Name: Explorer muscle lisse artériel KV7 fonction des canaux potassiques à laide délectrophysiologie patch-clamp et myographie pression (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Explorez l'électrophysiologie patch-clamp et la myographie pression pour étudier les canaux potassiques Kv7 dans le muscle lisse artériel. Cette méthode permet de mesurer l'activité ionique et les réponses vasculaires.

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Ce travail a été financé par une subvention du National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH R01-HL089564) pour KLB et pré-doctorales de l&#39;American Heart Association (09PRE2260209) et Arthur J. Schmitt Fondation pour BKM.

<ol><li>Passmore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNQ%2FM+Currents+in+Sensory+Neurons%3A+Significance+for+Pain+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy.</a> J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).</li>
<li>Falloon, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+small+artery+sensitivity+and+morphology+in+pressurized+and+wire-mounted+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268, H670-H678 (1995).</li>
<li>Dunn, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resistance+artery+sensitivity+to+agonists+under+isobaric+compared+with+isometric+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced resistance artery sensitivity to agonists under isobaric compared with isometric conditions.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 266, H147-H155 (1994).</li>
<li>Buus, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+sensitivity+of+rat+mesenteric+small+arteries+to+agonists+when+studied+as+ring+preparations+or+as+cannulated+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations.</a> Br. J. Pharmacol. 112, 579-587 (1994).</li>
<li>Abdelhalim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+big+endothelin-1+in+comparison+with+endothelin-1+on+the+microvascular+blood+flow+velocity+and+diameter+of+rat+mesentery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of big endothelin-1 in comparison with endothelin-1 on the microvascular blood flow velocity and diameter of rat mesentery in vivo.</a> Microvasc. Res. 72, 108-112 (2006).</li>
<li>Altura, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+relationships+for+arginine+vasopressin+and+synthetic+analogs+on+three+types+of+rat+blood+vessels%3A+possible+evidence+for+regional+differences+in+vasopressin+receptor+sites+within+a+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Dose-response relationships for arginine vasopressin and synthetic analogs on three types of rat blood vessels: possible evidence for regional differences in vasopressin receptor sites within a mammal.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 193, 413-423 (1975).</li>
<li>Henderson, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasopressin-induced+vasoconstriction%3A+two+concentration-dependent+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vasopressin-induced vasoconstriction: two concentration-dependent signaling pathways.</a> J. Appl. Physiol. 102, 1402-1409 (2007).</li>
<li>Mackie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+KCNQ+potassium+channels+as+novel+targets+for+the+control+of+mesenteric+artery+constriction+by+vasopressin%2C+based+on+studies+in+single+cells%2C+pressurized+arteries%2C+and+in+vivo+measurements+of+mesenteric+vascular+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Vascular KCNQ potassium channels as novel targets for the control of mesenteric artery constriction by vasopressin, based on studies in single cells, pressurized arteries, and in vivo measurements of mesenteric vascular resistance.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 325, 475-483 (2008).</li>
<li>Brueggemann, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+selective+cyclooxygenase-2+inhibitors+on+vascular+smooth+muscle+ion+channels+may+account+for+differences+in+cardiovascular+risk+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on vascular smooth muscle ion channels may account for differences in cardiovascular risk profiles.</a> Mol. Pharmacol. 76, 1053-1061 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Patch+Clamp+Technique%22">Patch Clamp Technique</a>. Kaneez, F. S. , Intech. (2012).</li>
<li>Berra-Romani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTX-sensitive+voltage-gated+Na%2B+channels+are+expressed+in+mesenteric+artery+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">TTX-sensitive voltage-gated Na+ channels are expressed in mesenteric artery smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H137-H145 (2005).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les méthodes et approches expérimentales décrites ici sont très robustes et peuvent produire des résultats clairs et reproductibles lorsqu&#39;ils sont appliqués avec une attention méticuleuse aux détails. De bons enregistrements électrophysiologiques et la constriction / dilatation des segments artériels sont tributaires de la santé des cellules et des segments d&#39;artère, respectivement. Préparations de cellules peut varier de jour en jour, même en utilisant le même protocole. Solutions d&#39;isolation peut être uti...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> Sigma </td><td> S5886 </td><td> Solution dissection: 145 Solution de bain pour électrophysiologie *: 140 Solution interne pour l&#39;électrophysiologie: 10 Solution d&#39;isolation pour les myocytes *: 140 Solution de bain pour myographie pression: 145 Lumen solution pour myographie pression: 145 </td></tr><tr><td> Le chlorure de potassium </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> Solution dissection: 4,7 Solution de bain pour électrophysiologie *: 5,36 Solution interne pour l&#39;électrophysiologie: 135 Solution d&#39;isolation pour les myocytes *: 5,36 Solution de bain pour myographie pression: 4,7 Lumen solution pour myographie pression: 4,7 </td></tr><tr><td> Potassium EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td><td> Solution interne pour l&#39;électrophysiologie: 0,05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H9136 </td><td> Solution de bain pour électrophysiologie *: 10 Solution interne pour l&#39;électrophysiologie: 10 Solution d&#39;isolation pour les myocytes *: 10 </td></tr><tr><td> Hydrogénophosphate disodique </td><td> Sigma </td><td> S5136 </td><td> Solution d&#39;isolation pour les myocytes *: 0,34 </td></tr><tr><td> Hydrogénophosphate de potassium </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td> Solution d&#39;isolation pour les myocytes *: 0,44 </td></tr><tr><td> Chlorure de magnésium </td><td> Sigma </td><td> M2393 </td><td> Solution de bain pour électrophysiologie *: 1,2 Solution interne pour l&#39;électrophysiologie: 1 Solution d&#39;isolation pour les myocytes *: 1,2 </td></tr><tr><td> Chlorure de calcium </td><td> Sigma </td><td&gt; C7902 </td><td> Solution de bain pour électrophysiologie *: 2 Solution d&#39;isolation pour les myocytes *: 0,05 </td></tr><tr><td> Phosphate de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP331-1 </td><td> Solution dissection: 1.2 Solution de bain pour myographie pression: 1,2 Lumen solution pour myographie pression: 1,2 </td></tr><tr><td> Sulfate de magnésium </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Solution dissection: 1,17 Solution de bain pour myographie pression: 1,17 Lumen solution pour myographie pression: 1,17 </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP308 </td><td> Solution dissection: 3 Solution de bain pour myographie pression: 3 Lumen solution pour myographie pression: 3 </td></tr><tr><td> L&#39;acide pyruvique </td><td> Sigma </td><td> P4562 </td><td> Solution dissection: 2 Solution de bain d&#39;myographie pression: 2 Lumen solution pour myographie pression: 2 </td></tr><tr><td> Dihydraté EDTA </td><td> Biologique Recherche </td><td> 9572E </td><td> Solution dissection: 0,02 Solution de bain pour myographie pression: 0,02 Lumen solution pour myographie pression: 0,02 </td></tr><tr><td> Le D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G7021 </td><td> Solution dissection: 5 Solution de bain pour électrophysiologie *: 10 Solution interne pour l&#39;électrophysiologie: 20 Solution d&#39;isolation pour les myocytes *: 10 Solution de bain pour myographie pression: 5 Lumen solution pour myographie pression: 5 </td></tr><tr><td> Sérum-albumine bovine </td><td> Sigma </td><td> A3912 </td><td> Solution dissection: 1% Lumen solution pour myographie pression: 1% </td></tr><tr><td> pH </td><td></td><td></td><td> Dissection Solution: 7,4 Solution de bain pour électrophysiologie *: 7,3 Solution interne pour l&#39;électrophysiologie: 7.2 Solution d&#39;isolation pour les myocytes *: 7,2 Solution de bain pour myographie pression: 7,4 Lumen solution pour myographie pression: 7,4 </td></tr><tr><td> Osmolarité </td><td></td><td></td><td> Solution dissection: 300 Solution de bain pour électrophysiologie *: 298 Solution interne pour l&#39;électrophysiologie: 298 Solution d&#39;isolation pour les myocytes *: 298 Solution de bain pour myographie pression: 300 Lumen solution pour myographie pression: 300 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * 11 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Composants des solutions utilisées dans l&#39;expérience. </td></tr></tbody></table>

explorer muscle lisse artériel kv7 fonction des canaux potassiques à l&#39;aide d&#39;électrophysiologie patch-clamp et myographie pression

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction ou la relaxation des cellules musculaires lisses dans les parois des artères de résistance détermine le diamètre et commande ainsi l&#39;artère écoulement de sang à travers le vaisseau et contribue à la pression artérielle systémique. Le processus de contraction est régulée par la concentration en calcium cytosolique ([Ca 2 +] cyt), qui est à son tour commandé par une série de transporteurs d&#39;ions et des canaux. Les canaux ioniques sont des intermédiaires communs dans les voies de transduction du signal activées par les hormones vasoactives pour effectuer une vasoconstriction ou une vasodilatation. Et des canaux ioniques sont souvent pris pour cible par des agents thérapeutiques soit intentionnellement (par exemple inhibiteurs calciques utilisés pour induire une vasodilatation et hypotension) ou non (par exemple, pour induire des effets secondaires indésirables cardio-vasculaires). KV7 (KCNQ) canaux potassiques voltage-activés ont récemment été identifié comme targ physiologique et thérapeutique importanteets de régulation de la contraction du muscle lisse. Pour élucider les rôles spécifiques des KV7 canaux à la fois dans la transduction du signal physiologique et dans les actions des agents thérapeutiques, nous devons étudier la façon dont leur activité est modulée au niveau cellulaire ainsi que d&#39;évaluer leur contribution dans le cadre de l&#39;artère intacte. Les artères mésentériques de rats constituent un système modèle utile. Les artères peuvent être facilement disséquées, débarassés des tissus conjonctifs, et utilisé pour préparer des myocytes artériels isolés pour patch clamp électrophysiologie, ou une canule et mis sous pression pour les mesures de vasoconstricteurs / réponses vasodilatateur dans des conditions relativement physiologiques. Nous décrivons ici les méthodes utilisées pour les deux types de mesures et de donner quelques exemples de la façon dont la conception expérimentale peut être intégré à fournir une meilleure compréhension des rôles de ces canaux ioniques dans la régulation du tonus vasculaire.

Les mesures de KV7 (KCNQ) l&#39;activité des canaux potassium dans les myocytes isolés des artères (l&#39;utilisation du patch clamp techniques électrophysiologiques) en parallèle avec des mesures de constricteurs / dilatateur réponses (en utilisant myographie pression) peut révéler des informations importantes sur le rôle des canaux KV7 dans la physiologie du muscle lisse vasculaire et pharmacologie.

Explorer muscle lisse artériel KV7 fonction des canaux potassiques à l&#39;aide d&#39;électrophysiologie patch-clamp et myographie pression

La contraction ou le relâchement des cellules musculaires lisses au sein des parois des artères de résistance détermine le diamètre artériel et contrôle ainsi le flux de...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer l'activité des canaux potassiques KV sept dans des cellules musculaires lisses artérielles mésentériques dissociées fraîchement, et de relier ces mesures aux variations du diamètre artériel enregistrées dans des conditions physiologiques. Ceci est réalisé en premier lieu par l'ablation chirurgicale de l'arcade vasculaire mésentérique d'un rat. La deuxième étape consiste à disséquer et à nettoyer les segments des artères mésentériques.Ensuite, certains segments sont utilisés pour isoler des cellules musculaires lisses individuelles afin de réaliser des mesures électrophysiologiques par enregistrement en configuration patch clamp des courants potassiques KV sept. La dernière étape consiste en la canulation de segments artériels intacts pour des mesures de myographie sous pression de la constriction ou de la dilatation artérielle en réponse à des modulateurs pharmacologiques des canaux potassiques KV sept. En définitive, la combinaison de l'électrophysiologie en configuration patch clamp et de la myographie sous pression permet de montrer comment une augmentation ou une diminution de l'activité des canaux potassiques KV sept affecte

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Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

Dysfonctionnement des canaux Kv est associée à des arythmies cardiaques. Afin d'étudier les mécanismes moléculaires qui conduisent à des arythmies telles que nous utilisons un protocole systématique pour l'isolement des cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires chez des souris knock-out canaux Kv auxiliaires sous-unités. Cardiomyocytes isolés peuvent alors être immédiatement utilisé pour les études électrophysiologiques cellulaires, biochimiques ou immunofluorescence (IF) essais.

Isolement et enregistrements Chaîne Kv en cardiomyocytes murins auriculaire et ventriculaire

Nous décrivons ici l'isolement de cardiomyoctyes de souris adultes en utilisant un système de perfusion de Langendorff. Les cellules résultantes sont des ions Ca2 + à tolérance de repos électriquement et peuvent être cultivées et transfectées avec l'adénovirus ou de lentivirus de manipuler l'expression génique. Leur fonctionnalité peut également être analysé en utilisant le système MMSYS et techniques de patch-clamp.

Isolement, culture et caractérisation fonctionnelle des adultes Cardiomyoctyes souris

myographie de pression est utilisée pour évaluer vasoactivité des petites artères qui se développent constriction soutenue lorsqu'il est sous pression. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour évaluer dans des segments isolés de petites artères mésentériques des rats, vasoactivité et l'effet de la pression intraluminale sur le diamètre vasculaire.

Évaluer la réponse Myogenic et vasoactivité dans les artères mésentériques Résistance Utilisation myographie de pression

La reconstitution de la protéine transmembranaire, KvAP, dans des vésicules unilamellaires géantes (GUVs) est démontrée par deux méthodes de déshydratation-réhydratation, et - électroformation gonflement assisté gel. Dans les deux procédés, de petites vésicules unilamellaires contenant la protéine sont fusionnées ensemble pour former GUVs qui peuvent ensuite être étudiées par microscopie par fluorescence et de patch-clamp électrophysiologie.

Reconstitution d&#39;une protéine transmembranaire, le Ion canal de voltage-dépendants, KvAP, en géant vésicules unilamellaires pour la microscopie et Patch études Clamp

Ce manuscrit décrit un protocole simple pour l’isolement des artérioles de la rétine de rat qui peut être utilisé dans, calcium imagerie et pression myographie des études électrophysiologiques.

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L'objectif principal de cet article est de fournir des détails sur la façon d'enregistrer le potentiel membranaire (Vm) de l'artère cérébrale moyenne en utilisant la méthode d'impalement de microélectrode. L'artère cérébrale moyenne cannulated est équilibrepour obtenir le tonus myogénique, et la paroi du vaisseau est empalé à l'aide de microélectrodes à haute résistance.

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Explorez l'électrophysiologie patch-clamp et la myographie pression pour étudier les canaux potassiques Kv7 dans le muscle lisse artériel. Cette méthode permet de mesurer l'activité ionique et les réponses vasculaires.

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