Enregistrement colorant sensible à la tension d'axones, des dendrites et des épines dendritiques des neurones individuels dans des tranches de cerveau

L'objectif général des expériences décrites est de surveiller de manière optique, avec une résolution submicrométrique et submilliseconde, l'intégration des signaux du potentiel membranaire et le traitement de l'information par une cellule nerveuse individuelle, à partir de plusieurs sites sur un neurone. Cela est réalisé en premier lieu en concevant un dispositif d'imagerie doté d'une sensibilité appropriée permettant l'enregistrement de faibles variations fractionnelles de l'intensité lumineuse correspondant aux transitoires du potentiel membranaire. Ensuite, sélectionnez les neurones présentant une anatomie adaptée pour une imagerie efficace, avec des prolongements longs et intacts dans un seul plan focal proche de la surface de la tranche.

Ensuite, chargez les neurones présélectionnés avec des colorants sensibles au voltage afin de permettre le suivi optique des changements de potentiel membranaire. Les résultats montrent la capacité unique de cette approche à obtenir des informations sur l'intégration des signaux électriques par des cellules nerveuses individuelles en surveillant les signaux de potentiel membranaire provenant des axones, des dendrites et des épines dendritiques. En neurophysiologie cellulaire.

De nouveaux outils sont en cours de développement en raison des deux limites persistantes de l'électrophysiologie classique : la faible résolution spatiale des mesures électrodes et l'impossibilité d'enregistrer à partir de petites structures telles que les collatéraux axonaux ou les épines dendritiques. Pour surmonter ces inconvénients, l'approche par électrode de patch peut être combinée à des techniques optiques permettant des enregistrements parallèles provenant de toutes les parties d'un neurone. Nous décrivons ici une telle technique : l'enregistrement optique multiple latéral des transitoires du potentiel membranaire avec une résolution au niveau de la seule épine.

Dans cette expérience, un microscope droit et trois caméras sont utilisés pour régler un éclairage uniforme. Insérez d'abord un filtre neutre de densité approprié dans le trajet du faisceau laser. Ensuite, focalisez l'objectif sur la surface de la lame fluorescente standard.

En observant l'image CCD du champ de vision sur l'écran du moniteur, ajustez la position de l'extrémité réceptrice du guide de lumière en quartz et celle de l'extrémité de sortie du guide de lumière à l'aide des actionneurs appropriés du condenseur d'épi-fluorescence afin d'obtenir un éclairage centré et uniforme du champ de vision. Pour déterminer le bruit vibratoire, utilisez une lame fluorescente standard comportant une marque non fluorescente à sa surface. Enregistrez l'intensité lumineuse avec le CCD neuro en mode continu.

Placez l'objectif sur un bord sombre de la marque noire et enregistrez l'intensité lumineuse pendant environ 100 millisecondes à une fréquence d'acquisition de deux kilohertz. Ensuite, affichez la moyenne spatiale des courbes d'intensité lumineuse normalisée provenant d'environ 20 pixels recevant de la lumière provenant d'une zone uniformément éclairée et d'environ 20 pixels situés le long du bord de la marque noire. Le bruit excédentaire dans la moyenne spatiale provenant des pixels présentant des bords à fort contraste reflète le bruit vibratoire du système.

Il est essentiel de monter l'obturateur mécanique à l'écart de la table d'isolation vibratoire afin que l'ouverture de l'obturateur n'introduise pas de bruit vibratoire dans l'enregistrement optique. Cette étape est cruciale. Montez l'obturateur à l'aide de vis en plastique et de matériau d'isolation vibratoire afin de réduire le bruit vibratoire acoustique pouvant être capté par le système d'enregistrement optique.

Pour isoler les vibrations, ajustez la table d'isolation des vibrations jusqu'à ce que le bruit de vibration des pixels couvrant le bord net de l'image soit inférieur au bruit de grenaille. Les câbles des équipements sur la table doivent être lâches afin d'éviter la transmission des vibrations mécaniques au microscope. Dans cette procédure, préparez des tranches de cerveau d'une épaisseur de 300 à 400 microns selon les procédures standard à l'aide d'une lignée de souris exprimant EGFP dans des cellules nerveuses individuelles d'intérêt avec un système confocal à disque tournant.

Visualisez les neurones marqués par la EGFP dans la coupe. Ensuite, sélectionnez les neurones possédant des arbres dendritiques et axonaux intacts, dont les prolongements sont parallèles et proches de la surface de la coupe, pour l'imagerie du potentiel membranaire. Puis, remplissez une pipette de patch en verre à partir de la pointe avec une solution intracellulaire sans colorant jusqu'aux deux tiers de la zone conique de l'électrode en appliquant une pression négative pendant environ 15 secondes.

Ensuite, remplir par le haut l'électrode avec la solution contenant le colorant sensible à la tension membranaire IMP dissous dans la solution intracellulaire. Maintenant, réaliser un « patch » sur un neurone préalablement sélectionné dans la minute suivant le chargement du colorant dans l'électrode. Appliquer une pression positive faible d'environ 10 millimètres de mercure avant d'abaisser la pipette dans le bain, et pendant le positionnement de l'électrode dans la tranche, afin de s'assurer qu'aucun colorant ne s'échappe de l'électrode avant l'établissement du scellement.

Augmenter la pression jusqu'à une valeur élevée d'environ 100 millimètres de mercure juste avant que l'électrode n'entre en contact avec la surface de la cellule. Pour établir le scellement en configuration de la cellule entière, permettre la diffusion libre du colorant à partir d'une micropipette en mode patch somatique vers le soma pendant 20 à 45 minutes. Pendant la diffusion du colorant, surveiller l'état physiologique du neurone en enregistrant les potentiels d'action évoqués en mode clamp de courant.

En outre, surveillez la quantité de marquage en enregistrant l'intensité lumineuse au repos provenant du soma cellulaire à une fréquence d'images de deux kilohertz et à une fraction de l'intensité lumineuse maximale ajustée à l'aide de filtres neutres. Poursuivez le processus de dialyse jusqu'à ce que le potentiel d'action commence à s'élargir. À la fin du marquage, retirez délicatement la micropipette du soma en configuration de blocage de tension afin de garantir que la transition de la configuration en cellule entière à celle de patch « outside-out » soit obtenue au cours du processus.

Ensuite, incuber la coupe supplémentairement de 1,5 à deux heures à température ambiante afin de permettre au colorant sensible au potentiel de se répandre dans les prolongements neuronaux. Une fois qu'une quantité significative de colorant s'est diffusée loin du soma vers les prolongements dendritiques et axonaux, la forme d'onde du potentiel d'action devrait être complètement rétablie. À l'étape suivante, localiser le soma du neurone marqué en utilisant la fluorescence à faible intensité.

Réduisez l'intensité lumineuse à l'aide de filtres de densité neutre au minimum nécessaire pour visualiser l'objet d'intérêt à l'aide d'un plateau XY. Parcourez la zone de la coupe contenant le neurone fluorescent jusqu'à ce que le soma fluorescent soit identifié. Positionnez le soma de la cellule marquée au centre du champ du microscope, puis réalisez un enregistrement en mode patch avec une électrode standard sans colorant en utilisant le contraste interférentiel différentiel (DIC). Visualisez ensuite les prolongements neuronaux en fluorescence à faible intensité, à une fréquence d'images de 10 à 40 hertz, en mode d'enregistrement continu du CCD pour l'imagerie de potentiel.

À l’aide d’une position sur la platine XY, placer le processus neuronal d’intérêt au centre de la zone d’imagerie. En outre, protéger le corps cellulaire (SOMA) de la lumière d’excitation à l’aide du diaphragme champ fermé partiellement du microscope afin de réduire les dommages photodynamiques. Ensuite, enregistrer les signaux optiques associés aux potentiels d’action rétrogrades dans les branches dendritiques individuelles.

Ensuite, enregistrez les signaux optiques liés aux potentiels d'action dans l'axone. Après cela, enregistrez les signaux optiques liés aux potentiels d'action rétropropagés dans les épines dendritiques. Utilisez la fréquence d'images appropriée pour une reconstruction précise de la forme d'onde du signal.

En même temps, maintenir les périodes d'enregistrement et l'exposition à la lumière d'excitation de haute intensité aussi courtes que possible afin de minimiser la décoloration du colorant et les dommages photodynamiques. L'enregistrement des signaux optiques est montré ici. Le panneau supérieur montre l'image confocale haute résolution d'un neurone coloré avec son axone en position d'enregistrement.

Alors que le panneau central montre l'image de fluorescence à faible résolution spatiale de l'axone obtenue par CCD, utilisée pour l'imagerie du potentiel membranaire, le panneau inférieur présente les enregistrements électrodes du soma et les enregistrements optiques de l'ASI et du nœud de Ranvier. Les données brutes et les signaux traités sont affichés. Cette figure montre les signaux du potentiel d'action provenant de l'axone d'un neurone cortical L5 chargé avec le colorant sensible au voltage Action.

Des signaux potentiellement associés ont été enregistrés à une fréquence de 10 kilohertz. Ces tracés indiquent le transitoire du potentiel d'action provenant de trois emplacements. Premièrement, l'électrode enregistrant le soma.

Deux, les enregistrements optiques provenant du cône axonal, et trois, l'enregistrement optique du premier nœud de Ranvier, ainsi que les signaux superposés provenant de ces trois mêmes emplacements. Cette figure montre un train de quatre potentiels d'action rétrogrades enregistrés en plusieurs points de l'arborisation dendritique d'un neurone cortical de type L5, déclenchés par des impulsions courtes de courant dépolarisant à 100 hertz. Sont représentés ici les signaux de potentiel d'action provenant d'une épine dendritique individuelle.

Voici la reconstruction anatomique obtenue à partir d'une série d'images confocales à disque rotatif, et voici l'image de fluorescence de la même région obtenue avec la caméra CCD. Pour l'imagerie du potentiel de membrane, les tracés d'intensité de fluorescence correspondant aux potentiels d'action rétrogrades provenant des emplacements un à trois, tels qu'indiqués sur l'image CCD, sont présentés dans le panneau de droite. Le tracé inférieur indique l'enregistrement électrode du soma.

La préparation avant l'enregistrement prend environ trois heures, y compris la période d'attente nécessaire à la diffusion des dés vers les prolongements distaux. La durée de l'enregistrement est limitée par la dégradation normale de la préparation et par les dommages photodynamiques induits par la lumière polarisée (PO). L'importance des dommages photodynamiques est proportionnelle à l'intensité de la lumière d'excitation, ainsi qu'à la durée et au nombre des essais d'enregistrement individuels.

Dans certaines expériences, il est possible d'effectuer plus de 50 essais d'enregistrement sur une à deux heures. D'autres mesures nécessitent une forte excitation, des intensités lumineuses élevées et des enregistrements plus longs, et sont limitées par les dommages photodynamiques à seulement quelques essais d'enregistrement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer un imagerie de potentiel sur l'ensemble de la structure axonale et des terminaisons de neurones individuels dans des tranches de cerveau.