Enregistrement colorant sensible à la tension d'axones, des dendrites et des épines dendritiques des neurones individuels dans des tranches de cerveau

L’objectif global des expériences décrites est la surveillance de l’intégration du signal de potentiel membranaire et du traitement de l’information par une cellule nerveuse individuelle optiquement avec une résolution submicrométrique et sub-milliseconde à partir de plusieurs sites sur un neurone. Ceci est réalisé en construisant d’abord un dispositif d’imagerie avec une sensibilité appropriée pour permettre l’enregistrement de petits changements fractionnels de l’intensité lumineuse correspondant au potentiel transitoire de la membrane. Ensuite, sélectionnez les neurones avec l’anatomie appropriée pour une imagerie efficace des neurones avec de longs processus intacts dans un seul plan focal près de la surface de la tranche.

Chargez ensuite les neurones présélectionnés avec des colorants sensibles à la tension pour permettre un suivi optique des changements de potentiel de la membrane. Les résultats montrent la capacité unique de cette approche à obtenir des informations sur l’intégration des signaux électriques par les cellules nerveuses individuelles en surveillant les signaux de potentiel membranaire des axones, des dendrites et des épines dendritiques. En neurophysiologie cellulaire.

De nouveaux outils sont mis au point en raison des deux limites de longue date de l’électrophysiologie conventionnelle, à savoir la faible résolution spatiale des mesures d’électrodes et l’incapacité d’enregistrer à partir de petites structures telles que les collatéraux axonaux ou les épines dendritiques. Pour surmonter ces inconvénients, l’approche de l’électrode patch peut être combinée à des techniques optiques qui permettent des enregistrements parallèles à partir de toutes les parties d’un neuro. Nous décrivons ici une telle technique, l’enregistrement optique multilatéral des transitoires de potentiel membranaire avec une résolution de colonne vertébrale unique.

Dans cette expérience, un microscope droit et trois caméras sont utilisés pour ajuster l’éclairage uniforme. Tout d’abord, insérez un filtre de densité neutre approprié dans le trajet du faisceau laser. Ensuite, concentrez l’objectif sur la surface de la lame fluorescente standard.

Tout en observant l’image CCD du champ de vision sur l’écran du moniteur, ajustez la position de l’extrémité réceptrice du guide de lumière à quartz et la position de l’extrémité de sortie du guide de lumière à l’aide d’actionneurs appropriés sur le condenseur de fluorescence épi afin d’obtenir un éclairage centré et uniforme du champ de vision. Pour déterminer le bruit vibratoire, utilisez une lame fluorescente standard avec une marque non fluorescente sur la surface. Enregistrez l’intensité lumineuse avec le neuro CCD en mode continu.

Concentrez l’objectif sur un bord sombre de la marque noire et enregistrez l’intensité lumineuse pendant environ 100 millisecondes à une fréquence d’images de deux kilohertz. Affichez ensuite la moyenne spatiale des traces d’intensité lumineuse fractionnaire à partir d’environ 20 pixels recevant la lumière de la zone uniformément éclairée et d’environ 20 pixels le long du bord de la marque noire. L’excès de bruit dans la moyenne spatiale des pixels avec des bords à contraste élevé reflète le bruit vibratoire dans le système.

Il est essentiel d’avoir l’obturateur mécanique monté sur la table d’isolation des vibrations afin que l’ouverture de l’obturateur n’introduise pas de bruit vibratoire dans l’enregistrement optique. Il s’agit d’une étape cruciale. Montez l’obturateur à l’aide de vis en plastique et d’un matériau d’isolation des vibrations pour réduire le bruit vibratoire acoustique qui peut être capté par le système d’enregistrement optique.

Pour isoler les vibrations, ajustez la table d’isolation des vibrations jusqu’à ce que le bruit des vibrations des pixels couvrant le bord tranchant de l’image soit inférieur au bruit de la prise de vue. Les fils de l’équipement sur la table doivent être desserrés afin d’éviter de transmettre les vibrations mécaniques à la lunette du microscope. Dans cette procédure, préparez les coupes de cerveau de 300 à 400 microns d’épaisseur selon les procédures standard avec une lignée de souris exprimant EGFP dans des cellules nerveuses individuelles d’intérêt avec un système confocal à disque rotatif.

Visualisez les neurones marqués EGFP dans la tranche. Ensuite, sélectionnez les neurones avec des arbres axonaux dendritiques intacts et avec des processus parallèles et proches de la surface de la tranche pour l’imagerie du potentiel membranaire. Remplissez ensuite une pipette patch en verre à partir de la pointe avec une solution intracellulaire sans colorant jusqu’aux deux tiers du cône de l’électrode en appliquant une pression négative pendant environ 15 secondes.

Après cela, remplissez l’électrode avec la solution contenant le colorant sensible à la tension de perméat de membrane IMP dissous dans la solution intracellulaire. Maintenant, patchez un neurone précédemment sélectionné dans la minute qui suit le chargement du colorant dans l’électrode. Appliquez une faible pression positive d’environ 10 millimètres de mercure avant de descendre la pipette dans le bain, et tout en positionnant l’électrode dans la tranche, cela garantit qu’aucun colorant ne s’échappe de l’électrode avant que l’étanchéité ne soit établie.

Augmentez à haute pression environ 100 millimètres de mercure juste avant que l’électrode n’entre en contact avec la surface de la cellule. En établissant l’étanchéité dans toute la configuration de la cellule, permettez la diffusion libre du colorant d’une pipette à patch somatique vers le soma pendant 20 à 45 minutes. Pendant la diffusion teintée, surveillez l’état physiologique du neurone en enregistrant les potentiels d’action évoqués dans le mode de pince de courant.

De plus, surveillez la quantité de coloration en enregistrant l’intensité lumineuse au repos du soma cellulaire à une fréquence d’images de deux kilohertz et à une fraction de l’intensité lumineuse maximale ajustée avec des filtres à densité neutre. Continuez le processus de téléchargement jusqu’à ce que le potentiel d’action commence à s’élargir. À la fin de la coloration, retirez soigneusement la pipette patch du soma dans la configuration de la pince de tension pour vous assurer que la transition de la cellule entière à la configuration de patch extérieur est atteinte dans le processus.

S incubent ensuite la tranche pendant 1,5 à deux heures supplémentaires à température ambiante pour permettre au colorant sensible à la tension de se propager dans les processus neuronaux. Une fois qu’une quantité significative de colorant s’est diffusée loin du soma dans les processus dendritiques et axonaux, la forme d’onde du potentiel d’action doit être complètement restaurée. À l’étape suivante, localisez le soma du neurone de coloration sous la fluorescence de faible intensité.

Réduire l’intensité lumineuse avec des filtres à densité neutre au minimum requis pour visualiser l’objet d’intérêt à l’aide d’une étape XY Balayer la zone de la tranche contenant le neurone fluorescent jusqu’à ce que le soma fluorescent soit identifié. Positionnez le soma de la cellule colorée au centre du champ du microscope et représentez le neurone avec une électrode patch standard sans colorant sous le CID. Visualisez ensuite les processus neuronaux sous la fluorescence de faible intensité à une fréquence d’images de 10 à 40 hertz dans le mode d’enregistrement continu du CCD pour l’imagerie de tension.

En utilisant une position de platine XY, le processus neuronal d’intérêt se situe au milieu de la zone d’imagerie. De plus, protégez le SOMA de la lumière d’excitation à l’aide de l’iris d’arrêt de champ partiellement fermé du microscope pour réduire les dommages photodynamiques. Ensuite, enregistrez les signaux optiques liés aux potentiels d’action de rétropropagation dans les branches dendritiques individuelles.

Enregistrez ensuite les signaux optiques liés aux potentiels d’action dans l’axone. Après cela, enregistrez les signaux optiques liés aux potentiels d’action de rétropropagation dans les épines dendritiques. Utilisez la fréquence d’images appropriée pour une reconstruction précise de la forme d’onde du signal.

Dans le même temps, gardez les périodes d’enregistrement et l’exposition à la lumière d’excitation de haute intensité aussi courtes que possible afin de minimiser le blanchiment des colorants et les dommages photodynamiques. L’enregistrement des signaux optiques est montré ici. Ici. Le panneau supérieur montre l’image confocale haute résolution d’un neurone coloré avec son axone en position d’enregistrement.

Alors que le panneau du milieu montre l’image de fluorescence à faible résolution spatiale de l’axone obtenue par CCD utilisé pour l’imagerie du potentiel membranaire, le panneau inférieur présente les enregistrements d’électrodes du soma et les enregistrements optiques de l’IS A et du nœud de rvi. Les données brutes et les signaux traités sont affichés. Cette figure montre les signaux de potentiel d’action de l’axone d’un neurone cortical L cinq chargé de l’action du colorant sensible à la tension.

Les signaux potentiels associés ont été enregistrés à une fréquence d’images de 10 kilohertz. Ces traces indiquent le potentiel d’action transitoire à partir de trois emplacements. L’un, l’électrode enregistrant le soma.

Deuxièmement, les enregistrements optiques de la butte axonale, et troisièmement, l’enregistrement optique de la première note de vie, et voici les signaux superposés des trois mêmes endroits. Cette figure montre une rafale de quatre signaux de potentiel d’action se propageant à partir de plusieurs endroits sur l’arborescence dendritique d’un neurone cortical L cinq initiés par de courtes impulsions de courant dépolarisant à 100 hertz. Voici les signaux de potentiel d’action d’une épine dendritique individuelle.

Voici la reconstruction anatomique obtenue à partir d’un empilement d’images confocales à disque rotatif, et voici l’image de fluorescence de la même région obtenue avec la caméra CCD. Pour l’imagerie du potentiel membranaire, les traces d’intensité de fluorescence correspondant à l’action de rétropropagation Les potentiels des emplacements un à trois, comme indiqué sur l’image CCD, sont indiqués dans le panneau de droite. La trace inférieure indique l’enregistrement de l’électrode à partir du soma.

La préparation du pré-enregistrement dure environ trois heures, y compris la période d’attente pour que les dés se propagent aux processus distaux. Le temps d’enregistrement est limité par l’épuisement normal de la préparation et par les dommages photodynamiques du PO. L’ampleur des dommages photodynamiques est proportionnelle à l’intensité lumineuse de l’excitation, ainsi qu’à la durée et au nombre d’essais d’enregistrement individuels.

Dans certaines expériences, il est possible d’effectuer plus de 50 essais d’enregistrement sur une ou deux heures. D’autres mesures nécessitent une excitation élevée, des intensités lumineuses et des enregistrements plus longs, et sont limitées par des dommages photodynamiques à seulement quelques essais d’enregistrement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une imagerie de tension à partir de l’ensemble de la structure axonale et endr des neurones individuels dans des tranches de cerveau.