Name: Snelle Isolatie van Viable circulerende tumorcellen van de patiënt Blood Samples (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Leer een methode om levensvatbare circulerende tumorcellen te isoleren uit bloedmonsters van kankerpatiënten met een gefunctionaliseerde microbuis. Deze techniek bootst fysiologische omstandigheden na voor hoge opbrengst zonder celbeschadiging.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het werk beschreven werd ondersteund door de Cornell Center op de micro-omgeving en metastasen door Award Aantal U54CA143876 van het National Cancer Institute. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Cancer Institute en de National Institutes of Health. Dit werk werd bovendien deels gefinancierd door een National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH).

Het volgende protocol is voor de productie van een microbuisjes apparaat. 1. Voorbereiding van halloysiet Nanotube Solution <ol><li> Bewerk met ultrasone trillingen (10-13 W (rms)) 250 il halloysiet nanobuis oplossing (6,6 gew% in water) 30 sec. Cool oplossing met koud water en herhaal sonicatie een keer. Laat weer afkoelen. </li><li> Teken gesoniceerde oplossing in een spuit, sluit een 0,45 pm spuitfilter, en filter oplossing in schone microfugebuis. Vortex de oplossing af tot homogeniteit te handhaven. </li></ol> 2. Coating van microbuisjes de binnenkant met halloysiet nanobuisjes <ol><li> Zorg voor 50 cm lange sectie van micro-Renathane microtubing (300 micrometer inwendige diameter, 35,3 pl innerlijke volume). Snijd het ene uiteinde van de microbuisjes op een diagonaal en in te voegen in een klein IDEX adapter stuk. Steek de naald van een 3/10 cc 29g spuit in de andere uiteinde van de microbuisjes. </li><li> Om de microbuisjes schoon te maken, plaatst u het open uiteinde van microbuisjes (het eindemet de adapter) in 70% ethanol en gelijkspel ~ 50 pl ethanol in de spuit om microbuisjes te vullen. </li><li> Spoel de ethanol uit de microbuisjes door het tekenen van een royale hoeveelheid gedestilleerd water in de spuit. </li><li> Maak de spuit van de microbuisjes, het legen van de spuit, en dan vast aan de microbuisjes. </li><li> Een oplossing van 0,02% w / v poly-L lysine in water. Trek 50 pL de microbuisjes en laat hem 5 min bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Teken 100 ul gefilterd nanobuis oplossing in de microbuisjes en laat incubeer gedurende 3 minuten bij RT. </li><li> Teken 100 ul water door de microbuisjes te spoelen de nanobuis oplossing. Laat gecoat microbuisjes te zitten, gevuld met water, &#39;s nachts bij kamertemperatuur. </li></ol> 3. Voorbereiding van microbuizen voor celisolatie <ol><li> Een oplossing van 10 pg / ml proteïne G in fosfaat 1X Dulbecco&#39;s gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,0 - 7,2). Teken 50 pL PBS door microbuisjes en teken dan 50 pihet eiwit-G oplossing en laat gedurende 1,5 uur incuberen bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid een oplossing van 5 ug / ml E-selectine-IgG en 50 ug / ml antilichaam (anti-EpCAM meeste carcinoom, anti-PSMA voor prostaatkanker monsters) in PBS. Trek 50 ul van de E-selectine antilichamen oplossing in de microbuisjes en laat gedurende 2 uur incuberen bij kamertemperatuur. </li><li> Specifieke cellulaire hechting geblokkeerd met 5% melkeiwit. Een oplossing van 5% (w / v) melkeiwit in PBS. Trek 50 pL melkeiwit oplossing in de microbuisjes en laat gedurende 1 uur incuberen bij kamertemperatuur. </li><li> Teken 50 ul PBS in de buis en laat bij kamertemperatuur tot bloed-of buffy coat monsters zijn klaar voor verwerking. </li><li> 10 minuten voorafgaand aan het gebruik van de microbuisjes voor isolatie, trekken 50 ul PBS die is verzadigd met Ca 2 + (&quot;PBS +&quot;) om de selectine moleculen te activeren. </li></ol> 4. Bereiding van monsters celisolatie <ol><li> Teken of 10 ml bloed te verkrijgen van de patiënt in gehepariniseerdebuis. </li><li> Breng 10 ml Ficoll-Paque lymfocyten isolatie-oplossing in 50 ml centrifugebuis. Voorzichtig laag 10 ml totaal bloed op Ficoll zodat geen bloed en Ficoll mengen. </li><li> Centrifugeer bij 2000x g gedurende 15 min bij 4 ° C met minimale vertraging. </li><li> Verwijder de buffy coat laag en plaats in de nieuwe buis. </li><li> Was de buffy coat met PBS (centrifugeer bij 230x g gedurende 10 min, schenk de bovenstaande). </li><li> Voorzichtig mengen cellen met 1 ml RBC lysisbuffer en geïncubeerd 10 min bij kamertemperatuur aan erythrocyten lyseren. </li><li> Voeg 10 ml PBS, meng voorzichtig en centrifugeer bij 230x g gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant en voorzichtig de pellet opnieuw in suspensie in 3 tot 4 ml PBS +. </li></ol> 5. Celisolatie <ol><li> Het ene uiteinde van het gefunctionaliseerde microbuisjes een 5 ml gebruikt IDEX adapters. </li><li> Plaats de spuit op een injectiepomp. </li><li> Dompel het open uiteinde van de gefunctionaliseerde microbuisjes in de cel suspension. </li><li> Werkwijze de celsuspensie door microbuisjes op 1 tot 4 mL / uur. </li><li> Breng het open uiteinde van de microbuisjes een buis met PBS + en stelt 300 ul PBS + in de injectiespuit bij 0.016 ml / min om ongebonden en losjes cellen uit de microbuisjes. </li><li> De open uiteinde van de microbuisjes in een schone buis. Haal de spuit uit de microbuisjes en bevestig een spuit voorgevuld met Accutase. Voorzichtig doorstroomd voldoende Accutase in de microbuisjes vullen (~ 50 pi) en laat bij kamertemperatuur incuberen gedurende 10 minuten. </li><li> Maak een spuit voorgevuld met 1 ml van de groei media (79% RPMI, 20% FBS, 1% penicilline streptomycine) en perfuseren in microbuisjes, het verzamelen van afvalwater in weefselkweek goed behandeld plaat. </li><li> Kweekcellen bij 37 ° C en 5% CO2 onder vochtige omstandigheden. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Het doel van deze techniek is levensvatbare kankercellen isoleren uit het bloed van patiënten met kanker. Er bestaan ​​verschillende manieren om kankercellen te herkennen in cultuur; een noodzakelijke controle van het apparaat succes. We hebben gekozen cellen in kweek vlek met antilichamen tegen epitheliale groepen zoals EpCAM (epitheliale cellulaire adhesie molecule) of PSMA (prostaat-specifiek antigen membraan) naast DAPI intacte celkernen (Fig. 2 en 3) bepalen. Het aantal kankercellen opgenomen met deze techniek noodzakelijk een functie van het aantal CTC in de uitgangsmonster en variabiliteit kan hoog zijn. Bij de verwerking monsters van patiënten met kanker fase IV wij routinematig vangen tussen 100 en 500 kankercellen per buis bloed op zuiverheid&gt; 50%. Onmiddellijk na isolatie, kan een groter aantal van besmetting van leukocyten aanwezig zijn. Maar deze aantallen wordt uitgeput volgende incubatie in kweekmedium voor maximaal 5 dagen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <strong&gt; Figuur 1. Schematische voorstelling van gefunctionaliseerde microbuisjes voor CTC isolatie, met selectine-gemedieerde rollen, gevolgd door antilichaam-gemedieerde statische hechting. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> Figuur 2. Vertegenwoordiger gegevens van CTC isolatie van bloedmonsters van een borstkanker patiënt en een longkanker patiënt. Het aantal levensvatbare cellen geïdentificeerd als CTC op EpCAM kleuring wordt vertegenwoordigd door de vaste staven en hebben betrekking op de linker coördineren en het percentage cellen werden geïdentificeerd als CTC vergelijking met het totale aantal cellen opgenomen wordt vertegenwoordigd door de open staven en gemeten rechts ordinaat. De resultaten worden vijf dagen in kweek. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> Figuur 3. Representatieve microfoto van verschillende donoren (A en B) van CTC in cultuur 5 dagen na het isolativerlengde van een kankerpatiënt bloedmonster. Cellen werden fluorescerend gekleurd EpCAM met AlexaFluor 488 (groen) en 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) van de kern (blauw) zichtbaar.

<ol><li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li>
<li>Hughes, A. D., King, M. R. Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHughes%2C+AD+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22">Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology</a>. , (2011).</li>
<li>Hughes, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtube+Device+for+Selectin-Mediated+Capture+of+Viable+Circulating+Tumor+Cells+from+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood.</a> Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).</li>
<li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+naturally+occurring+halloysite+nanotubes+for+enhanced+capture+of+flowing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells.</a> Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).</li>
<li>Al-Mehdi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+origin+of+metastasis+from+the+proliferation+of+endothelium-attached+tumor+cells%3A+a+new+model+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis.</a> Nat. Med. 6, 100-102 (2000).</li>
<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+Building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: Building a framework.</a> Cell. 127, 679-695 (2006).</li>
<li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).</li>
<li>Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectins+and+selectin+ligands+in+extravasation+of+cancer+cells+and+organ+selectivity+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).</li>
<li>Geng, Y., Marshall, J., King, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomechanics+of+the+Metastatic+Cascade%3A+Tumor+Cell-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 Forthcoming.</li>
<li>Stott, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).</li>
</ol>

MRK is een wetenschappelijke adviseur van CellTraffix, Inc (Rochester, NY).

Het is vaak het geval dat de eerste stappen in de ontdekking van nieuwe kanker medicijnen gebruik maken van cellijnen, die de vraag gelijkenis met primaire kankercellen te dragen nog in gebruik blijven als gevolg van hun gebruiksgemak in het laboratorium. Onderzoek naar de ontwikkeling van nieuwe kankertherapieën zou worden versneld als de primaire menselijke kankercellen werden in het begin van nieuw onderzoek gebruikt. CTC de meest toegankelijke type kanker cellen, vanwege hun aanwezigheid in het bloed en het gemak van een standaard bloedafname. Daarnaast circulerende tumorcellen vormen een noodzakelijke stap in het proces van metastasering 5,6, zodat de relevantie ervan voor de ziekte en het nut voor het richten van nieuwe geneesmiddelen is duidelijk. Isolatie van CTC uit bloed in vitro wordt bemoeilijkt door de lage concentraties: in de orde van een per miljoen leukocyten of een per miljard erythrocyten 7. De meerderheid van de huidige methoden voor het opsporen van CTC in het bloed, met inbegrip van de enige door de FDA goedgekeurde techniek Cell<html> Zoeken (Veridex), beschadigen of vernietigen cellen in het detectie proces, zich verzet tegen het gebruik buiten opsomming. De hierboven beschreven methode niet ten koste gaat levensvatbaarheid van de cellen en dus opent de deur voor toekomstige klinische onderzoek naar kanker. Als het herstel van intacte cellen is het doel van deze techniek, is het noodzakelijk dat cellen met zorg worden behandeld, vooral tijdens het bloed gescheiden stappen. Er zijn een aantal instelbare parameters in dit systeem kan worden aangepast aan verbeterde opbrengst afhankelijk essentiële kenmerken zoals kanker soort bereikt. In de hierboven beschreven stappen waren we gekozen EpCAM als een CTC specifiek antilichaam voor alle soorten kanker, behalve bij de verwerking prostaatkanker monsters, waarbij anti-PSMA gebruikt. Verdere substituties van kanker-specifieke antilichamen zeker worden gebruikt om de prestatie van individuele patiënten te verbeteren. Bovendien kan selectine en antilichaam concentraties worden gewijzigd om daaronder het afvangen 8 te verbeteren. &quot;&gt; Een essentieel kenmerk van het apparaat is de integratie van E-selectine moleculen op het oppervlak. E-selectine wordt normaal gesproken uitgedrukt op de luminale oppervlak van endotheelcellen en functie om snel bewegende leukocyten aantrekken naar sites van de ontsteking. Flowing leukocyten binden tijdelijk aan selectine moleculen, resulterend in een tragere rollen gedrag langzamer sterkere binding van de cel aan het endotheel van integrinen vergemakkelijkt. overtuigend experimenteel bewijs dat doet het geval dat CTC kan extravasaat door een gelijkaardig mechanisme 9,10. het opnemen van selectine ook kan het apparaat voor gebruik op grotere debieten, de tarieven die anders zouden cellen te voorkomen dat de binding aan antilichamen 11. Dus ons apparaat bootst een fysiologisch venule om biomimetically vloeiende CTC vast te leggen zonder het toebrengen van cellulaire schade. Verbeterde werking van het apparaat kan worden toegeschreven aan de toevoeging van de halloysiet buisje coating op het oppervlak luminalevan de inrichting. Eerdere studies hebben aangetoond dat er drie belangrijke componenten van de nanobuis coating die zorgt voor een verbeterde functionaliteit. Ten eerste, de nanobuis coating zorgt voor grotere oppervlakte, waardoor meer eiwit afzetting op het oppervlak 4. Ten tweede, bij het uitvoeren van atomaire kracht microscopie op het nanobuisje coating hebben we vastgesteld dat individuele nanotubes boven het oppervlak uitsteken in de stroom. Hierdoor selectine moleculen worden gepresenteerd liefst een micron boven de grond, zodat cellen kunnen worden vastgelegd en aangetrokken naar het oppervlak eerder in hun baan door de buis 4. Ten slotte halloysiet buisje coating kan leukocytadhesie voorkomen en verspreiding op het oppervlak zodat een beperkt aantal leukocyten met de CTC opgevangen en dus meer latere CTC zuiverheden 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> 300 um ID slangen </td><td> Braintree Wetenschappelijk </td><td> MRE025 </td></tr><tr><td> Grotere slangen voor aansluiting op de spuit </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> 1507L </td></tr><tr><td> 5 ml spuit voor pomp </td><td> BD </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Connector kleine tot grote slang </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> P-770 </td></tr><tr><td> Connector grote slang op de spuit </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> F-120 en P-659 </td></tr><tr><td> Spuit voor microbuisjes (3/10cc insulinespuit U-100 29g 1/2 &#39;) </td><td> BD </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> MP Biomedicals LLC </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol-Paque Plus </td><td> GE Healthcare Bio-Wetenschappen AB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC lysis buffer (Buffer EL, 1000ml) </td><td> Qiagen </td><td> 1014614 </td></tr><tr><td> Proteïne G, 5 mg </td><td> Calbiochem (calbiochem.com) </td><td> 539303 </td></tr><tr><td> Human EpCAM/TROP-1 Antilichaam </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> PSMA antilichaam (GCP-04) </td><td> abcam </td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> Platen met 96 putjes (Microtest 96) </td><td> BD Falcon </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> Blotting Grade Blocker niet-vette droge melk, 300 g </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 216005508 </td></tr><tr><td> Halloysiet Nanobuisjes </td><td> NaturalNano </td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td> Calciumcarbonaat, 5g </td><td> Aldrich Chemie </td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> RPMI-medium 1640 </td><td> Gibco </td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td> Poly-L lysine 0,1% w / v in water </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920-100ML </td></tr><tr><td> Sonic Dismembrator </td><td> Fisher Scientific </td><td> Model 100 </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Atlanta Biochemicals </td><td> S11056H </td></tr><tr><td> Penicilline Streptomycine </td><td> Sigma Life Siiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

snelle isolatie van viable circulerende tumorcellen van de patiënt blood samples

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Circulerende tumorcellen (CTC) zijn cellen die te verspreiden van een primaire tumor in de bloedsomloop en dat kan uiteindelijk secundaire tumoren vormen op verre locaties. CTC telling kunnen worden gebruikt om progressie basis van de correlatie tussen CTC concentratie in het bloed en ernst van de ziekte 1 volgt. Als een behandeling tool, kan CTC worden bestudeerd in het laboratorium om gepersonaliseerde therapieën te ontwikkelen. Daartoe moet de isolatie CTC geen cellulaire schade, en vervuiling door andere cellen, met name leukocyten veroorzaken, worden zo veel mogelijk twee vermeden. Veel van de huidige technieken, met inbegrip van de enige door de FDA goedgekeurde apparaat voor CTC opsomming, te vernietigen CTC als onderdeel van de isolatie proces (zie voor meer informatie Ref. 2). Een microfluïdische apparaat levensvatbare CTC vangen beschreven, bestaande uit een oppervlak gefunctionaliseerd met E-selectine glycoproteïne naast antilichamen tegen epitheliale markers 3. Om het apparaat prestaties te verbeterenMance een nanodeeltje coating werd aangebracht bestaande uit halloysiet nanobuisjes, een aluminosilicaat nanodeeltjes geoogst van klei 4. De E-selectine moleculen vormen een middel om snel bewegende CTC die worden gepompt door het apparaat te lenen een voordeel ten opzichte van alternatieve microfluïdische apparaten waarin langere doorlooptijden die nodig zijn om target cellen te voorzien van voldoende tijd om te communiceren met een oppervlakte vast te leggen. De antilichamen epitheliale doelen voorzien CTC specificiteit van de inrichting alsmede een gemakkelijk instelbare parameter aan isolatie af te stemmen. Ten slotte is de halloysiet nanobuis coating voor sterk verbeterde isolatie ten opzichte van andere technieken door te helpen bij snel bewegende cellen vast te leggen, het verstrekken van grotere oppervlak voor eiwit adsorptie, en afstoten besmetten leukocyten 3,4. Dit apparaat wordt geproduceerd door een eenvoudige techniek met behulp van kant-en-klare materialen en is met succes gebruikt om kankercellen te vangen uit het bloed van uitgezaaidekankerpatiënten. Gevangen cellen worden gehandhaafd tot 15 dagen in cultuur na isolatie, en deze monsters bestaan ​​meestal uit van&gt; 50% levensvatbare primaire kanker cellen van elke patiënt. Dit apparaat is gebruikt om levensvatbare CTC vast te leggen van zowel verdund volbloed en buffycoat monsters. Uiteindelijk presenteren we een techniek met functionaliteit in een klinische setting om gepersonaliseerde kanker therapieën te ontwikkelen.

Circulerende tumorcellen worden geïsoleerd uit het bloed van patiënten met kanker kan brengen zonder dat cellulaire schade. Isolatie van tumorcellen vindt plaats via een bimoleculaire oppervlak van E-selectine naast antilichamen tegen epitheliale markers. Een nanobuis coating bevordert specifiek kankercellen hechting resulteert in een hoge capture zuiverheden.

Snelle Isolatie van Viable circulerende tumorcellen van de patiënt Blood Samples

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn cellen die vanuit een primaire tumor door het circulatiesysteem verspreiden en uiteindelijk secundaire ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van levensvatige, circulerende tumorcellen uit bloedmonsters. Begin met de voorbereiding van de isolatie-microbuisjes en isoleer vervolgens de buffy coat uit de bloedmonsters. Verwerk daarna de buffy coat via het gefunctionaliseerde microbuisje-apparaat.Oogst de gevangen cellen uit de microtube en houd de cultuur in stand door gebruik te maken van een apparaat dat fysiologisch een omgeving nabootst om circulerende tumorcellen (CTC's) biomimetisch op te vangen zonder cellulaire schade aan te richten. Deze techniek biedt functionaliteit in een klinische setting voor de ontwikkeling van gepersonaliseerde kankertherapieën. De belangrijkste voordelen zijn dat dit een eenvoudige techniek is die gebruikmaakt van algemeen beschikbare materialen en dat het het natuurlijke proces van vast weefsel nabootst zoals dat in bloedvaten voorkomt.Ik ben Mike King, associate professor biomedical engineering aan Cornell University; de procedure zal worden gedemonstreerd door Jeff Madison, een senior technicus uit mijn laboratorium. Het volgende protocol is bedoeld voor de productie van één enkel microbuisje: soniceer 250 µL van een 6,6% Halo site nano tube-oplossing. Gedurende 30 seconden wordt de oplossing gekoeld met koud water.Zuig na een tweede sonicatie de oplossing op in een spuit. Filtreer de oplossing via een spuitfilter van 0,45 micron in een schoon micro-centrifugebuisje. Vortex de nano-tube-oplossing periodiek.Om homogeniteit te waarborgen, neem een sectie van 50 centimeter micro rehan micro tubing. Snijd de opening van de microtube diagonaal af en plaats één uiteinde van de microtube in een klein IDEXX-adapterstuk, en plaats een spuitnaald in het andere uiteinde van de microtube. Om de microtube te reinigen, plaatst u het open uiteinde van de microtube in 70% ethanol en trekt u ongeveer 50 µL ethanol op in de spuit om de microtube te vullen en de ethanol uit de microtube te spoelen.Zuig een ruim volume gedestilleerd water op in de spuit. Koppel de spuit nu los van de microbuis, maak de spuit leeg en bevestig deze vervolgens opnieuw aan de microbuis. Zuig 50 µL van 0,02 gewichtspercentage op.Voeg polyol-lysine toe aan de microbuis en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur. Trek vervolgens 100 µL gefiltreerde nanobuisoplossing in de microbuis en incubeer drie minuten bij kamertemperatuur. Om de nanobuisoplossing uit te spoelen, trekt u 100 µL water door de microbuis en incubeert u dit een nacht bij kamertemperatuur; trek vervolgens 50 µL PBS door de microbuis, gevolgd door 50 µL van 10 µg/mL.Laat de Protein G-oplossing 90 minuten equilibreren bij kamertemperatuur. Pipetteer vervolgens 50 µL van de 5 µg/mL E-selectine IgG- en 50 µg/mL antilichaamoplossing in de microbuis. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur en blokkeer aspecifieke cellulaire adhesie met 5% melkeiwit.Incubeer vervolgens de PBS bij kamertemperatuur totdat de bloed- of buffy coat-monsters klaar zijn voor verwerking, 10 minuten voordat de microtube voor celisolatie wordt gebruikt. Neem 50 µL calciumverzadigde PBS op in een gehepariniseerde buis om de selectinemoleculen te activeren. Neem een bloedmonster van 10 mL af van een patiënt voor lymfocytenisolatie.Plaats 10 milliliter fol pack-oplossing in een centrifugebuis van 50 milliliter. Breng de 10 milliliter volbloedmonster voorzichtig over de oplossing aan en centrifugeer bij 2000 ×g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius met minimale vertraging. Draag vervolgens de buffy coat-laag over naar een nieuwe buis.Was de buffycoat met PBS en centrifugeer om de erytrocyten te laten bezinken. Resuspendeer de celpellets voorzichtig in 1 mL RBC-lysisbuffer en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 10 mL toe.Meng de PBS voorzichtig en pellet de cellen door centrifugatie. Resuspendeer de cellen voorzichtig in PBS-plus met behulp van IDEXX-adapters. Bevestig één uiteinde van de gefunctionaliseerde microbuis aan een spuit van vijf milliliter.Plaats de spuit op een spuitpomp en dompel het open uiteinde van de gefunctionaliseerde microbuis in de cel-suspensie. Verwerk de celsuspensie door de microbuis om de ongebonden en losjes gebonden cellen te verwijderen. Verplaats het open uiteinde van de microbuis naar een buis die PBS plus bevat.Trek 300 microliters PBS plus op in de spuit. Plaats vervolgens het open uiteinde van de microbuis in een schone buis. Koppel de spuit los van de microbuis en bevestig een spuit met acuate om voorzichtig acuate door te spoelen tot de microbuis gevuld is.Na een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur wordt een spuit met één milliliter groeimedium bevestigd, wordt de microtube geperfuseerd en wordt het effluent opgevangen in geschikte kweekplaten om vervolgens te worden gekweekt. De geïsoleerde cellen, circulerende tumorcellen, werden na vijf dagen geïsoleerd uit bloedmonsters van een patiënt met borstkanker en een patiënt met longkanker.In kweek. Deze preparaten werden gekenmerkt voor CTC-opvang op basis van kleuring voor het epitheliale celmolecuul epican; daarnaast werd de zuiverheid van de kernopvang berekend als het percentage cellen dat als CTC werd geïdentificeerd ten opzichte van het totale aantal opgevangen cellen. Deze afbeelding toont representatieve micrografieën van CTC's geïsoleerd van donoren A en B. Na vijf dagen in kweek werden de cellen fluorescent gekleurd voor EPAM met Alexa Fluor 4 88.De kernen werden gevisualiseerd door middel van DPI-kleuring. Na deze procedure kunnen levensvatbare CTC's en culturen worden gebruikt om patiëntspecifieke informatie te verkrijgen, zoals druggevoeligheid of de expressie van celmarkers. Bedankt voor het kijken en veel succes.

rapid-isolation-viable-circulating-tumor-cells-from-patient-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video describes a detailed protocol for isolating circulating tumor cells from the whole blood sample of a euthanized colorectal tumor mouse model. These isolated CTCs can be cultured and used for intended downstream analysis.

CTC Isolation from a Whole Blood Sample: A Method to Obtain CTCs from Murine Colorectal Cancer Model

Circulerende tumorcellen (CTC's) hebben aangetoond een belangrijke rol te spelen bij tumormetastase. Hier wordt een methode beschreven voor het isoleren en vermenigvuldigen van CTC's uit het volledige bloed van een syngene model van muistumoren met leverkanker (HCC) metastase.

Isolatie en Voortplanting van circulerende tumorcellen uit een muis Cancer

Een protocol om een poly (N--ISO propylacrylamide) (PIPAAm) gecoat microfilter voor een effectieve vangst en thermoresponsieve release van levensvatbare circulerende tumorcellen (CTC) wordt gepresenteerd te benutten. Deze methode maakt het vangen van CTC uit het bloed van de patiënt en de daaropvolgende vrijlating van levensvatbare CTC voor downstream off-chip cultuur, analyses en karakterisering.

Capture and Release van levensvatbare circulerende tumorcellen van Blood

We beschrijven de oprichting van orthotopische colorectale tumoren via injectie van tumorcellen of organoïden in de cecum van muizen en de daaropvolgende isolatie van circulerende tumorcellen (CTC's) uit dit model.

Isolatie van circulerende tumorcellen in een orthotopische muismodel van colorectale kanker

Dit protocol is te herstellen en zeldzame doelcellen een mengsel met de doelsoort achtergrond cellen voorbereiden moleculaire genetische karakterisering op het niveau van één cel. DNA kwaliteit is gelijk aan niet-behandelde afzonderlijke cellen en zorgt voor eencellige toepassing (beide screening gebaseerd en gerichte analyse).

Target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige Downstream karakterisering

Hier presenteren we een geïntegreerde workflow om fenotypische en moleculaire kenmerken te identificeren die circulerende tumorcellen (CTCs) karakteriseren. Wij combineren levende immunokleuring en robotachtige micromanipulatie van enige en geclusterde CTCs met enige cel-gebaseerde technieken voor stroomafwaartse analyse en beoordeling van metastasen-zaait capaciteit.

Micromanipulatie van circulerende tumor cellen voor downstream moleculaire analyse en gemetastaseerde potentiële beoordeling

Het kweken van CTC's maakt een diepere functionele karakterisering van kanker mogelijk, door specifieke markerexpressie te testen en resistentie tegen geneesmiddelen en het vermogen om de lever te koloniseren te beoordelen, naast andere mogelijkheden. Over het algemeen zou de CTC-cultuur een veelbelovend klinisch hulpmiddel kunnen zijn voor gepersonaliseerde geneeskunde om de uitkomst van de patiënt te verbeteren.

Circulerende tumorcellijnen: een innovatief hulpmiddel voor fundamenteel en translationeel onderzoek

Dit artikel beschrijft de toepassing van geautomatiseerde apparatuur om stoffen, zoals celvrij DNA en circulerende tumorcellen, eenvoudig en efficiënt te scheiden en te verzamelen uit volbloed.

Automatische scheiding en verzameling van kankergerelateerde stoffen uit klinische monsters

De klinische microfluïdische chip is een belangrijke biomedische analysetechniek die de voorbewerking van bloedmonsters van klinische patiënten vereenvoudigt en immunofluorescentiekleurig circulerende tumorcellen (CTC's) in situ op de chip kleurt, waardoor een snelle detectie en identificatie van een enkele CTC mogelijk is.

Klinisch microfluïdisch chipplatform voor de isolatie van veelzijdige circulerende tumorcellen

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn van cruciaal belang voor de studie van kankerprogressie en metastase. Dit artikel presenteert een high-throughput, geïntegreerd protocol voor CTC-verrijking en single-CTC-sequencing, waardoor de opname-efficiëntie en CTC-zuiverheid worden verbeterd en tegelijkertijd de contaminatie- en sequencingkosten worden verlaagd, waardoor precisie-oncologisch onderzoek en klinische toepassingen worden bevorderd.

Op microfluïdica gebaseerde high-throughput circulerende tumorcelsortering en single-cell sequencing-technologie

Hier presenteren we een protocol om de isolatie van zeldzame kankercellen uit een geconstrueerd monster met volbloed en spiked in longkankercellen te illustreren. Het protocol maakt gebruik van een semi-geautomatiseerd, labelvrij celisolatieplatform. Verrijkte cellen worden vervolgens geanalyseerd op mutaties in de epidermale groeifactorreceptor met behulp van druppeldigitale PCR.

Profilering van epidermale groeifactor-DNA-mutaties in circulerende zeldzame cellen met behulp van een celisolatiesysteem en druppeldigitale PCR

Leer een methode om levensvatbare circulerende tumorcellen te isoleren uit bloedmonsters van kankerpatiënten met een gefunctionaliseerde microbuis. Deze techniek bootst fysiologische omstandigheden na voor hoge opbrengst zonder celbeschadiging.

Snelle Isolatie van Viable circulerende tumorcellen van de patiënt Blood Samples

Meer video's verkennen