système immunitaire, dans les milieux de culture appropriés, peuvent être ajoutés directement à l&#39;extrait lyophilisé. La production de cytokines et la prolifération des PBMC par, en réponse à des extraits préparés en utilisant cette méthode, ont été faciles à mesurer. Par conséquent, notre méthode permet la préparation rapide des lysats de tissus humains qui peuvent être utilisés comme source d&#39;antigènes dans l&#39;analyse des réponses des cellules T. Nous suggérons que cette méthode va faciliter l&#39;analyse des réponses immunitaires adaptatives des tissus de greffe, le cancer et l&#39;auto-immunité.

Un protocole simple de préparation d&#39;extraits de tissus humains pour être utilisées comme source d&#39;antigènes à des cellules T fonctionnelles des essais est décrit. Cette méthode permet réponses des cellules T à des antigènes dérivés de tissus à mesurer<em&gt; In vitro</em&gt;.

Extraction des antigènes tissulaires de tests fonctionnels

De nombreuses cibles antigéniques de la réponse immunitaire adaptative, reconnues par les lymphocytes B et T, n'ont pas été définies 1. C'est particulièrement vrai dans les maladies auto-immunes...

L'objectif général de cette procédure est de préparer un extrait tissulaire compatible avec des tests immunologiques fonctionnels. Pour ce faire, commencez par prélever un échantillon du tissu d'intérêt. Ensuite, homogénéisez l'échantillon de tissu dans un mélange de butanol, d'acétonitrile et d'eau, ou BAW.Après avoir déterminé la concentration en protéines, l'extrait est réparti et lyophilisé pour éliminer les solvants. Enfin, l'extrait reconstitué est utilisé comme source d'antigène dans des tests de prolifération des lymphocytes T humains ou de sécrétion de cytokines. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la lyse par détergent, est que l'extrait du désert ne contient ni solvants ni détergents toxiques.Dans ce protocole, tous les échantillons humains doivent être manipulés comme potentiellement infectieux, et toutes les procédures doivent être réalisées dans une hotte à flux laminaire de classe deux. À l’aide de ciseaux et de pinces stériles, retirer les tissus adipeux et fibreux des sections de rate d’environ un à deux centimètres de taille. Enlever autant que possible le tissu de la capsule externe.Prélevez de petits morceaux de tissu splénique et placez chaque morceau dans un tube stérile Falcon de 50 millilitres. Congelez les morceaux de tissu par immersion dans de l'azote liquide et conservez-les à moins 80 degrés Celsius. Pour commencer la procédure de préparation des boutons oculaires humains pour la culture de conservation.Incuber les œillets dans le milieu CMRL à 37 degrés Celsius. Recueillir les œillets dans un tube conique de 10 millilitres et centrifuger à 1 500 tr/min pendant cinq minutes. Jeter le milieu et laver deux fois avec du PBS après le deuxième lavage.Versez délicatement le PBS et éliminez le tampon résiduel en plaçant brièvement le tube retourné sur une serviette en papier. Veillez à ne pas déloger les œillets. Une fois le tampon éliminé, refermez le tube, congélez-le rapidement dans l'azote liquide et conservez-le à moins 80 degrés Celsius.Pour préparer un extrait tissulaire, commencez par sortir un tube contenant le tissu de l'incubateur à moins 80 degrés Celsius et laissez-le atteindre la température ambiante. Le tissu sera homogénéisé dans un mélange de butanol, d'acétonitrile et d'eau, ou BAW, préalablement préparé et conservé à quatre degrés Celsius. Ajoutez suffisamment de BAW glacé pour recouvrir le morceau de tissu ; pour le tissu splénique utilisé dans cette démonstration, utilisez entre 10 et 20 millilitres de BAW.Assemblez l'homogénéisateur de tissus. Nettoyez l'homogénéisateur en homogénéisant 20 millilitres d'éthanol à 70 % dans l'eau. Ensuite, placez la sonde de l'homogénéisateur dans le tube contenant le tissu et la solution BAW, puis homogénéisez le tissu en plusieurs impulsions.Gardez le tube dans un bon récipient par la suite afin d'éviter la contamination croisée des tissus entre les échantillons. Nettoyez soigneusement l'homogénéisateur entre chaque échantillon en homogénéisant de 10 à 20 millilitres d'éthanol à 70 % dans l'eau, suivi d'une centrifugation avec le tampon BAW. L'extrait de tissu homogénéisé est conservé à température ambiante.Si un extrait contenant uniquement du matériel soluble est requis, centrifuger à 4 000 tr/min pendant 10 minutes. Si un extrait plus brut est requis, centrifuger à 1 000 tr/min pendant cinq minutes après la centrifugation, transférer le surnageant dans un tube propre et le placer sur de la glace. La concentration en protéines dans l'extrait est ensuite déterminée à l'aide d'un dosage BCA ou similaire.La étape la plus importante de ce protocole consiste à mesurer avec précision la concentration en protéines dans l'extrait afin de pouvoir lyophiliser un volume approprié de l'extrait. Pour obtenir la masse souhaitée de protéines, diluez d'abord l'homogénat selon la quantité massive de protéines requise et répartissez des aliquotes dans des tubes stériles de cinq millilitres étiquetés. Dans cet exemple, 100 microgrammes de protéines sont attribués par tube.À l’aide d’une aiguille stérile de 18 à 20 gauge, faites trois trous dans le bouchon de chaque tube. Placez les tubes sur de la glace sèche pendant environ 10 minutes pour les congeler. Mettez en marche le lyophilisateur et laissez-le atteindre un équilibre à moins 100 degrés Celsius, ce qui prend environ 30 minutes. Lorsque le lyophilisateur est prêt, insérez les tubes dans l’appareil et mettez en marche la pompe à vide.En fonction du volume d'extrait, la lyophilisation peut être terminée en moins de trois heures. Bien que les échantillons soient habituellement laissés toute la nuit. Une fois le cycle de séchage terminé, éteignez la pompe à vide et laissez lentement la pression revenir dans la chambre.Retirer la grille de tubes dans une hotte stérile. Retirer les bouchons perforés des tubes et les remplacer par de nouveaux bouchons. Conserver les tubes à moins 20 degrés Celsius.Les échantillons peuvent ensuite être reconstitués en culture, dans des milieux ou d'autres tampons, et utilisés en fonction des dosages biochimiques. Cette figure montre la coloration d'un gel protéique chargé avec des extraits de tissu pancréatique appauvri en îlots spléniques et des îlots humains purifiés. Ces résultats montrent une bonne représentation des protéines de différents poids moléculaires pour chaque tissu ; la capacité des extraits d'asana et d'îlots à stimuler la prolifération des lymphocytes T humains a été testée à l'aide d'un dosage de prolifération, dans lequel des cellules mononucléées du sang périphérique, ou PBMC, ont été marquées avec le colorant fluorescent CFSE. Les cellules ayant proliféré en réponse à l'antigène, entraînant une réduction de l'intensité du CFSE, ont été mesurées directement par cytométrie en flux.Les PBMC utilisées dans cet exemple ont été isolées à partir d'un individu atteint de diabète de type 1. L'ampleur de la réponse des cellules T a été exprimée sous forme de rapport entre le nombre de cellules CFSE faibles par 5 000 cellules CD4 positives et CFSE fortes sans antigène et le nombre de cellules CFSE faibles par 5 000 cellules CD4 positives et CFSE fortes avec antigène, à partir d'échantillons triplicates. Les résultats montrent une prolifération faible mais détectable en réponse à l'Asana, avec un indice de division cellulaire (CDI) de 3,5.Il y a eu une réponse plus forte à l'extrait de tissu oculaire avec un ICD de 6,8. Le virus de la grippe inactivé a été inclus comme témoin positif selon cette procédure. D'autres méthodes comme Ali Spot ou e Iza peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que les cytokines sécrétées en réponse aux antigènes d'origine tissulaire.

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