Mesure des effets sur la fonction cellulaire anticorps de cardiomyocytes isolés

L’objectif global de l’expérience suivante est de détecter les anticorps cardiotropes dans le plasma de patients atteints de cardiomyopathie dilatée ou d’autres maladies cardiaques auto-immunes. Ceci est réalisé par une mini-immuno-absorption initiale du plasma du patient sur des colonnes de spheros anti-IgG pour purifier l’immunoglobuline G dans un deuxième temps. Les cardiomyocytes ventriculaires sont isolés à partir de rats wistar adultes, fournissant la base cellulaire de cet essai biologique.

Ensuite, les cardiomyocytes sont autorisés à se fixer à la chambre et colorés avec URA 2h00 afin de permettre l’observation du transitoire calcique intracellulaire pendant les contractions, puis l’IgG du patient est testé pour observer son effet sur la contractilité des cardiomyocytes. Les résultats démontrent si les IgG d’un patient contiennent des anticorps tropiques en fonction des modifications de la contractilité et du calcium transitoire dans les cardiomyocytes isolés. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme les immunoessais standard pour la détection des anticorps est qu’elle est indépendante d’un antigène spécifique et qu’elle permet de faire la distinction entre les anticorps stimulants et bloquants.

La démonstration de la procédure sera bera Google et fera l’expérience de l’assistance technique de notre laboratoire. Pour commencer cette procédure, préparez les mini-colonnes d’immuno-absorption en remplissant trois millilitres, des spheros anti-IgG pour deux millilitres de plasma EDTA patient dans une colonne econopak vide. Ensuite, placez un filtre sur le sphéros anti-IgG.

Ouvrez l’extrémité inférieure de la colonne et appuyez sur le filtre pour atteindre un débit d’environ une goutte par seconde. Ensuite, lavez la colonne trois fois avec un volume de plasma de chlorure de sodium à 0,9 %, pipetez le plasma dans la colonne lorsque le plasma est complètement immergé dans le lavage anti IgG Spheros avec le même volume de chlorure de sodium à 0,9 %. Ensuite, pipetez un volume plasmatique de chlorhydrate de glycine de 0,2 molaire à pH 2,8 dans la colonne et laissez-le immerger dans le phos.

Ajoutez ensuite un autre volume de chlorhydrate de glycine dans la colonne. Recueillir le débit dans un tube de 15 millilitres et ajuster le pH à 7,3 avec 0,5 molaire de chlorhydrate de tris à p pH 8,0 pour régénérer la colonne. Lavez-le avec trois volumes plasmatiques de chlorhydrate de glycine après un lavage final avec deux volumes de chlorure de sodium à 0,9 %.

La colonne peut être utilisée pour l’échantillon de plasma suivant pour l’utilisation sur les cardiomyocytes. La fraction IgG collectée doit être dialysée par rapport au tampon expérimental en remplissant d’abord la fraction IgG dans un tube à membrane de dialyse à base d’ester de cellulose avec une coupure de poids moléculaire de 100 kilodaltons. Ensuite, mettez le tube dans un litre d’EB et remuez lentement avec un mélange magnétique à quatre degrés Celsius Après huit heures, transférez le tube de dialyse dans trois litres d’EB frais et dialysez pendant encore 20 heures à quatre degrés Celsius après la dialyse.

Faites bouillir l’échantillon pendant 30 minutes à 57 degrés Celsius dans un bain-marie. Pour inactiver les facteurs du complément, déterminer la concentration totale en IgG et préparer des aliquotes contenant chacune 330 microgrammes d’IgG. Dans cette procédure, préparez un tampon d’isolement sans calcium selon le manuscrit ci-joint.

Remplissez ensuite 80 millilitres d’IB dans le réservoir supérieur d’un système de perfusion à thermostat et maintenez le tampon à 37 degrés Celsius et aérez-le avec 95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Dissoudre environ 7 000 à 10 000 unités de collagénase de type deux et 174 milligrammes de BSA sans acides gras dans 20 millilitres. IB contenant 112,5 micromolaires de chlorure de calcium et ajuster le pH du tampon d’isolement dans le réservoir supérieur si nécessaire.

Ensuite, anesthésie un rat wistar de 175 à 200 grammes à l’aide de thiopental à 375 microgrammes par kilogramme avec 2 500 UI d’héparine ajoutée à la solution de thiopental. Après la thoracotomie, excisez soigneusement le cœur avec un arc aortique intact et transférez-le dans du chlorure de sodium glacial, point zéro pour cent dans du chlorure de sodium glacé. Retirez le sang et les tissus environnants du cœur.

Ensuite, transférez-le dans du chlorure de sodium frais à 0,9 % et exposez l’aorte. Allumez le réducteur de débit du système de langue pour obtenir une vitesse de chute de deux à trois par seconde. Fixez ensuite le cœur à la canule.

Perfuser-le jusqu’à trois minutes avec un débit d’une goutte par seconde pour éliminer le sang restant. Ensuite, faites circuler l’IB dans le système LOR. Retirez maintenant le tampon de 20 millilitres du réservoir supérieur.

Remplissez le réservoir avec la solution de collagénase et remplissez autant de tampon que nécessaire pour atteindre 80 millilitres. Faites ensuite circuler la solution de digestion pendant encore 27 minutes. Ensuite, détachez le cœur de la canule.

Retirez les oreillettes et l’aorte, puis coupez les ventricules en petits morceaux. Laissez le tampon de digestion s’écouler dans le réservoir inférieur. Réduire le volume à un maximum de 40 millilitres pour digérer davantage les ventricules hachés pendant 10 à 15 minutes sous l’aération continue avec 95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone.

Ensuite, filtrez la suspension cellulaire à travers une gaze de 200 microns dans un tube de 50 millilitres. Enfin, rétablissez la teneur en calcium des cellules en centrifugeant la suspension cellulaire à 40 3G pendant deux minutes. À température ambiante, remettre les cellules en suspension dans 10 millilitres.

IB contenant 200 micromolaires de chlorure de calcium centrifuge à nouveau et remettre en suspension les cellules dans 10 millilitres. IB avec 500 micromolaires de chlorure de calcium. Après une centrifugation finale, les cardiomyocytes sont suspendus dans de l’EB filtré stérile à une densité de 50 000 cellules par millilitre.

Enduisez les verres de couverture dans une chambre à quatre puits avec 10 microgrammes de laminine par puits et attendez qu’il soit complètement sec. Remplissez ensuite un millilitre de suspension de cardiomyocytes dans chaque puits. À l’aide d’une micro-pipette avec une pointe coupée et laissez les cellules adhérer pendant une heure à température ambiante, diluez 10 microlitres de la solution mère d’un milligramme par millilitre de Fira 2:00 AM dans cinq millilitres, eb, et gardez la solution de coloration dans l’obscurité.

Ensuite, retirez le tampon et les cellules non attachées des verres de couverture pipette 0,5 millilitres de la solution de coloration. Dans chacun, bien incuber les cellules pendant 10 minutes sous une agitation modérée. Ensuite, retirez la solution de coloration et lavez les cellules une fois avec un millilitre d’eb.

Ajoutez ensuite 0,5 millilitre d’EB dans chaque puits dans cette procédure, placez le verre de couverture sous un microscope à fluorescence inverse connecté à un système d’enregistrement du calcium et de la contractilité des myocytes. Positionnez une électrode sur mesure avec un tube d’influx et d’influx dans le premier puits et super. Fusionner les cardiomyocytes avec un millilitre par minute eb.

Commencez la stimulation électrique à 20 volts, un hertz et une durée de cinq millisecondes par impulsion, et laissez les cellules s’adapter à la stimulation pendant environ deux minutes. Choisissez un cardiomyocyte intact en forme de bâtonnet avec une striation claire et une contraction constante et positionnez-le au centre du champ visuel. Ouvrez ensuite le canal de la caméra et orientez la cellule horizontalement dans la zone vidéo en tournant l’adaptateur de cadrage de cellule et en déplaçant la platine du microscope.

Ajustez la limite des éléments de contrôle de détection de la zone vidéo. Allumez le canal fluorescent et enregistrez 10 à 15 contractions pour obtenir le raccourcissement cellulaire initial et le transitoire calcique. Après cela, éteignez le canal de lumière du microscope pour éviter le blanchiment de la coloration fluorescente.

Basculez le flux de l’EB à la dérivation de l’échantillon à l’aide d’une valve à trois voies et fusionnez les cardiomyocytes avec un millilitre d’IgG du patient. Arrêtez la pompe juste avant que l’air n’atteigne, allumez le canal de lumière et enregistrez encore 10 à 15 contractions pour obtenir la réponse cellulaire aiguë. Ensuite, mettez l’enregistrement en pause et éteignez à nouveau le canal lumineux, répétez les enregistrements après deux et cinq minutes et retirez l’électrode du puits lorsqu’ils ont terminé à la fin, analysez le raccourcissement de la cellule et le transitoire du calcium avec le logiciel Ion Wizard en utilisant respectivement la longueur du bord et la fenêtre de rapport de barre oblique soustraite URA à deux chiffres.

Ensuite, calculez les variations en pourcentage pour les réponses aiguës, les réponses de deux minutes et de cinq minutes à partir du raccourcissement cellulaire initial et de la hauteur du pic transitoire de calcium. Voici un exemple représentatif de la mesure de contrôle. Le raccourcissement cellulaire et le transitoire calcique ont été surveillés en ligne avant la superfusion avec IgG et immédiatement deux minutes et cinq minutes après la superfusion avec IgG.

Et voici un exemple de mesure d’un échantillon d’IgG contenant des anticorps cardio-dépressifs. Le raccourcissement cellulaire et le transitoire calcique ont été mesurés en ligne avant la superfusion avec IgG et immédiatement deux minutes et cinq minutes après la superfusion avec IgG. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter les anticorps du trafic cardio dans le plasma des patients en mesurant l’effet des IgG isolées sur le raccourcissement cellulaire dans le transitoire calcique des cardiomyocytes rouges adultes isolés.