Name: Deux et trois dimensions imagerie de cellules vivantes de protéines endommagent lADN de réponse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Découvrez l'imagerie cellulaire en 2D et 3D pour étudier la réponse à l'endommagement de l'ADN et la dynamique des protéines comme 53BP1 pendant la mitose. Cette méthode permet d'analyser les relations spatio-temporelles des protéines en temps réel.

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Soutenu en partie par R01NS064593 et ​​R21ES016636 (KV). Microscopie a été réalisée à l&#39;engagement - Département de Neurobiologie de microscopie &amp; anatomie, pris en charge, en partie, grâce au financement du NIH-NINDS Centre cœur 5P30NS047463 subvention. Le microscope confocal à disque rotatif a été acheté avec un prix NIH-NCRR (1S10RR027957).

Préparation des cellules A. <ol><li> Humaines normales (fibroblastes primaires GM02270) ont été obtenus à partir du référentiel cellulaire Coriell, Camden, New Jersey, et a immortalisé avec hTERT 6. Les cellules ont été cultivées et développées dans CELLSTAR de 6 cm plats dans les médias (4 ml) constitués de MEM supplémenté avec 20% de sérum de veau foetal (Gibco), non-essential/essential acides aminés, de vitamines, de pyruvate de sodium, et de la pénicilline / streptomycine (HyClone ). </li><li> De rein embryonnaire humain 293 (HEK293), les cellules ont été obtenues à partir de l&#39;American Type Culture Collection et pris de l&#39;ampleur en CELLSTAR 6-vaisselle cm. Les cellules ont été maintenues dans les médias (4 ml) constitué de DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal, non-acides aminés essentiels, de L-glutamine et de la pénicilline / streptomycine. </li><li> 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Addgene plasmide 19836) et H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene 17735 plasmide) gène de fusion constructions exprimant également la puromycine ou des gènes de résistance au G418, respectivement, ont été transduites (fibroblam) ou transfectées (HEK293) en utilisant SuperFect (Qiagene) dans les cellules et maintenu sous la sélection des médicaments. Entretien de la fluorescence a été vérifiée périodiquement. </li><li> 24-48 heures avant l&#39;acquisition des images, les cellules ont été traitées à la trypsine dans une suspension à cellule unique et ensemencées à faible densité de 3,5 cm sur FluroDish plaques à fond de verre. </li></ol> Configuration Microscope B. et d&#39;acquisition d&#39;images Ce protocole a été développé en utilisant la cellule Zeiss Observer SD microscope confocal à disque rotatif équipé d&#39;un AxioObserver Z1 stand, un dual-channel Yokagawa CSU-X1A modèle 5000 disque de rotation, 2 Photometrics QuantEM 512SC caméras EMCCD, un HXP 120C à base de fibres d&#39;éclairage, 4 lasers (un Lasos 100mW multi-lignes argon [458, 488, 514 nm], 50 mW nm diode 405, 40 mW nm diode 561, et 30 mW diode 635 nm), AOTF, un Pecon XL multiS1 système d&#39;incubation stade, l&#39;incubation Zeiss modules (Module O 2 S, CO 2 Module S, S TempModule, chauffage Unité XL S) et un pré motorized XY avec un insert NanoScanZ piézo Z. Pour minimiser les aberrations sphériques tandis que les cellules vivantes d&#39;imagerie supporté dans un milieu aqueux, un C-Apochromat 63x/1.20 eau / Corr lentille d&#39;objectif et Zeiss Immersol fluide d&#39;immersion W (avec un indice de réfraction n = 1,334) ont été utilisés. Pour 2 canaux imagerie confocale, une RQFT 405/488/568/647 miroir dichroïque et BP525/50 (vert) et BP629/62 (rouge) filtres d&#39;émission ont été utilisés. Le logiciel du système utilisé était Zeiss AxioVision (ver. 4.8.2.0) avec AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, physiologie, MosaiX, Mark &amp; ​​Find, double caméra, l&#39;intérieur de 4D, autofocus et modules Déconvolution 3-D. <ol><li> Veiller à ce que le gaz CO 2 est en marche pour le CO 2 Module du système d&#39;incubation. Si le microscope est supporté par une table anti-vibration de l&#39;air, allumer l&#39;alimentation en air (ou gaz N 2) de la table d&#39;air. </li><li> Tournez sur la puissance du statif du microscope, unité de disque en rotation, caméras, modules d&#39;incubation, illuminateur HXP, platine motorisée, Argonlaser, et l&#39;ordinateur. </li><li> Après 1 min de temps de préchauffage, tournez la clé de contact pour le laser Argon sur &quot;On&quot;. </li><li> Sur le panneau de commande du laser Zeiss, mettez les commutateurs pour les lignes laser à utiliser. </li><li> Mettez le commutateur à bascule pour le contrôleur Lasos laser argon de «veille» à «run laser&quot; et régler le contrôleur de lumière au niveau optimal (c&#39;est à dire juste en dessous du point où le voyant vert s&#39;allume en rouge). </li><li> Démarrez le logiciel AxioVision. Remarque: l&#39;interface utilisateur pour AxioVision peut être personnalisé avec des menus et fenêtres déroulant qui sont spécifiques pour le microscope particulier et les composants qu&#39;il contrôle. Ainsi, chaque système possède une interface potentiellement unique. Par conséquent, des instructions générales pour la manipulation des logiciels sont fournis dans les étapes suivantes, plutôt que de directions pour les fenêtres, les onglets de logiciels spécifiques et / ou des menus déroulants. </li><li> Environ 1 heure avant l&#39;imagerie, dans le logiciel, repérez les contrôles de l&#39;incubateur etallumer le chauffage de la chambre supérieure et la plaque de platine. Réglez la température à 37 ° C. Allumez le CO 2 de contrôle et de régler le niveau à 5%. </li><li> Sélectionner la lentille d&#39;objectif pour l&#39;imagerie. Dans cette étude, une 63x/1.20 NA C-Apochromat Eau / Corr objectif a été utilisé. Remarque: Pour cet objectif, un milieu d&#39;immersion avec un indice de réfraction similaire à l&#39;eau (Zeiss Immersol liquide d&#39;immersion W) est nécessaire. </li><li> Si plusieurs positions distinctes doivent être échantillonnées sur une longue période de temps, être certain d&#39;appliquer une quantité suffisante de milieu d&#39;immersion afin de s&#39;assurer qu&#39;il est réalisé à partir d&#39;une position à une autre. </li><li> Placer la capsule sur la scène et mettre en place la lentille d&#39;objectif en contact avec le fond. </li><li> À l&#39;aide des commandes du microscope ou du logiciel, diriger la lumière émise vers les oculaires et sélectionnez le champ large du filtre définie pour le signal de fluorescence d&#39;intérêt (pour cette étude, &quot;rouge&quot; filtre définie pour 53BP1 et un &quot;GFP&quot; filtre définie pour H2B ). &lt;/ Li&gt; <li> Voir à travers les lentilles oculaires, focaliser l&#39;image, et localiser un champ approprié de cellules. </li><li> En utilisant soit le logiciel ou les commandes de microscope, diriger la lumière émise à l&#39;écart des oculaires vers le port avec l&#39;unité de disque en rotation confocale. </li><li> Dans le logiciel, mettez le laser approprié (pour cette étude, le laser 561 nm pour 53BP1 et la ligne de 488 nm du laser Argon pour H2B). </li><li> Pour chaque canal, régler l&#39;intensité du laser en réglant le filtre acousto-optique accordable (AOTF) de commande à un niveau approprié. </li><li> Sélectionnez le miroir dichroïque appropriée (RQFT 405/488/568/647) et filtres d&#39;émission (BP 629/62 pour 53BP1 et BP 525/50 pour H2B). Ouvrir l&#39;obturateur de l&#39;unité de disque en rotation. </li><li> Sélectionnez la page &quot;Live&quot; fenêtre pour afficher le champ de vue actuel. </li><li> Dans le logiciel, ouvrez le &quot;Camera&quot; de commande, sélectionnez la caméra à utiliser (si un système de double caméra) et régler le temps d&#39;exposition d&#39;environ 100 ms. Régler le% EM et acquérir le necRemarque saire:. La construction 53BP1-mCherry semble un peu faible. Nous avons trouvé utile d&#39;augmenter le gain EM. </li><li> Dans le logiciel, ouvrir la commande de l&#39;unité de disque en rotation confocale et régler la vitesse de rotation du disque en saisissant le temps d&#39;exposition caméra qui a été fixé pour capturer une image convenable (par exemple ~ 100 ms). Cliquez sur &quot;Set&quot; pour verrouiller le changement. </li><li> Ouvrez &quot;multi-dimensionnelle d&#39;acquisition». Sélectionnez l&#39;onglet canal et de charger / sélectionner les canaux appropriés. Pour cette étude, nous utilisons les canaux définis pour dsRED (561 nm et une excitation laser BP 629/62 pour filtre d&#39;émission) et la GFP (488 nm ligne laser pour l&#39;excitation et BP525/50 filtre pour l&#39;émission). </li><li> Pour assurer l&#39;enregistrement d&#39;image, un miroir dichroïque commune (RQFT 405/488/568/647) a été utilisé pour les deux canaux. Réglez le logiciel à la section «Autofocus». Remarque: Allez dans Outils → Paramètres rédacteur en chef pour ajuster les paramètres MDA. Assurez-vous que la puissance du laser est suffisante («la puissance du laser adéquate» fait référence à un paramètre qui vous permetpour exciter le fluorophore approprié tout en minimisant les photo-blanchiment). </li><li> Dans la fenêtre MDA, sélectionnez l&#39;onglet z-pile. Sélectionnez &quot;Z-stack à la position focus courant&quot;. Définissez la plage d&#39;environ 10 um Z-stack et choisissez &quot;optimale&quot; pour le nombre de mesures pour s&#39;assurer d&#39;échantillonnage de Nyquist par Z. Remarque: La taille exacte de la z-pile dépendra de la hauteur de vos cellules. Ajustez en conséquence. </li><li> 23. Cliquez sur &quot;Démarrer&quot; et d&#39;analyser le résultat z-pile d&#39;images pour s&#39;assurer que les réglages sont appropriés pour ce que vous étudiez (par exemple, dans cette étude, il était important de l&#39;image du noyau entier). </li><li> Sélectionnez le &quot;T&quot; (temps) onglet. Pour notre expérience avec la camptothécine, nous avons mis l&#39;intervalle entre les points de temps d&#39;imagerie à 5 min et la durée totale de la session pendant 1 heure pour un contrôle (cellules non traitées) vidéo. Remarque: afin de minimiser photo-blanchiment des cellules, l&#39;expérience doit être configuré de sorte que l&#39;AOTF flans le laser entre des instants d&#39;imagerie. </li><li> Faou multi-point imagerie de plusieurs cellules dans le plat, dans la fenêtre MDA, sélectionnez l&#39;onglet position. Veiller à &quot;Appliquer&quot; réglage avant / après le point de temps la position par &quot;est cochée. Sélectionnez &quot;Mark_Find&quot;. En utilisant le &quot;Live&quot; point de vue, déplacer la parabole et de sélectionner les champs appropriés de vue. </li><li> Cliquez sur &quot;Démarrer&quot; dans le menu multi-dimensionnelle d&#39;acquisition pour commencer l&#39;expérience et enregistrer une vidéo de contrôle (des cellules non traitées). </li><li> Après la vidéo de contrôle, ajoutez le traitement approprié (dans ce cas, 10 camptothécine uM). Nous avons enregistré l&#39;expérimental (cellules traités avec le médicament) vidéo à intervalles 5-10 min pendant 2-4 heures. Remarque: Une question importante à considérer est la rapidité avec laquelle se produit un effet donné après le traitement. Comme on le voit dans la vidéo, 53BP1 foyers commencent à partir de ~ 5 minutes après l&#39;addition du CPT. Même si un processus relativement simple, l&#39;ajout de médicaments à l&#39;antenne manuellement et re-calibrer le microscope prend du temps. Il faut tenir compte lors de la conception de cette expérience. </li><li> Pour la surveillance des mitosis, nous avons mis l&#39;intervalle de 7,5 min et enregistré pendant 4-5 heures (les paramètres spécifiques dépendent de la lignée cellulaire utilisée et la durée de son cycle cellulaire). Ajustements pourraient devoir être prises pour éviter la photo-blanchiment au cours de longs enregistrements. </li></ol> C. Traitement de l&#39;image et de l&#39;analyse Ce protocole a été développé à l&#39;aide du logiciel Volocity (PerkinElmer). Le logiciel utilisé pour l&#39;acquisition de ces données (AxioVision) a également la capacité de traiter et d&#39;analyser les images. Les utilisateurs sont encouragés à utiliser le logiciel mis à leur disposition, et consulter la documentation appropriée concernant leur application. <ol><li> Ouvrez le logiciel Volocity. Créer et nommer une nouvelle bibliothèque, et d&#39;importer vos fichiers vidéo. </li><li> Pour visualiser les fichiers, nous trouvons généralement le plus utile d&#39;utiliser le &quot;Focus étendue&quot; réglage. Cette superpose les tranches z-stack et, par ce protocole, nous permet de visualiser les foyers 53BP1 dans les différents domaines du noyau. </li><li> Ajuster les vidéos selon les besoins. Volocity est équipé d&#39;une gamme d&#39;outils pour améliorer la qualité des images acquises. En s&#39;assurant que les paramètres du microscope étaient appropriées, beaucoup de temps peut être sauvé dans l&#39;édition tard. Souvent, il est utile de déconvolution vos images et ajuster la luminosité / contraste. Vos besoins d&#39;édition spécifiques varieront en fonction de l&#39;expérience. </li><li> Ajouter un horodatage relatif et barre d&#39;échelle. </li><li> Pour afficher les cellules en 3-D, passez au «3-D Opacité&quot; réglage. Cela permet la rotation des cellules 3-D rendus dans l&#39;espace, offrant ainsi des perspectives multiples de structures d&#39;intérêt dans les cellules. Remarque: Il est utile de visualiser les cellules dans des plans différents pour déterminer où les structures de voyage intérêt. Par exemple, dans le &quot;Focus étendue&quot; réglage, il est difficile de discerner que le 53BP1 ne, en effet, dissocier de l&#39;ADN pendant la mitose. Toutefois, cela est évident en 3-D. </li><li> Les films et les images fixes peuvent être exportées dans une variété de types de fichiers en fonction des préférences de l&#39;utilisateur. </l<html> i&gt; </ol> D. Représentant Résultats Un exemple de 53BP1 foyers en réponse au CPT est illustré à la figure 1. Des cellules exposées à l&#39;intérieur des foyers CPT forme 5-10 min, et de maintenir ces foyers pendant toute la durée de l&#39;enregistrement. Comme le montre la figure 2, 53BP1 dissocie de la chromatine au début de la mitose, la formation d&#39;une fine brume autour des chromosomes condensation. En télophase et la mitose se produit arrive à son terme, une fois de plus 53BP1 agrégats dans les foyers distincts. Alors que les cellules HEK293 n&#39;ont pas été exposés au CPT, ils ont néanmoins formé en abondance, des foyers de réparation spontanée générée par 53BP1 dommages à l&#39;ADN endogène. Cette observation nous a permis de conclure que 53BP1 ne pas former des foyers durant la mitose précoce, en accord avec un précédent rapport montrant un effet similaire après l&#39;exposition des cellules aux radiations ionisantes et les drogues radiomimétiques 5. ure 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Camptothécine (10 pM) provoque CDB et 53BP1 formation de foyers dans le cyclisme fibroblastes dans les 30 minutes de l&#39;ajout de la drogue dans le milieu. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> Figure 2. 53BP1 ne pas former des foyers durant la mitose jusqu&#39;à telophase/G1 dans les cellules HEK293.

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Maintien de l&#39;intégrité génomique est essentielle à la survie cellulaire. Le défaut de préserver les résultats du génome dans le vieillissement prématuré, la carcinogenèse, ou la mort 8. Il ya un intérêt intense pour discerner comment les fonctions de DDR, découlant de son importance à la recherche fondamentale et clinique. De nombreuses techniques ont été développées au fil des ans afin d&#39;aider à l&#39;étude de la façon dont les cellules détecter et réparer les dommages à l&#39;ADN. Les méthodes trad...

<table border="1"><tbody><tr><td> Produit </td><td> Entreprise </td></tr><tr><td> Des boîtes de culture CELLSTAR </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> FluroDish plats à fond de verre </td><td> Mondiale Precision Instruments, Inc </td></tr><tr><td> MEM médias </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Non-acides aminés essentiels </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Les acides aminés </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitamines </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; 19836 plasmide </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; 17735 plasmide </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss cellulaire Observer SD Système d&#39;imagerie </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (version 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W Oil </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity logiciel (version 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

deux et trois dimensions imagerie de cellules vivantes de protéines endommagent l&#39;adn de réponse

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Des cassures double brin (CDB) de l&#39;ADN sont les plus délétères des lésions d&#39;une cellule peut rencontrer. Si laissé non réparés, CSD port un grand potentiel pour générer des mutations et des aberrations chromosomiques 1. Pour éviter ce traumatisme de catalyser l&#39;instabilité génomique, il est crucial pour les cellules pour détecter les conseils scolaires de district, activer la réponse dommages à l&#39;ADN (DDR), et réparer l&#39;ADN. Quand ils sont stimulés, la DDR travaille à préserver l&#39;intégrité du génome en déclenchant l&#39;arrêt du cycle cellulaire pour permettre la réparation doit avoir lieu ou forcer la cellule à l&#39;apoptose. Les mécanismes prédominants de réparation des CDB se produire par recombinaison non homologue bout de jonction (NHEJ) et la réparation recombinaison homologue (HRR) (révisé en 2). Il existe de nombreuses protéines dont les activités doivent être précisément orchestrée pour le DDR pour fonctionner correctement. Nous décrivons ici une méthode pour le 2 - et 3-dimensions (D) Visualisation d&#39;une de ces protéines, 53BP1. La protéine p53 lie 1 (53BP1) se localise dans les zones deCDB en se liant aux histones modifiées 3,4, formant des foyers à 5-15 minutes 5. Les modifications des histones et de recrutement de protéines DDR 53BP1 et d&#39;autres vers des sites ORD sont censés faciliter le réarrangement structural de la chromatine autour des zones de dommages et contribuent à 6 réparation de l&#39;ADN. Au-delà de la participation directe à la réparation, des rôles supplémentaires ont été décrits pour 53BP1 dans le DDR, tels que la régulation de un point de contrôle intra-S, un point de contrôle G2 / M, et l&#39;activation de protéines en aval de DDR 7-9. Récemment, on a découvert que 53BP1 ne pas former des foyers en réponse à dommages à l&#39;ADN induits lors de la mitose, au lieu d&#39;attendre pour les cellules à entrer G1 avant de repérer à proximité du CSD 6. DDR protéines telles que 53BP1 ont été trouvés à associer avec des structures mitotiques (comme kinétochores) au cours de la progression à travers la mitose 10. Dans ce protocole, nous décrivons l&#39;utilisation de 2 - et 3-D imagerie des cellules vivantes pour visualiserla formation de foyers 53BP1 en réponse à l&#39;agent de détérioration d&#39;ADN camptothécine (CPT), ainsi que le comportement de 53BP1 lors de la mitose. La camptothécine est un inhibiteur de topoisomérase I qui provoque principalement CDB lors de la réplication d&#39;ADN. Pour ce faire, nous avons utilisé un décrit précédemment 53BP1-mCherry protéine de fusion fluorescente construire composée d&#39;un domaine protéique 53BP1 capable de se lier CDB 11. En outre, nous avons utilisé une histone H2B-GFP protéine de fusion fluorescente construire en mesure de suivre la dynamique de la chromatine au long du cycle cellulaire, mais en particulier lors de la mitose 12. Imagerie des cellules vivantes dans des dimensions multiples est un excellent outil pour approfondir notre compréhension de la fonction des protéines de DDR dans les cellules eucaryotes.

Ce protocole décrit une méthode pour visualiser un ADN de protéine cassures double-brin de signalisation activées en réponse aux dommages de l&#39;ADN ainsi que sa localisation au cours de la mitose.

Deux et trois dimensions imagerie de cellules vivantes de protéines endommagent l&#39;ADN de réponse

Les cassures double-brin (CDB) sont les lésions de l'ADN les plus délétères qu'une cellule puisse rencontrer. Si elles ne sont pas réparées, les CDB présentent un fort potentiel de génération de...

Cette démonstration utilise l'imagerie en cellules vivantes en 2D et 3D pour comprendre les relations spatiotemporelles des protéines impliquées dans la réponse aux dommages de l'ADN. Tout d'abord, transfectez ou transduisez votre lignée cellulaire de choix avec des constructions d'expression contenant des marqueurs fluorescents appropriés. Ici, M Cherry et GFP, puis acquérez une série de vidéos témoins montrant les cellules marquées fluorescentes dans des conditions normales.Appliquez ensuite un traitement approprié et enregistrez les données des effets du traitement sur le processus des cellules fluorescentes, puis analysez les données vidéo afin d'élucider les relations spatiotemporelles des protéines. En fin de compte, la microscopie en fluorescence sur cellules vivantes permet de détailler la dynamique cellulaire, comme la formation de foyers de 53 BP1 en réponse à des agents endommageant l'ADN ou le comportement de 53 BP1 durant la mitose. Notre intérêt pour l'imagerie en 2D et 3D a commencé lorsque nous avons souhaité étudier comment différents traitements influençaient la mitose dans certaines lignées cellulaires.Cette approche expérimentale nous permet d'étudier la réponse aux dommages de l'ADN et le maintien de la stabilité génomique plus facilement que les méthodes traditionnelles. De plus, vous pouvez utiliser cette méthode pour étudier comment certaines protéines interagissent dans diverses voies de signalisation et diverses lignées cellulaires. Le principal avantage de l'imagerie en temps réel par rapport aux techniques classiques telles que la cytochimie est qu'elle permet l'étude des protéines de réponse aux dommages de l'ADN en temps réel.Il peut être difficile d'optimiser les bonnes conditions d'enregistrement. Cette démonstration permet d'observer les nombreuses petites étapes nécessaires pour assurer le succès. N'oubliez pas que la persévérance porte ses fruits lorsqu'il s'agit de minimiser le photoblanchiment, de trouver les bons intervalles d'enregistrement et la durée d'enregistrement appropriée, entre autres.Transfecter ou transduire les lignées cellulaires appropriées avec les plasmides permettant l'expression des protéines de fusion mCherry et GFP. Maintenir les cultures sous sélection médicamenteuse et vérifier périodiquement l'expression des protéines fluorescentes la veille de l'acquisition des images. Récolter les cellules à l'aide de trypsine.Ensuite, ensemencer des cultures de faible densité dans des plaques de 3,5 cm avec fond en verre pour plat à fluorescence. Ce protocole a été mis au point à l’aide d’un microscope confocal à disque tournant Zeiss Cell Observer SD, équipé d’un support Axio Observer Z1. Tout d’abord, vérifier que le gaz CO₂ est acheminé vers le module CO₂ du système d’incubation. Si le microscope est installé sur une table anti-vibrations Airtable, alors mettre en marche l’alimentation en air de la Airtable.Activez maintenant l'alimentation pour le support du microscope, l'unité à disque rotatif, les caméras, les modules d'incubation, l'éclairage HXP, la platine motorisée, le laser argon et l'ordinateur. Allumez les interrupteurs des lignes laser à utiliser. Lancez le logiciel Axio Vision.Le logiciel Avision peut être personnalisé avec des fenêtres et des menus déroulants spécifiques au microscope et aux composants qu'il contrôle. Ainsi, chaque interface utilisateur peut présenter un aspect différent. Environ une heure avant l'acquisition d'images, repérez les commandes de l'incubateur et activez le chauffage de la chambre supérieure et de la platine.Régler la température à 37 degrés Celsius. Activer la commande de CO2 et régler le niveau à 5 %. Sélectionner l'objectif pour l'acquisition d'images dans cette étude. L'objectif nécessite l'utilisation d'un milieu d'immersion dont l'indice de réfraction est similaire à celui de l'eau.Si vous devez acquérir des images de plusieurs positions pendant de longues périodes, veillez à appliquer suffisamment de milieu d’immersion afin que le dispositif ne s’assèche pas. Placez la boîte de culture sur la platine et amenez l’objectif en contact avec le fond à l’aide des commandes du microscope ou du logiciel. Dirigez la lumière émise vers les oculaires et sélectionnez le jeu de filtres en champ large approprié pour le signal fluorescent d’intérêt.Observez maintenant à travers les oculaires. Mettez au point l'image et localisez un champ de cellules approprié à l'aide du logiciel ou des commandes du microscope. Dirigez la lumière émise vers le port équipé de l'unité confocale à disque tournant, au lieu des oculaires, dans le logiciel.Activez le laser approprié pour cette étude. Pour chaque canal, réglez l'intensité du laser en ajustant le contrôle du filtre optique accordable kuo à un niveau adéquat. Ensuite, sélectionnez le miroir dichroïque et les filtres d'émission appropriés.Ouvrez l'obturateur de l'unité à disque tournant. Sélectionnez maintenant la fenêtre d'observation en direct pour afficher le champ de vision actuel. Ouvrez ensuite la fenêtre de contrôle de la caméra.Sélectionnez la caméra à utiliser et réglez le temps d'exposition à environ 100 millisecondes. Ajustez le pourcentage et le gain EM selon les besoins. Ouvrez également la commande de l'unité de disque tournant confocale et réglez la vitesse du disque tournant en entrant le temps d'exposition de la caméra qui a été défini pour capturer une image appropriée.Cliquez sur « définir » pour verrouiller le changement. Ouvrez maintenant la fenêtre d'acquisition multidimensionnelle. Sélectionnez l'onglet canal et chargez ou sélectionnez les canaux appropriés définis pour les Flora Fours.Pour garantir l'inscription des images, utilisez un miroir dichroïque commun pour les deux canaux. Réglez le logiciel sur la mise au point automatique. Passez à la fenêtre MDA et cliquez sur l'onglet pile ZS.Sélectionnez la pile ZS à la position de focalisation actuelle. Réglez la plage pour une Zack de 10 microns et choisissez le nombre optimal de pas pour assurer un échantillonnage de Nyquist en profondeur Z. Cliquez maintenant sur démarrer et analysez l'image de la pile Z résultante. Sélectionnez l'onglet temps.Définissez l'intervalle entre les points temporels d'acquisition et la durée totale de la session. Pour l'acquisition multipoint de plusieurs cellules dans la boîte, ouvrez la fenêtre MDA. Sélectionnez l'onglet position et vérifiez que l'option appliquer les paramètres avant ou après chaque point temporel par position est activée.Maintenant, sélectionnez « marquer ». À l’aide de la vue en direct, déplacez la boîte et choisissez des champs appropriés. Cliquez sur « Démarrer » dans le menu d’acquisition multidimensionnelle pour commencer l’expérience et enregistrer une vidéo témoin.Procédez à l'ajout du traitement approprié et enregistrez la vidéo expérimentale à des intervalles de temps déterminés pendant une durée définie. Pour cette lignée cellulaire et afin de suivre l'ensemble du processus de mitose, nous avons utilisé un intervalle de sept minutes et demie pendant quatre à cinq heures. Vous devrez déterminer les paramètres spécifiques adaptés à votre lignée cellulaire et à l'objet de votre étude.Ouvrez le logiciel Velocity, créez et nommez une nouvelle bibliothèque, puis importez les fichiers vidéo expérimentaux pour visualiser les fichiers. Essayez d'utiliser le réglage de mise au point étendue et ajustez les vidéos selon les besoins. Velocity est doté d'une gamme d'outils permettant d'améliorer la qualité de vos images acquises.Si les paramètres du microscope sont appropriés, cela permettra de gagner beaucoup de temps ultérieurement lors de la retouche. Il est souvent utile de réduire la résolution de vos images et d'ajuster la luminosité et le contraste ; vos besoins spécifiques varieront selon votre expérience. Pour visualiser les cellules en 3D, passez au réglage d'opacité 3D.Ceci permet la rotation des cellules en 3D dans l'espace, offrant ainsi plusieurs perspectives des structures d'intérêt au sein des cellules. Films. Des images fixes peuvent être exportées vers divers types de fichiers selon les préférences de l'utilisateur Par rapport aux témoins. Les cellules de fibroblastes exposées au CPT ont formé des foyers en cinq à dix minutes et ont conservé ces foyers pendant toute la durée de l'enregistrement.Curieusement, dans les cellules rénales embryonnaires humaines, la protéine 53BP1 se dissocie de la chromatine au début de la mitose, formant un léger halo autour des chromosomes en condensation. Lorsque la télophase se produit et que la mitose prend fin, la protéine 53BP1 s'agrége à nouveau en foyers distincts. Nous espérons que cette vidéo vous permettra d'étudier les relations spatiotemporelles des protéines impliquées dans la réponse aux dommages de l'ADN ainsi que dans d'autres voies cellulaires.Par exemple, dans le domaine de la dynamique de la chromatine, cette technique a été utilisée pour étudier comment la liaison de 53 BP1 affecte le mouvement des extrémités télomériques de l'ADN. Après la création de cellules génétiquement modifiées, une imagerie en direct en deux et trois dimensions peut être réalisée en environ quatre à huit heures. Veillez à régler correctement les paramètres du microscope afin d'obtenir une imagerie optimale.

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Biologie

Dans cette vidéo, nous décrivons la méthode d’immunofluorescence pour visualiser la localisation des protéines de réparation de l’ADN γH2AX et 53BP1 aux sites de cassures d’ADN double brin dans les noyaux cellulaires irradiés.

Visualisation par immunofluorescence des interactions entre les protéines de réparation de l’ADN

Les lasers sont fréquemment utilisés dans les études de la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN. Cependant, ils génèrent des lésions dont l'espacement, la fréquence et les collisions avec les fourches de réplication sont rarement caractérisés. Nous décrivons ici une approche qui permet la détermination de ces paramètres avec réticule laser localisé interbrins.

Analyse des molécule laser Localisés psoralène adduits

Ici, il est démontré comment le dosage in situ de ligature de proximité (PLA) peut être utilisé pour détecter et visualiser les interactions directes protéines-protéines entre ATM et p53 dans des cultures de cellules en suspension exposées au stress génotoxique.

Détection et visualisation des complexes protéiques induits par endommagement de l&#39;ADN dans des cultures cellulaires en suspension utilisant l&#39;essai de ligature de proximité

Laser microirradiation est un outil utile pour l’étude de la réparation de l’ADN dans les cellules vivantes. Une approche méthodologique pour l’utilisation des lasers UVA pour induire diverses lésions de l’ADN est montrée. Nous avons optimisé une méthode pour microirradiation locale qui gère le cycle cellulaire normal ; ainsi, les cellules irradiées passent par mitose.

Avancée des Techniques de microscopie confocale afin d’étudier les interactions entre protéines et cinétique aux lésions de l’ADN

Ce protocole vise à décrire l’utilisation de laser microirradiation d’induire différents types de lésions de l’ADN, y compris relativement simples brins et lésions complexes, afin d’étudier l’ADN des dommages de signalisation et de réparation facteur Assemblée à sites de dommages in vivo .

Laser Microirradiation à l’étude In Vivo des réponses cellulaires aux dommages d’ADN simples et complexes

Confocal fluorescence microscopie et laser micro-irradiation offre des outils pour induisant des dommages à l’ADN et le suivi de la réponse des protéines de réparation d’ADN dans certaines zones Sub nucléaires. Cette technique a grandement avancer nos connaissances sur la détection des dommages causés, de signalisation et de recrutement. Ce manuscrit montre ces technologies afin d’examiner la réparation de rupture de brins simples et doubles.

Application de Micro-irradiation Laser pour examen du Single et Double brin pause réparation dans les cellules de mammifères

Étude cinétique de réparation des dommages ADN nécessite un système d’induire des lésions à des régions sub nucléaires définies. Les auteurs décrivent une méthode pour créer des sauts de double-brin localisées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’un laser à 405 nm et fournir des procédures automatisées afin de quantifier la dynamique des facteurs de réparation à ces lésions.

Enquête sur le recrutement de protéines aux lésions de l’ADN à l’aide de 405 Nm Laser Micro-irradiation

Réparation des cassures double brin de l’ADN est un processus dynamique, qui exige non seulement la formation de complexes de réparation sur les sauts, mais également leur résolution après que la lésion est adressée. Ici, nous utilisons la microscopie d’immunofluorescence pour les pauses bicaténaire transitoires et de longue durée comme outil de disséquer ce mécanisme de maintenance du génome.

Caractériser les processus de réparation de l’ADN à des cassures de l’ADN bicaténaires durables et transitoires de la microscopie par Immunofluorescence

Suite à des dommages à l’ADN, les cellules humaines activent des voies de réparation essentielles pour restaurer l’intégrité de leur génome. Ici, nous décrivons la méthode de l’immunofluorescence indirecte comme un moyen de détecter les protéines de réparation de l’ADN, d’analyser leur recrutement spatial et temporel, et d’aider à interroger l’interaction protéine-protéine sur les sites de dommages à l’ADN.

Visualisation de l’ADN Réparation des protéines Interaction par immunofluorescence

Cet article présente les étapes essentielles de immunoprecipitation d’immunostaining et de chromatine. Ces protocoles sont couramment utilisés pour étudier les processus cellulaires liés aux dommages à l’ADN et pour visualiser et quantifier le recrutement des protéines impliquées dans la réparation de l’ADN.

Visualisation et quantification des dommages à l’ADN spécifiques au site à base d’endonucléase

Ce protocole présente un nouveau système de gène rapporteur et la configuration expérimentale pour détecter la transcription aux ruptures double brin de l’ADN avec une sensibilité à une seule molécule.

Imagerie par cellules vivantes de l’activité transcriptionnelle lors de ruptures double brin d’ADN

Découvrez l'imagerie cellulaire en 2D et 3D pour étudier la réponse à l'endommagement de l'ADN et la dynamique des protéines comme 53BP1 pendant la mitose. Cette méthode permet d'analyser les relations spatio-temporelles des protéines en temps réel.

Deux et trois dimensions imagerie de cellules vivantes de protéines endommagent l'ADN de réponse

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