Deux et trois dimensions imagerie de cellules vivantes de protéines endommagent l'ADN de réponse

Cette démonstration utilise l’imagerie à deux cellules vivantes et en 3D pour comprendre les relations spatio-temporelles des protéines impliquées dans la réponse aux dommages de l’ADN. Tout d’abord, transfectez ou transduisez la lignée cellulaire de votre choix avec des constructions d’expression contenant des marqueurs fluorescents appropriés. Ici, M Cherry et GFP acquièrent ensuite une série de vidéos de contrôle montrant les cellules marquées par fluorescence dans des conditions normales.

Ensuite, appliquez un traitement approprié et capturez les données des effets du traitement sur le processus des cellules fluorescentes et analysez les données vidéo pour les relations spatio-temporelles des protéines. En fin de compte, la microscopie à fluorescence de cellules vivantes peut détailler la dynamique cellulaire comme la formation de foyers de 53 BP one en réponse à des agents endommageant l’ADN ou le comportement de 53 BP one pendant la mitose. Nous nous sommes d’abord intéressés à l’imagerie à deux et à l’imagerie 3D du mode de vie lorsque nous avons voulu étudier comment différents traitements affectaient la mitose dans certaines lignées cellulaires.

Cette approche expérimentale nous permet d’étudier la réponse aux dommages de l’ADN et le maintien de la stabilité génomique plus facilement que les méthodes traditionnelles. De plus, vous pouvez utiliser cette méthode pour étudier comment certaines protéines interagissent dans diverses voies de signalisation et diverses lignées cellulaires. Le principal avantage de l’imagerie du mode de vie par rapport aux techniques traditionnelles comme la cytochimie est qu’elle permet d’étudier les protéines de réponse aux dommages de l’ADN en temps réel.

Il peut être difficile d’optimiser les bonnes conditions d’enregistrement. Cette démonstration peut être utilisée pour voir les nombreuses petites étapes nécessaires pour assurer le succès. N’oubliez pas que la persévérance est payante lorsqu’il s’agit de minimiser le blanchiment des photos, de trouver les bons intervalles d’enregistrement et la bonne durée d’enregistrement, etc.

Transfectez ou transduisez les lignées cellulaires appropriées avec les plasmides pour l’expression des protéines de fusion mCherry et GFP. Maintenez les cultures sous sélection médicamenteuse et vérifiez périodiquement l’expression des protéines fluorescentes la veille de l’acquisition de l’image. Récoltez les cellules à l’aide de trypsine.

Ensuite, semez les cultures à faible densité sur des plaques à fond en verre fluorescent de 3,5 centimètres. Ce protocole a été développé à l’aide du microscope confocal à disque rotatif Zeiss cell observer SD, équipé d’un observateur axio Z un support Tout d’abord, vérifiez que le gaz CO2 circule vers le module CO2 du système d’incubation. Si le microscope est soutenu par une Airtable anti-vibration, ouvrez l’alimentation en air de l’Airtable.

Allumez maintenant l’alimentation du support de microscope, des caméras d’unité de disque rotatif, des modules d’incubation, de l’illuminateur HXP, de la platine motorisée, du laser à argonne et de l’ordinateur. Allumez les interrupteurs pour les lignes laser à utiliser. Démarrez le logiciel de vision Axio.

Le logiciel Avision peut être personnalisé à l’aide de fenêtres et de menus déroulants spécifiques au microscope et aux composants qu’il contrôle. En tant que telle, chaque interface utilisateur a un aspect potentiellement unique environ une heure avant l’imagerie. Localisez les commandes de l’incubateur et allumez le chauffage de la chambre supérieure et de la plaque de scène.

Réglez la température à 37 degrés Celsius. Activez le contrôle du CO2 et réglez le niveau à 5 %Sélectionnez l’objectif pour l’imagerie Dans cette étude. La lentille de l’objectif nécessite l’utilisation d’un milieu d’immersion ayant un indice de réfraction similaire à celui de l’eau.

Si vous avez besoin d’imager plusieurs positions sur de longues périodes, assurez-vous d’appliquer suffisamment de support d’immersion pour que l’oscilloscope ne se dessèche pas. Placez la boîte de culture sur la platine et mettez la lentille de l’objectif en contact avec le fond, à l’aide des commandes du microscope ou du logiciel. Dirigez la lumière émise vers les oculaires et sélectionnez le jeu de filtres à champ large approprié pour le signal fluorescent d’intérêt.

Maintenant, regardez à travers les lentilles oculaires. Focalisez l’image et localisez un champ approprié de cellules à l’aide du logiciel ou des commandes du microscope. Dirigez la lumière émise loin des oculaires vers le port à l’aide de l’unité de disque rotatif confocal dans le logiciel.

Allumez le laser approprié pour cette étude. Pour chaque canal, ajustez l’intensité du laser en ajustant la commande du filtre accordable optique kuo à un niveau approprié. Ensuite, sélectionnez le miroir dichroïque et les filtres d’émission appropriés.

Ouvrez l’obturateur sur l’unité de disque en rotation. Sélectionnez maintenant la fenêtre en direct pour afficher le champ de vision actuel. Ouvrez maintenant la fenêtre de contrôle de l’appareil photo.

Sélectionnez l’appareil photo à utiliser et réglez le temps d’exposition sur environ 100 millisecondes. Ajustez le pourcentage et le gain EM si nécessaire. Ouvrez également la commande de l’unité de disque rotatif confocal et ajustez la vitesse du disque rotatif en entrant le temps d’exposition de l’appareil photo qui a été réglé pour capturer une image appropriée.

Cliquez sur définir pour verrouiller la modification. Ouvrez maintenant la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle. Sélectionnez l’onglet Canal et chargez ou sélectionnez les canaux appropriés définis pour les Flora Fours.

Pour assurer le recalage de l’image, utilisez un miroir dichroïque commun pour les deux canaux. Réglez le logiciel sur la mise au point automatique. Passez à la fenêtre MDA et cliquez sur l’onglet Pile ZS.

Sélectionnez la pile ZS à la position de mise au point actuelle. Définissez la plage pour un Zack de 10 microns et choisissez optimal pour le nombre d’étapes afin d’assurer l’échantillonnage nyquist via Z.Cliquez maintenant sur démarrer et analysez l’image de la pile Z résultante. Sélectionnez l’onglet temps.

Définissez l’intervalle entre les points de temps de l’imagerie et la durée globale de la session. Pour l’imagerie multipoint de plusieurs cellules dans la parabole, ouvrez la fenêtre MDA. Sélectionnez l’onglet position et vérifiez que l’option Appliquer le paramètre avant ou après le point temporel par position est cochée.

Sélectionnez maintenant marquer. Trouvez à l’aide de la vue en direct, déplacez l’antenne parabolique et sélectionnez les champs de vision appropriés. Cliquez sur Démarrer dans le menu d’acquisition multidimensionnelle pour commencer l’expérience et enregistrer une vidéo de contrôle.

Procédez à l’ajout du traitement approprié et enregistrez la vidéo expérimentale à des intervalles de temps déterminés pendant une période de temps définie. Pour cette lignée cellulaire et pour surveiller l’ensemble du processus de mitose, nous avons utilisé un intervalle de sept minutes et demie et cela pendant quatre à cinq heures. Vous devrez déterminer les paramètres particuliers de votre lignée cellulaire et de ce que vous voulez étudier.

Ouvrez le logiciel velocity, créez et nommez une nouvelle bibliothèque et importez les fichiers vidéo expérimentaux pour visualiser les fichiers. Essayez d’utiliser le paramètre de mise au point étendue, ajustez les vidéos si nécessaire. Velocity est équipé d’une gamme d’outils pour vous aider à améliorer la qualité de vos images acquises.

Si les paramètres du microscope sont appropriés, cela vous fera gagner beaucoup de temps plus tard lors de l’édition. Souvent, il est utile de décentraliser vos images et d’ajuster la luminosité et le contraste, vos besoins spécifiques varieront en fonction de votre expérience pour visualiser les cellules en 3D. Passez au paramètre d’opacité 3D.

Cela permet la rotation des cellules rendues en 3D dans l’espace, offrant ainsi de multiples perspectives de structures d’intérêt à l’intérieur des cellules. Films. Les images fixes peuvent être exportées dans une variété de types de fichiers en fonction des préférences de l’utilisateur par rapport aux commandes. Les cellules fibroblastiques exposées à la CPT ont formé des foyers en cinq à 10 minutes et ont maintenu ces foyers pendant toute la durée de l’enregistrement.

Il est intéressant de noter que dans les cellules rénales embryonnaires humaines, 53 BP un se dissocie de la chromatine au début de la mitose, formant une fine brume autour des chromosomes condensés. Lorsque téléph se produit et que la mitose touche à sa fin en 53 BP, une fois, elle s’agrège à nouveau en foyers distincts. Nous espérons que cette vidéo vous permettra d’étudier les relations spatio-temporelles des protéines impliquées dans la réponse aux dommages de l’ADN ainsi que d’autres voies.

Par exemple, dans le domaine de la dynamique de la chromatine, cette technique a été utilisée pour étudier comment la liaison à 53 BP un affecte le mouvement des extrémités télomériques de l’ADN. Après la création de cellules génétiquement modifiées, l’imagerie de cellules vivantes en deux et en 3D peut être réalisée en quatre à huit heures environ. Assurez-vous que les paramètres du microscope sont ajustés de manière appropriée pour obtenir une imagerie optimale.