Mesure des effets sur la fonction cellulaire anticorps de cardiomyocytes isolés

L'objectif général de l'expérience suivante est de détecter les anticorps cardiotropes dans le plasma de patients atteints de cardiomyopathie dilatée ou d'autres maladies cardiaques d'origine auto-immune. Cela est réalisé par une immunoabsorption initiale du plasma du patient sur des colonnes sphériques anti-IgG afin de purifier l'immunoglobuline G, dans une deuxième étape. Des cardiomyocytes ventriculaires sont isolés à partir de rats Wistar adultes, fournissant la base cellulaire pour ce test biologique.

Ensuite, les cardiomyocytes sont laissés libres de s'attacher aux lamelles de la chambre et sont colorés avec l'URA 2:00 AM afin de permettre l'observation du transitoire intracellulaire du calcium pendant les contractions, puis l'IgG du patient est testée pour observer son effet sur la contractilité des cardiomyocytes. Les résultats démontrent si l'IgG d'un patient contient des anticorps trophiques selon les modifications de la contractilité et du transitoire calcique dans les cardiomyocytes isolés. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les immunoessais standards pour la détection des anticorps, est qu'elle est indépendante d'un antigène spécifique et qu'elle permet de discriminer entre les anticorps stimulateurs et bloquants.

La démonstration de la procédure sera assurée par Google et bénéficiera d'une assistance technique de notre laboratoire. Pour commencer cette procédure, préparez les colonnes mini d'immunoabsorption en remplissant trois millilitres de sphéros anti-IgG par deux millilitres de plasma EDTA du patient dans une colonne vide Econopak. Ensuite, placez un filtre au-dessus des sphéros anti-IgG.

Ouvrir l'extrémité inférieure de la colonne et appuyer sur le filtre afin d'obtenir un débit d'environ une goutte par seconde. Laver ensuite la colonne trois fois avec un volume de plasma de chlorure de sodium à 0,9 %, puis introduire le plasma dans la colonne à l'aide d'une pipette lorsque le plasma s'est complètement imprégné dans l'anti-IgG Spheros. Effectuer un lavage avec le même volume de chlorure de sodium à 0,9 %. Ensuite, introduire dans la colonne un volume de plasma de glycine hydrochlorure 0,2 M à pH 2,8 à l'aide d'une pipette et laisser pénétrer dans la phos.

Ensuite, ajouter un autre volume de chlorure de glycine sur la colonne. Recueillir l'écoulement dans un tube de 15 millilitres et ajuster le pH à 7,3 à l'aide de chlorure de tris 0,5 molaire à un pH de 8,0 pour régénérer la colonne. Laver avec trois volumes plasmatiques de chlorure de glycine après un lavage final avec deux volumes de chlorure de sodium à 0,9 %.

La colonne peut être utilisée pour l'échantillon de plasma suivant destiné à être utilisé sur les cardiomyocytes. La fraction d'IgG recueillie doit être dialysée contre un tampon expérimental en remplissant d'abord la fraction d'IgG dans un tube en membrane de dialyse en ester de cellulose ayant une coupure de poids moléculaire à 100 kilodaltons. Ensuite, placer le tube dans un litre de tampon EB et agiter doucement à l'aide d'un agitateur magnétique à quatre degrés Celsius. Après huit heures, transférer le tube de dialyse dans trois litres de tampon EB frais et poursuivre la dialyse pendant 20 heures supplémentaires à quatre degrés Celsius.

Faites bouillir l'échantillon pendant 30 minutes à 57 degrés Celsius dans un bain-marie. Pour inactiver les facteurs du complément, déterminez la concentration totale d'IgG et préparez des aliquotes contenant chacune 330 microgrammes d'IgG. Dans cette procédure, préparez un tampon d'isolement sans calcium conformément au manuscrit joint.

Ensuite, remplir le réservoir supérieur d'un système de perfusion thermostaté avec 80 millilitres de IB et maintenir le tampon à 37 degrés Celsius en l'oxygénant avec un mélange de 95 % d'oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Dissoudre environ 7 000 à 10 000 unités de collagénase de type deux et 174 milligrammes de BSA sans acides gras dans 20 millilitres de IB contenant 112,5 micromolaire de chlorure de calcium, et ajuster le pH du tampon d'isolement dans le réservoir supérieur si nécessaire.

Ensuite, anesthésiez un rat Wistar de 175 à 200 grammes à l’aide de thiopental à raison de 375 microgrammes par kilogramme, avec 2 500 UI d’héparine ajoutées à la solution de thiopental. Après thoracotomie, excisez soigneusement le cœur en conservant l’arc aortique intact et transférez-le dans du chlorure de sodium à zéro virgule zéro pour cent, refroidi sur glace. Retirez le sang et les tissus environnants du cœur.

Transférez-le ensuite dans du chlorure de sodium frais à 0,9 % et exposez l'aorte. Activez le réducteur de débit du système langor afin d'obtenir une vitesse de goutte-à-goutte de deux à trois gouttes par seconde. Ensuite, fixez le cœur à la canule.

Perfuser pendant trois minutes maximum avec un débit d'une goutte par seconde pour éliminer le sang résiduel. Ensuite, faire circuler l'IB dans le système LOR. Prélever maintenant 20 millilitres de tampon dans le réservoir supérieur.

Remplir le réservoir avec la solution de collagénase et rajouter autant de tampon que nécessaire pour atteindre 80 millilitres. Ensuite, faire circuler la solution de digestion pendant encore 27 minutes. Puis, détacher le cœur de la canule.

Retirez les oreillettes et l'aorte, puis hachez les ventricules en petits morceaux. Laissez le tampon de digestion s'écouler vers le réservoir inférieur. Réduisez le volume à un maximum de 40 millilitres afin de poursuivre la digestion des ventricules hachés pendant 10 à 15 minutes sous aération continue avec 95 % d'oxygène et 5 % de dioxyde de carbone.

Ensuite, filtrer la suspension cellulaire à travers une gaze de 200 microns de taille de maille dans un tube de 50 millilitres. Enfin, restaurer la teneur en calcium des cellules en centrifugeant la suspension cellulaire à 40 3G pendant deux minutes. À température ambiante, resuspendre les cellules dans 10 millilitres.

IB contenant 200 micromolaire de chlorure de calcium, centrifuger à nouveau et resuspendre les cellules dans 10 millilitres. IB avec 500 micromolaire de chlorure de calcium. Après une dernière centrifugation, resuspendre les cardiomyocytes dans un EB stérile filtré à une densité de 50 000 cellules par millilitre.

Recouvrez les lamelles dans une chambre à quatre puits avec 10 microgrammes de laminine par puits, puis attendez qu'elle soit complètement sèche. Ensuite, ajoutez un millilitre de la suspension de cardiomyocytes dans chaque puits. À l’aide d’une micropipette à embout coupé, laissez les cellules adhérer pendant une heure à température ambiante, diluez 10 microlitres de la solution mère de fira 2:00 AM à un milligramme par millilitre dans cinq millilitres de EB, et conservez la solution de marquage à l’abri de la lumière.

Ensuite, retirez le tampon et les cellules non attachées des lamelles. Ajoutez 0,5 millilitre de la solution de coloration à l’aide d’une pipette dans chaque puits et incubez les cellules pendant 10 minutes sous agitation modérée. Par la suite, retirez la solution de coloration et lavez les cellules une fois avec un millilitre de EB.

Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de tampon EB dans chaque puits selon cette procédure, puis placez la lame sous un microscope à fluorescence inversé relié à un système d'enregistrement du calcium et de la contractilité des myocytes. Positionnez une électrode sur mesure équipée d'un tube d'entrée et d'un tube d'afflux dans le premier puits et au-dessus. Fusionnez les cardiomyocytes avec 1 millilitre par minute de tampon EB.

Commencez la stimulation électrique à 20 volts, 1 hertz et une durée de cinq millisecondes par impulsion, et laissez les cellules s'adapter à la stimulation pendant environ deux minutes. Choisissez un cardiomyocyte en forme de bâtonnet intact, présentant une striation nette et une contraction régulière, et positionnez-le au centre du champ visuel. Ouvrez ensuite le canal de la caméra et orientez la cellule horizontalement dans la zone vidéo en tournant l'adaptateur de cadre de cellule et en déplaçant la platine du microscope.

Régler la limite des éléments de contrôle de détection de la zone vidéo. Activer le canal fluorescent et enregistrer de 10 à 15 contractions afin d'obtenir le raccourcissement cellulaire initial et le transitoire calcique. Ensuite, désactiver le canal lumineux du microscope pour éviter la décoloration de la coloration fluorescente.

Basculer l'écoulement de l'EB vers le contournement de l'échantillon à l'aide d'un robinet trois voies, puis fusionner les cardiomyocytes avec un millilitre d'IgG du patient. Arrêter la pompe juste avant que l'air n'atteigne la cuvette, allumer le canal lumineux et enregistrer encore 10 à 15 contractions afin d'obtenir la réponse cellulaire aiguë. Ensuite, mettre en pause l'enregistrement et éteindre à nouveau le canal lumineux. Répéter les enregistrements après deux et cinq minutes, puis retirer l'électrode de la cuvette une fois terminé. Analyser le raccourcissement cellulaire et le transitoire calcique à l'aide du logiciel IonWizard, en utilisant respectivement la longueur du bord divisée par la longueur et la fenêtre de soustraction numérique URA2 divisée par le rapport.

Ensuite, calculez les pourcentages de variation des réponses aiguë, à deux minutes et à cinq minutes par rapport à la réduction initiale de la cellule et à la hauteur maximale du transitoire calcique. Voici un exemple représentatif de la mesure témoin. La réduction de la cellule et le transitoire calcique ont été surveillés en continu avant la perfusion avec l’IgG et immédiatement deux minutes et cinq minutes après la perfusion avec l’IgG.

Voici un exemple de mesure d'un échantillon d'IgG contenant des anticorps dépresseurs cardiaques. Le raccourcissement cellulaire et le transitoire calcique ont été mesurés en continu avant la perfusion avec les IgG, puis immédiatement deux minutes et cinq minutes après la perfusion avec les IgG. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment détecter les anticorps cardio-dépresseurs dans le plasma de patients en mesurant l'effet des IgG isolées sur le raccourcissement cellulaire et le transitoire calcique des cardiomyocytes adultes isolés.