Name: Isolement rapide des cellules tumorales circulantes viables partir déchantillons sanguins des patients (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Apprenez à isoler des cellules tumorales circulantes viables à partir d'échantillons sanguins de patients cancéreux en utilisant un dispositif de microtube fonctionnalisé. Cette technique biomimétique préserve l'intégrité cellulaire et permet de développer des thérapies personnalisées.

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Le travail décrit a été pris en charge par le Centre de Cornell sur le micro-environnement et métastases à travers U54CA143876 Nombre Prix du National Cancer Institute. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;Institut national du cancer ou de la National Institutes of Health. Ce travail a été en outre financé en partie par la National Science Foundation Graduate Fellowship recherche (ADH).

Le protocole suivant est pour la production d&#39;un dispositif unique microtube. 1. Préparation de la solution de nanotubes halloysite <ol><li> Soniquer (10-13 W (RMS)) 250 uL solution de nanotubes halloysite (6,6% en poids dans l&#39;eau) 30 sec. Solution refroidir à l&#39;eau froide et sonication répéter une fois. Refroidissez à nouveau. </li><li> Dessiner solution soniqué dans une seringue, fixer un filtre de 0,45 um seringue, et la solution du filtre dans microtube propre. Vortex la solution de temps en temps pour maintenir l&#39;homogénéité. </li></ol> 2. Revêtement de surface microtube intérieur avec des nanotubes de halloysite <ol><li> Obtenir 50 cm longue section de Micro-Renathane microtubing (300 um de diamètre intérieur, 35,3 ul de volume interne). Couper une extrémité du microtube en diagonale et l&#39;insérer dans une pièce IDEX petit adaptateur. Insérez l&#39;aiguille d&#39;une seringue 3/10 cc 29G dans l&#39;autre extrémité du microtube. </li><li> Pour nettoyer le microtube, placez l&#39;extrémité ouverte du microtube (la finavec l&#39;adaptateur) dans l&#39;éthanol à 70% du tirage de l&#39;éthanol à 50 ~ ul dans la seringue pour remplir microtube. </li><li> Rincer l&#39;éthanol sur le microtube en attirant un volume généreux de l&#39;eau distillée dans la seringue. </li><li> Détacher la seringue du microtube, vider la seringue, puis la rattacher à la microtube. </li><li> Préparer une solution de 0,02% p / v de poly-L lysine dans l&#39;eau. Dessiner 50 uL dans le microtube et laisser reposer pendant 5 min à température ambiante (RT). </li><li> Dessiner une solution de 100 ul de nanotubes et filtré dans le microtube et laisser incuber pendant 3 min à température ambiante. </li><li> Dessinez 100 pi d&#39;eau à travers le microtube pour rincer la solution de nanotubes. Laisser microtube revêtu de s&#39;asseoir, rempli d&#39;eau, une nuit à TA. </li></ol> 3. Préparation de microtubes pour l&#39;isolement cellulaire <ol><li> Préparer une solution de 10 ug / ml à la protéine G dans le phosphate de Dulbecco 1X une solution saline tamponnée (PBS, pH 7,0 - 7,2). Dessiner 50 ul de PBS par microtube puis dessinez 50 pi dela solution de protéine-G et laisser incuber pendant 1,5 heure à température ambiante. </li><li> Préparer une solution contenant 5 ug / ml E-sélectine-IgG et 50 pg / ml d&#39;anticorps (anti-EpCAM pour la plupart des échantillons de cancer, anti-PSMA pour les échantillons cancer de la prostate) dans du PBS. Dessiner 50 pi de l&#39;E-sélectine et une solution d&#39;anticorps dans le microtube et laisser incuber pendant 2 h à température ambiante. </li><li> Non spécifique adhésion cellulaire est bloqué avec des protéines de lait de 5%. Préparer une solution de 5% (p / v) de protéine du lait dans du PBS. Dessiner une solution à 50 ul de protéines de lait dans le microtube et laisser incuber pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Dessiner 50 ul de PBS dans le tube et laisser à température ambiante avant que des échantillons de sang ou de buffy coat sont prêts pour le traitement. </li><li> 10 min avant d&#39;utiliser le microtube pour l&#39;isolement, dessiner 50 ul de PBS qui a été saturé avec du Ca 2 + (&quot;PBS +&quot;) pour activer les molécules de sélectine. </li></ol> 4. Préparation des échantillons pour l&#39;isolement cellulaire <ol><li> Dessinez ou obtenir 10 mL de sang du patient dans héparinéTube. </li><li> Placer 10 ml de Ficoll-Paque solution d&#39;isolation de lymphocytes dans 50 ml tube de la centrifugeuse. Doucement couche sang 10 ml ensemble au-dessus de Ficoll manière à ne pas mélanger le sang et de Ficoll. </li><li> Centrifuger à 2000x g pendant 15 min à 4 ° C avec une décélération minimale. </li><li> Retirez la couche leuco-plaquettaire et le placer dans un nouveau tube. </li><li> Laver avec du PBS couche leuco-plaquettaire (centrifugeuse à 230x g pendant 10 min, éliminer le surnageant). </li><li> Resuspendre doucement les cellules avec 1 ml de tampon de lyse et incuber pendant 10 min à température ambiante pour lyser les érythrocytes. </li><li> Ajouter 10 ml de PBS, mélanger doucement et centrifuger à 230x g pendant 10 min. Jeter le surnageant et doucement reprendre le culot dans 3 à 4 ml de PBS +. </li></ol> 5. Isolement cellulaire <ol><li> Fixez une extrémité du microtube fonctionnalisé à un seringue de 5 ml en utilisant des adaptateurs IDEX. </li><li> Insérez la seringue sur une pompe à seringue. </li><li> Plonger l&#39;extrémité ouverte du microtube fonctionnalisé dans la cellule de suspension. </li><li> Traiter la suspension cellulaire à travers le microtube de 1 à 4 ml / h. </li><li> Transfert à l&#39;extrémité ouverte du microtube dans un tube contenant du PBS + et d&#39;en tirer 300 + pi de PBS dans la seringue de 0,016 ml / min pour éliminer les cellules non relié et faiblement liés du microtube. </li><li> Placer l&#39;extrémité ouverte du microtube dans un tube propre. Déconnecter la seringue du microtube et joindre une seringue pré-remplie avec Accutase. Doucement perfuser Accutase assez dans le microtube à remplir (~ 50 pi) et laisser incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Fixer une seringue pré-remplie avec 1 ml de milieu de croissance (79% RPMI, SVF 20%, 1% de streptomycine à la pénicilline) et perfuser en microtube, la collecte des effluents dans la culture de tissus bien traités plaque. </li><li> Des cellules en culture à 37 ° C et 5% de CO 2 dans des conditions humidifiés. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Le but de cette technique consiste à isoler les cellules cancéreuses viables dans le sang de patients atteints de cancer. Plusieurs méthodes existent pour identifier les cellules cancéreuses en culture; une vérification nécessaire à la réussite appareil. Nous avons choisi pour colorer les cellules en culture avec des anticorps contre des fragments épithéliaux tels que EpCAM (molécule d&#39;adhésion cellulaire épithéliale) ou PSMA (antigène prostatique membranaire spécifique), en plus de DAPI à identifier les noyaux des cellules intactes (Fig. 2 et 3). Le nombre de cellules cancéreuses capturé en utilisant la technique est nécessairement une fonction du nombre de CTC dans l&#39;échantillon de départ, et à la variabilité du patient peut être élevé. Dans le traitement des échantillons prélevés sur des patients diagnostiqués avec le cancer de stade IV, nous avons l&#39;habitude de capturer entre 100 et 500 cellules cancéreuses par tube de sang, à des puretés&gt; 50%. Immédiatement après l&#39;isolement, un plus grand nombre de leucocytes contaminants peuvent être présents. Toutefois, ces chiffres seront épuisées après une incubation dans un milieu de culture pour un maximum de 5 jours. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <strong&gt; Figure 1. Schéma de microtube fonctionnalisé pour l&#39;isolement de la CCT, montrant sélectine-médiée de roulement suivie par médiée par les anticorps adhérence statique. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> Figure 2. Données représentatives de l&#39;isolement de la CCT à partir d&#39;échantillons de sang prélevés à partir d&#39;un patient atteint de cancer du sein et un patient du cancer du poumon. Le nombre de cellules viables positive identifiés comme CCT sur la base de la coloration EpCAM est représenté par des barres solides et se rapportent à l&#39;ordonnée de gauche et le pourcentage de cellules qui ont été identifiées comme CCT par rapport au nombre total de cellules capturées est représenté par les barres d&#39;ouverture et de mesurée sur la droite d&#39;ordonnée. Les résultats sont, après cinq jours de culture. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> Micrographies représentatives Figure 3. Des bailleurs de fonds distincts (A et B) de la CCT dans la culture 5 jours à la suite de isolatisur un échantillon de sang patients atteints du cancer. Les cellules ont été colorées pour fluorescence EpCAM avec AlexaFluor 488 (vert) et 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour visualiser le noyau (en bleu).

<ol><li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li>
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</ol>

MRK est un conseiller scientifique de CellTraffix, Inc (Rochester, NY).

Il est souvent le cas que les premières étapes de la découverte de nouvelles thérapies contre le cancer d&#39;utiliser des lignées de cellules cancéreuses, ce qui ne ressemblent discutable de cellules cancéreuses primaires restent encore en cours d&#39;utilisation en raison de leur facilité d&#39;utilisation dans le laboratoire. La recherche sur le développement de nouveaux traitements du cancer serait accéléré si primaires des cellules cancéreuses humaines ont été utilisées dès le début dans la recherche roman. CCT sont le type le plus facilement accessible de la cellule cancéreuse, en raison de leur présence dans le sang et la facilité d&#39;une prise de sang standard. En outre, les cellules tumorales circulantes représentent une étape nécessaire dans le processus de métastase 5,6, de sorte que leur pertinence pour la maladie et l&#39;utilité pour le ciblage de nouveaux médicaments est clair. Isolement de la CCT à partir du sang in vitro est compliquée par leurs faibles concentrations: de l&#39;ordre de un cas par million de leucocytes ou de l&#39;un par milliard érythrocytes 7. La majorité des méthodes actuelles de détection de la CCT dans le sang, y compris la Cellule technique approuvé par la FDA ne<html> Recherche (Veridex), endommager ou détruire les cellules dans le processus de détection, ce qui empêche l&#39;utilisation au-delà de l&#39;énumération. La méthode décrite ci-dessus ne compromet pas la viabilité cellulaire et ouvre ainsi la porte à la recherche clinique sur le cancer du futur. Comme la récupération des cellules intactes est le but de cette technique, il est impératif que les cellules être manipulés avec soin, en particulier lors des étapes de séparation du sang. Il ya un certain nombre de paramètres ajustables dans ce système qui pourrait être modifié de façon à obtenir un rendement amélioré en fonction des caractéristiques essentielles telles que le type de cancer. Dans les étapes décrites ci-dessus, nous avions choisi d&#39;utiliser EpCAM comme un anticorps spécifique de la CCT pour tous les types de cancer, sauf lorsque le traitement d&#39;échantillons cancer de la prostate, dans lequel anti-PSMA a été utilisé. Substitutions supplémentaires de cancer des anticorps spécifiques peut certainement être utilisée pour améliorer les performances pour les patients individuels. En outre, les concentrations d&#39;anticorps et de sélectine peuvent être modifiés pour améliorer la capture 8. &quot;&gt; Une caractéristique essentielle du dispositif est l&#39;incorporation de la E-sélectine molécules sur la surface. E-sélectine est normalement exprimé à la surface luminale des cellules endothéliales et la fonction de recruter des leucocytes mobiles rapides aux sites d&#39;inflammation. Leucocytes Flowing lier transitoirement molécules de sélectine, résultant en un rythme plus lent, le comportement de roulement qui facilite la liaison plus lente et plus forte de la cellule à l&#39;endothélium par les intégrines. convaincante des preuves expérimentales existe qui rend le cas où la CCT peut s&#39;extravaser par un mécanisme similaire 9,10. L&#39;inclusion de la sélectine aussi permet au dispositif de fonctionner à des débits supérieurs, des taux qui empêcherait, sinon, les cellules de se lier à des anticorps 11. Ainsi, notre dispositif imite physiologiquement une veinule de biomimetically capturer couler la CCT, sans infliger des lésions cellulaires. Amélioration de la performance du dispositif peut être attribuée à l&#39;ajout du revêtement de nanotubes halloysite à la surface luminaledu dispositif. Des études antérieures ont montré qu&#39;il ya trois principales composantes du revêtement de nanotubes de qui permet de fonctionnalités améliorées. Tout d&#39;abord, le revêtement de nanotubes de fournit une plus grande surface, ce qui permet une plus grande pour le dépôt de protéines sur la surface 4. Deuxièmement, à effectuer la microscopie à force atomique sur le revêtement de nanotubes on a déterminé que les nanotubes individuels saillie sur la surface dans le flux. Cela permet molécules de sélectine qui sera présenté autant que l&#39;ordre du micron au-dessus de la surface de sorte que les cellules peuvent être capturés et recruté à la surface plus tôt dans leur trajectoire à travers le tube 4. Enfin, le revêtement de nanotubes de halloysite est capable d&#39;empêcher l&#39;adhérence des leucocytes et la propagation à la surface, permettant une réduction du nombre de leucocytes capturés le long de la CCT et donc plus ultérieures puretés de la CCT 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> 300 tubes ID um </td><td> Braintree scientifique </td><td> MRE025 </td></tr><tr><td> Des tuyaux plus gros pour le raccordement à la seringue </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> 1507L </td></tr><tr><td> Seringue de 5 ml pour la pompe </td><td> BD </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Petit connecteur à gros tube </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> P-770 </td></tr><tr><td> Tube connecteur grande à la seringue </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> F-120 et P-659 </td></tr><tr><td> Seringue pour microtube (seringue à insuline U-100 3/10cc 29G 1/2 &quot;) </td><td> BD </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> MP Biomedicals LLC </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol-Paque Plus </td><td> GE Soinsthcare Bio-Sciences AB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC Lysis Buffer (Tampon EL, 1000ml) </td><td> Qiagen </td><td> 1014614 </td></tr><tr><td> Protéine G, 5 mg </td><td> CalBiochem (calbiochem.com) </td><td> 539303 </td></tr><tr><td> Anticorps humain EpCAM/TROP-1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> LMFP Anticorps (GCP-04) </td><td> Abcam </td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> Plaques à 96 puits (Microtest 96) </td><td> BD Falcon </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> Buvard Blocker année non-lait écrémé en poudre, 300g </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 216005508 </td></tr><tr><td> Nanotubes halloysite </td><td> NaturalNano </td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td> Carbonate de calcium, 5g </td><td> Aldrich Chimie </td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fc Chimera, UG 100 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> Milieu RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td> La poly-L lysine 0,1% p / v dans l&#39;eau </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920-100ML </td></tr><tr><td> Sonic Dismembrator </td><td> Fisher Scientific </td><td> Modèle 100 </td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin </td><td> Biochimiques Atlanta </td><td> S11056H </td></tr><tr><td> Streptomycine Pénicilline </td><td> Sigma vie Siiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

isolement rapide des cellules tumorales circulantes viables partir d&#39;échantillons sanguins des patients

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont des cellules qui diffusent à partir d&#39;une tumeur primaire dans tout le système circulatoire et qui peuvent finir par former des tumeurs secondaires à des sites distants. CCT de comptage peut être utilisé pour suivre la progression des maladies basée sur la corrélation entre la concentration de la CCT dans le sang et 1 sévérité de la maladie. Comme un outil de traitement, la CCT pourraient être étudiées dans le laboratoire pour développer des thérapies personnalisées. À cette fin, l&#39;isolement de la CCT doit pas causer de dommages cellulaires, et la contamination par d&#39;autres types cellulaires, notamment les leucocytes, doit être évité autant que possible 2. La plupart des techniques actuelles, y compris la semelle approuvé par la FDA pour le dénombrement dispositif CTC, de détruire la CCT dans le cadre du processus d&#39;isolement (pour plus d&#39;informations, voir Réf. 2). Dispositif microfluidique pour capturer viables CCT est décrit, consistant en une surface fonctionnalisée avec la sélectine E en plus de la glycoprotéine d&#39;anticorps contre des marqueurs 3 épithéliales. Pour améliorer la performance dispositifperformance d&#39;un revêtement de nanoparticules a été appliqué consistant en nanotubes halloysite, une nanoparticule d&#39;aluminosilicate récolté à partir d&#39;argile 4. Les molécules E-sélectine fournir un moyen de capturer en mouvement rapide de la CCT qui sont pompés à travers le dispositif, donnant un avantage sur d&#39;autres dispositifs microfluidiques dans lequel fois plus de temps de traitement sont nécessaires pour fournir des cellules cibles avec suffisamment de temps pour interagir avec une surface. Les anticorps dirigés contre des cibles épithéliales fournir CTC-spécificité de l&#39;appareil, ainsi que de fournir un paramètre facilement réglable pour régler l&#39;isolement. Enfin, le revêtement de nanotubes de halloysite permet d&#39;isoler considérablement améliorée par rapport à d&#39;autres techniques en les aidant à capturer rapidement les cellules en mouvement, en fournissant plus grande surface pour l&#39;adsorption des protéines, et de repousser les leucocytes contaminants 3,4. Ce dispositif est réalisé par une technique simple en utilisant off-the-plateau matériaux, et a été utilisée avec succès pour capturer les cellules cancéreuses dans le sang du cancer métastatiquepatients atteints de cancer. Les cellules capturées sont maintenus jusqu&#39;à 15 jours de culture après isolement, et ces échantillons se composent généralement de&gt; 50% des cellules cancéreuses viables primaires de chaque patient. Ce dispositif a été utilisé pour capturer à la fois viable CCT sang total dilué et échantillons couche leuco-plaquettaire. En fin de compte, nous présentons une technique avec des fonctionnalités dans un environnement clinique pour développer des thérapies du cancer personnalisés.

Cellules tumorales circulantes sont isolés du sang de patients atteints de cancer sans infliger des dommages cellulaires. Isolement des cellules tumorales est accomplie en utilisant une surface bimoléculaire de E-sélectine en plus d&#39;anticorps contre des marqueurs épithéliales. Un revêtement de nanotubes de promouvoir spécifiquement l&#39;adhésion cellulaire du cancer résultant en des puretés de capture élevés.

Isolement rapide des cellules tumorales circulantes viables partir d&#39;échantillons sanguins des patients

Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont des cellules qui se disséminent à partir d'une tumeur primaire dans tout le système circulatoire et qui peuvent finalement former des tumeurs secondaires...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules tumorales circulantes viables à partir d'échantillons sanguins. Commencez par la préparation des microtubes d'isolement, puis isolez la couche de leucocytes à partir des échantillons sanguins. Ensuite, traitez la couche de leucocytes à l'aide du dispositif microtube fonctionnalisé.Récupérez les cellules capturées à partir du tube micro et maintenez la culture en utilisant un dispositif qui imite physiologiquement un vaisseau afin de capturer biomimétiquement les CTC circulantes sans provoquer de lésion cellulaire. Cette technique offre une fonctionnalité en milieu clinique pour développer des thérapies anticancéreuses personnalisées. Les principaux avantages sont qu'il s'agit d'une méthode simple qui utilise des matériaux couramment disponibles et qu'elle recrée le processus naturel des tissus solides qui se produit dans les vaisseaux sanguins.Je suis Mike King, professeur agrégé de génie biomédical à l'université Cornell, et la démonstration du protocole sera effectuée par Jeff Madison, technicien principal de mon laboratoire. Le protocole suivant concerne la fabrication d'un seul dispositif microtube : soniquez 250 microlitres d'une solution de nanotubes à 6,6 % Halo site pendant 30 secondes, puis refroidissez la solution à l'eau froide.Après une deuxième sonication, aspirez la solution dans une seringue. Filtrez la solution à l’aide d’un filtre de seringue de 0,45 micron dans un tube microfuge propre. Vortexez périodiquement la solution de nanotubes du site halo.Pour maintenir l'homogénéité, prélevez un tronçon de 50 centimètres de longueur de tube capillaire en micro rehan. Coupez l'extrémité d'entrée du tube capillaire en biais et insérez une extrémité du tube dans un petit raccord IDEXX, puis insérez une aiguille de seringue dans l'autre extrémité du tube capillaire. Pour nettoyer le tube capillaire, plongez l'extrémité ouverte dans de l'éthanol à 70 % et aspirez environ 50 microlitres d'éthanol dans la seringue afin de remplir complètement le tube capillaire, puis expulsez l'éthanol pour rincer le tube.Aspirez un volume généreux d'eau distillée dans la seringue. Détachez maintenant la seringue du tube microcentrifuge, videz la seringue, puis réattachez-la au tube microcentrifuge. Aspirez 50 microlitres de 0,02 pour cent en poids par volume.Introduire du polyol lysine dans le microtube et incuber cinq minutes à température ambiante. Ensuite, prélever 100 microlitres de solution de nanotube filtrée et l'ajouter dans le microtube, puis incuber trois minutes à température ambiante. Pour rincer la solution de nanotube, faire passer 100 microlitres d'eau à travers le microtube et incuber toute la nuit à température ambiante ; faire ensuite passer 50 microlitres de PBS à travers le microtube, suivis de 50 microlitres de 10 microgrammes par millilitre.Équilibrer la solution de protéine G pendant 90 minutes à température ambiante. Ensuite, introduire dans le microtube 50 microlitres d'une solution d'IgG d'E-sélectine à cinq microgrammes par millilitre et d'anticorps à 50 microgrammes par millilitre. Incuber pendant deux heures à température ambiante, puis bloquer l'adhésion cellulaire non spécifique avec une solution de protéines de lait à 5 %.Ensuite, incuber le PBS à température ambiante jusqu'à ce que les échantillons de sang ou de buffy coat soient prêts à être traités, 10 minutes avant d'utiliser le microtube pour l'isolement cellulaire. Prélever 50 microlitres de PBS saturé en calcium pour activer les molécules de sélectine dans un tube hépariné. Prélever un échantillon de sang de 10 millilitres provenant d'un patient pour l'isolement des lymphocytes.Placer 10 millilitres de solution fol pack dans un tube de centrifugation de 50 millilitres. Recouvrir délicatement l'échantillon de 10 millilitres de sang total et centrifuger à 2000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius avec une décélération minimale. Ensuite, transférer la couche de buffy coat dans un nouveau tube.Lavez le culot de globules blancs avec du PBS et centrifugez pour lyser les érythrocytes. Remettez délicatement en suspension les culots cellulaires dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges et incubez pendant 10 minutes à température ambiante. Ajoutez ensuite 10 millilitres.Mélanger doucement le PBS et les cellules du palais par centrifugation. Resuspendre délicatement les cellules dans du PBS supplémenté en utilisant des adaptateurs IDEXX. Fixer une extrémité du microtube fonctionnalisé à une seringue de cinq millilitres.Insérez la seringue dans une pompe à seringue et immergez l'extrémité ouverte du microtube fonctionnalisé dans la prévention des cellules. Faites passer la suspension cellulaire à travers le microtube afin d'éliminer les cellules non liées et faiblement liées. Transférez l'extrémité ouverte du microtube dans un tube contenant du PBS plus.Aspirez 300 microlitres de PBS dans la seringue. Ensuite, placez l'extrémité ouverte du microtube dans un tube propre. Déconnectez la seringue du microtube et fixez une seringue contenant de l'acuate, puis perfusez délicatement l'acuate pour remplir le microtube.Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, fixez une seringue contenant un millilitre de milieu de croissance, parfuser le microtube et recueillir l'effluent dans le tissu approprié. Ensuite, transférez sur des plaques de culture. Les cellules tumorales circulantes isolées ont été obtenues à partir d'échantillons sanguins d'un patient atteint d'un cancer du sein et d'un patient atteint d'un cancer du poumon après cinq jours.En culture. Ces préparations ont été caractérisées par la capture de CTC en se basant sur la coloration de la molécule cellulaire épithéliale epican, ainsi que par la pureté de la capture du noyau, calculée comme le pourcentage de cellules identifiées comme étant des CTC par rapport au nombre total de cellules capturées. Cette image montre des microphotographies représentatives de CTC isolées à partir des donneurs A et B. Après cinq jours de culture, les cellules ont été colorées de manière fluorescente pour EPAM avec l’Alexa Fluor 488.Les noyaux ont été visualisés par coloration au DPI. Après cette procédure, les CTC viables et la culture peuvent être utilisées pour obtenir des informations spécifiques au patient, telles que la sensibilité aux médicaments ou l'expression des marqueurs cellulaires. Merci d'avoir regardé et bonne chance.

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L&#39;isolement et la propagation des cellules tumorales circulantes d&#39;un cancer Modèle Souris

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