Explorer muscle lisse artériel KV7 fonction des canaux potassiques à l'aide d'électrophysiologie patch-clamp et myographie pression

L’objectif global de cette procédure est de mesurer l’activité des sept canaux potassiques KV dans les cellules musculaires lisses de l’artère mésentérique fraîchement dissociées, et de la relier aux mesures du diamètre artériel enregistrées dans des conditions physiologiques. Ceci est accompli en retirant d’abord chirurgicalement l’arcade vasculaire mésentérique d’un rat. La deuxième étape consiste à disséquer et à nettoyer les segments des artères mésentériques.

Ensuite, certains segments sont utilisés pour isoler des cellules musculaires lisses individuelles pour des mesures électrophysiologiques par patch clamp de courants de potassium KV sept. La dernière étape est la canulation de segments artériels intacts pour les mesures de pression myo de la constriction ou de la dilatation artérielle en réponse aux modulateurs pharmacologiques des sept canaux potassiques KV. En fin de compte, la combinaison de l’électrophysiologie par patch clamp et de la myographie de pression est utilisée pour montrer comment une augmentation ou une diminution de l’activité des sept canaux potassiques KV affecte la constriction artérielle mésentérique.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l’utilisation de canaux clones exprimés dans des lignées cellulaires, est que les courants sont enregistrés à partir de cellules non cultivées qui expriment nativement les canaux et que les courants KV peuvent être isolés d’autres classes de canaux potassiques qui peuvent être activés dans les mêmes cellules. La myographie de pression permet d’enregistrer les réponses fonctionnelles à partir du même tissu à partir duquel les cellules isolées sont dérivées, et la méthode est à la fois plus sensible et plus physiologique que d’autres préparations comme les anneaux artériels ou les bandelettes artérielles. Le Dr Bareth Mani, boursier postdoctoral de mon laboratoire, fera la démonstration des techniques de canulation artérielle et de myographie de pression et le Dr Luba Brueggeman, professeure adjointe de recherche dans mon laboratoire, fera la démonstration des procédures d’isolement cellulaire et de plan de patch.

Pour commencer cette procédure, utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux pour couper un segment de 10 à 12 centimètres aux deux extrémités de l’intestin grêle d’un rat. Isolez ensuite l’intestin ainsi que le système vasculaire qui y est attaché. Ensuite, épinglez le segment de l’intestin grêle.

Étalez le mésentaire sur le côté proche de la chambre de sorte que la branche primaire de l’artère mésentérique supérieure soit au centre et que l’ordre ultérieur des branches rayonne à partir du centre. Ensuite, placez les broches uniquement sur les segments intestinaux en visualisant à l’aide d’un microscope de dissection éclairé. Nettoyez soigneusement le tissu adipeux et le tissu conjonctif entourant les artères de deuxième à quatrième ordre près des intestins à l’aide de micro-pinces et de ciseaux.

Tenez les veines adjacentes pour faciliter le dégagement du tissu adipeux et du tissu conjonctif et éviter l’étirement inutile des artères. Transférez maintenant deux à trois segments de l’artère mésentérique dans une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres contenant deux millilitres de solution d’isolement glacée. Placez ensuite le plat sur de la glace, coupez les segments de l’artère mésentérique en morceaux de trois à quatre millimètres de long à l’aide d’un PE ou d’une pipette avec une pointe polie au feu.

Transférez les segments artériels dans un flacon en verre contenant deux millilitres de solution d’isolement préchauffée à 37 degrés Celsius. Ensuite, incubez-le pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après 30 minutes, aspirez soigneusement la solution d’isolement à 37 degrés Celsius avec une pipette postérieure.

Ajoutez-y deux millilitres de solution enzymatique chaude, puis incubez-le pendant 35 minutes à 37 degrés Celsius. Immédiatement après l’incubation de 35 minutes dans la solution enzymatique, placez le flacon sur de la glace, aspirez la solution enzymatique et ajoutez deux millilitres de solution isolante glacée. Répétez cette procédure quatre fois.

Ensuite, dans un millilitre de solution d’isolement glacée, itérez doucement les segments artériels avec la pipette postérieure polie. 10 à 20 fois pour libérer les cellules musculaires lisses de l’artère mésentérique individuelles. Vérifiez périodiquement l’apparence des myocytes en plaçant une goutte de la suspension cellulaire sur une parabole de 35 millimètres et en les observant au microscope.

Les CMS MA sains doivent avoir un aspect lisse et allongé. Ensuite, transférez environ 100 à 200 microlitres de suspension cellulaire dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pipette à pâte polie et laissez les cellules adhérer pendant 15 minutes. Dans cette étape, remplissez l’extrémité de la pipette patch avec de l’amphotéricine B, solution interne libre en insérant l’extrémité de la pipette à l’intérieur.

Appliquez ensuite l’aspiration à l’autre extrémité à l’aide d’une seringue de 10 millilitres fixée par un morceau de tube et ajoutez de l’information sur la solution de pipette B contenant par le haut. À l’aide d’un micro-chargeur einor, la pointe de pipette jusqu’à ce que la pipette soit à moitié remplie de solution. Éliminez les bulles d’air en tapotant doucement la pipette.

Après cela, insérez la pipette dans le porte-électrode. À l’aide d’un micromanipulateur, abaissez la pipette à la surface d’un myocyte allongé. Lorsque la résistance de la pipette augmente jusqu’à six à 10 méga ohms, appliquez une aspiration pour obtenir une giga étanchéité.

Dans le même temps, réglez la tension de maintien à zéro millivolts en attendant la perforation de la membrane. Ensuite, appliquez des pas de tension de 100 millisecondes à plus 10 millivolts, puis à moins 10 millivolts. Utilisez l’amplificateur pour compenser la capacité transitoire rapide de la pipette en même temps que l’apparition de la capacité de la cellule entière.

De petits courants positifs soutenus transitoires de deux à 10 ampères PICO, purs et d’amplitude indiquent la présence de sept canaux KV fonctionnels. La perforation réussie avec l’amphotéricine B réduira la résistance d’accès à 35 méga ohms ou moins. Pour enregistrer la relation entre la tension de courant KV sept, appliquez des pas de tension de cinq secondes à des tensions allant de moins 84 millivolts où la probabilité d’ouverture de KV sept canaux est minimale à plus 16 millivolts où la probabilité d’ouverture de KV sept canaux atteint un plateau Après cinq secondes à chaque tension d’essai, revenez à la tension de maintien à moins quatre millivolts pendant 10 secondes.

Dans cette procédure, suspendez sans serrer deux sutures en nylon fin préfabriquées de chaque côté. Adjacent à la canule en verre, le segment de l’artère mésentérique disséqué a été soigneusement transféré de la chambre de dissection à la chambre de myogreffe en tenant une extrémité du segment à l’aide d’une paire de micro-pinces. Ensuite, en visualisant à l’aide d’un microscope de dissection éclairé, tenez une extrémité du segment de l’artère et faites-le glisser doucement sur la canule en verre gauche.

Fixez l’extrémité à l’aide des sutures en nylon. Ensuite, rincez doucement le liquide lumineux à travers le vaisseau monté pour éliminer le sang et les débris. La valve de la seringue gauche doit ensuite être fermée de sorte que ce côté présente une colonne statique de liquide contre laquelle la pression est ajustée du côté droit, à l’aide du micromanipulateur, positionnez la canule en verre droite mobile plus près du segment de l’artère et tirez l’extrémité droite du segment par-dessus.

Enfin, fixez le segment de l’artère avec des sutures en nylon et coupez les fils de suture en excès. Montez maintenant l’appareil de graphique de pression sur la platine au-dessus du microscope de micrographie de pression. Connectez la colonne de pression sur le côté droit de la chambre graphique, puis placez le couvercle sur la chambre.

Soulevez progressivement la seringue de 10 millilitres sur une période de 15 minutes et vérifiez s’il y a des fuites dans le récipient jusqu’à ce que le transducteur de pression P one indique 80 millimètres de mercure, ajustez la distance entre la canule si nécessaire, la distance doit être ajustée de manière à ce que le segment de l’artère sous pression soit à peu près droit et forme un motif en forme d’épaule où les attaches sont faites. Vérifiez la viabilité du récipient monté par la superfusion transitoire avec 60 millimolaires de chlorure de potassium pendant 30 secondes. Un vaisseau viable se resserre rapidement avec l’ajout de chlorure de potassium et se dilate immédiatement après son lessivage.

Ensuite, ajoutez la substance d’essai concentrée dans la solution du bain directement à la pipette d’avant en arrière doucement près de l’extrémité de la chambre pour mélanger la substance d’essai dans la solution du bain, ce qui permet d’obtenir la concentration finale appropriée dans la chambre de 10 millilitres. Les changements de volume du diamètre de la cuve après l’ajout de la substance d’essai peuvent être surveillés dans l’image vidéo en direct et également cartographiés dans la fenêtre d’analyse d’image pendant que l’expérience est en cours. Cette figure montre une famille de traces de courant séquentielles enregistrées en réponse à des pas de tension avant le traitement comme indiqué en noir et suite à la stabilisation en présence de 100 nanomolaires de zinc périon dans un seul myocyte de l’artère mésentérique comme indiqué en rouge, voici les courants représentatifs pour le contrôle et pour 100 nanomolaires de zinc périon.

Les barres grises indiquent l’intervalle de temps où les amplitudes de courant moyennes ont été mesurées. Pour les graphiques de tension de courant, les tensions de pas sont indiquées à droite par des pointes de flèche. Il s’agit de l’évolution temporelle de l’augmentation du courant KV sept par 100 nanomolaires de zinc périon mesuré avec une pince de tension continue à moins 20 millivolts. Montré. Voici les courbes de tension de courant moyennes dérivées des sept densités de courant KV enregistrées précédemment pendant le traitement avec 100 nanomolaires de zinc périon, et pendant le traitement avec 10 micromolaires du bloqueur à sept canaux KV XC 9 9 1 relaxation induite par l’ion zinc de l’artère mésentérique pré-rétrécie avec 100 picomolaire arginine vasopressine.

Cette figure montre le déroulement temporel des changements dans le diamètre extérieur du récipient en réponse à l’application de 100 d’arginine vasopressine picomolaire, suivie de l’application de 100 ions zinc nanomolaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les artères pour l’isolement de cellules uniques ou pour la mesure myographique de la pression de la constriction artérielle, des réponses du dilatateur. De plus, vous devez savoir comment enregistrer les courants KV sept de manière isolée des autres courants dans les myocytes artériels fraîchement isolés.