Explorer muscle lisse artériel KV7 fonction des canaux potassiques à l'aide d'électrophysiologie patch-clamp et myographie pression

L'objectif général de cette procédure est de mesurer l'activité des canaux potassiques KV sept dans des cellules musculaires lisses artérielles mésentériques dissociées fraîchement, et de relier ces mesures aux variations du diamètre artériel enregistrées dans des conditions physiologiques. Ceci est réalisé en premier lieu par l'ablation chirurgicale de l'arcade vasculaire mésentérique d'un rat. La deuxième étape consiste à disséquer et à nettoyer les segments des artères mésentériques.

Ensuite, certains segments sont utilisés pour isoler des cellules musculaires lisses individuelles afin de réaliser des mesures électrophysiologiques par enregistrement en configuration patch clamp des courants potassiques KV sept. La dernière étape consiste en la canulation de segments artériels intacts pour des mesures de myographie sous pression de la constriction ou de la dilatation artérielle en réponse à des modulateurs pharmacologiques des canaux potassiques KV sept. En définitive, la combinaison de l'électrophysiologie en configuration patch clamp et de la myographie sous pression permet de montrer comment une augmentation ou une diminution de l'activité des canaux potassiques KV sept affecte la constriction des artères mésentériques.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'utilisation de canaux clonés exprimés dans des lignées cellulaires, est que les courants sont enregistrés à partir de cellules non cultivées qui expriment naturellement les canaux, et que les courants KV peuvent être isolés des autres classes de canaux potassiques qui pourraient être activés dans les mêmes cellules. La myographie sous pression permet d'enregistrer les réponses fonctionnelles à partir du même tissu dont sont issues les cellules isolées, et cette méthode est à la fois plus sensible et plus physiologique que d'autres préparations, comme les anneaux artériels ou les lamelles artérielles. Le Dr Bareth Mani, chercheur postdoctoral de mon laboratoire, démontrera les techniques de canulation artérielle et de myographie sous pression, et la Dre Luba Brueggeman, professeure assistante de recherche dans mon laboratoire, démontrera les procédures d'isolement cellulaire et de patch plan.

Pour commencer cette procédure, utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux pour couper un segment de 10 à 12 centimètres aux deux extrémités de l'intestin grêle d'un rat. Ensuite, isolez l'intestin avec sa vascularisation associée. Puis, fixez le segment d'intestin grêle.

Étendre le mésentère sur le côté proche de la chambre de manière à ce que la branche principale de l'artère mésentérique supérieure soit au centre et que les branches des ordres suivants rayonnent depuis le centre. Ensuite, insérer les épingles uniquement sur les segments intestinaux en utilisant un microscope stéréoscopique éclairé. Retirer soigneusement le tissu adipeux et le tissu conjonctif entourant les artères des deuxième à quatrième ordres près des intestins à l’aide de pinces et de ciseaux microchirurgicaux.

Tenez fermement les veines adjacentes pour faciliter l'élimination du tissu adipeux et du tissu conjonctif et éviter tout étirement inutile des artères. Transférez ensuite deux à trois segments de l'artère mésentérique dans une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres contenant deux millilitres de solution d'isolement glacée. Placez la boîte sur de la glace par la suite, puis découpez les segments de l'artère mésentérique en morceaux de trois à quatre millimètres de longueur à l’aide d’une pipette PE dont la pointe a été lissée à la flamme.

Transférez les segments artériels dans un flacon en verre contenant deux millilitres de solution d'isolement préchauffée à 37 degrés Celsius. Incubez ensuite pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après 30 minutes, aspirez soigneusement la solution d'isolement à 37 degrés Celsius à l’aide d’une pipette postérieure.

Ajoutez deux millilitres de solution enzymatique tiède, puis incubez pendant 35 minutes à 37 degrés Celsius. Immédiatement après l'incubation de 35 minutes dans la solution enzymatique, placez le tube sur de la glace, aspirez la solution enzymatique et ajoutez deux millilitres de solution d'isolement glacée. Répétez cette procédure quatre fois.

Ensuite, dans un millilitre de solution d'isolement glacée, passer délicatement les segments artériels avec la pipette postérieure polie de 10 à 20 fois afin de libérer des cellules musculaires lisses artérielles mésentériques individuelles. Vérifier périodiquement l'apparence des myocytes en déposant une goutte de la suspension cellulaire dans une boîte de 35 millimètres et en les observant au microscope.

Les CML saines issues de l'artère mésentérique devraient présenter une morphologie allongée et lisse. Ensuite, transférez environ 100 à 200 microlitres de suspension cellulaire dans la chambre d'enregistrement à l’aide d’une pipette Pasteur polie et laissez les cellules adhérer pendant 15 minutes. À cette étape, remplissez l’extrémité de la pipette de patch avec de l’amphotéricine B en trempant l’orifice de la pipette dans la solution interne exempte d’amphotéricine B.

Ensuite, appliquez une aspiration à l'autre extrémité à l'aide d'une seringue de 10 millilitres reliée par un morceau de tube, en ajoutant la solution de pipetage contenant la terine B par le haut. Utilisez une micro-pipette Einor jusqu'à ce que la pipette soit remplie environ à moitié de solution. Éliminez les bulles d'air en tapotant doucement la pipette.

Ensuite, insérez la pipette dans le porte-électrode. Utilisez un micromanipulateur pour abaisser la pipette jusqu'à la surface d'un myocyte allongé. Lorsque la résistance de la pipette augmente jusqu'à six à dix mégohms, appliquez une aspiration pour obtenir un scellement gigaseal.

En même temps, régler la tension de maintien à zéro millivolt pendant l'attente de la perforation membranaire. Ensuite, appliquer des paliers de tension de 100 millisecondes à plus 10 millivolts, puis à moins 10 millivolts. Utiliser l'amplificateur pour compenser le transitoire de capacité de pipette rapide apparaissant simultanément à la capacité de la cellule entière.

Des courants positifs transitoires petits et soutenus, de deux à 10 picoampères, stables en amplitude, indiquent la présence de canaux KV7 fonctionnels. Une perforation réussie avec de l'amphotéricine B réduira la résistance d'accès à 35 mégaohms ou moins. Pour enregistrer la relation courant-tension des canaux KV7, appliquez des paliers de tension de cinq secondes à des potentiels allant de −84 millivolts, où la probabilité d'ouverture des canaux KV7 est minimale, à +16 millivolts, où la probabilité d'ouverture des canaux KV7 atteint un plateau. Après cinq secondes à chaque tension d'essai, revenez au potentiel de maintien à −4 millivolts pendant 10 secondes.

Dans cette procédure, suspendez légèrement deux fils de nylon fins préfabriqués de chaque côté. À l'aide d'une paire de pinces microchirurgicales tenant une extrémité du segment, transférez soigneusement le segment d'artère mésentérique prélevé de la chambre de dissection vers la chambre de myographie sous pression en le plaçant à côté de la canule en verre. Ensuite, en visualisant à travers un microscope stéréo éclairé, saisissez une extrémité du segment artériel et faites-le glisser délicatement sur la canule en verre gauche.

Fixez l'extrémité à l'aide des fils de suture en nylon. Ensuite, rincez doucement le liquide de la lumière à travers le vaisseau monté pour éliminer le sang et les débris. La vanne de la seringue gauche doit alors être fermée afin que ce côté présente une colonne statique de liquide contre laquelle la pression est ajustée depuis le côté droit ; à l'aide du micromanipulateur, rapprochez la canule en verre mobile droite de plus en plus près du segment artériel et faites glisser l'extrémité droite du segment par-dessus celle-ci.

Enfin, fixez le segment artériel à l’aide de fils de suture en nylon et coupez les extrémités excédentaires des fils de suture. Placez maintenant l’unité de graphique de pression sur la platine, au-dessus du microscope de micrographie de pression. Connectez la colonne de pression au côté droit de la chambre de graphique, puis placez le couvercle sur la chambre.

Augmentez progressivement la seringue de 10 millilitres sur une période de 15 minutes et vérifiez la présence de fuites dans le vaisseau jusqu'à ce que le transducteur de pression P1 indique 80 millimètres de mercure ; ajustez la distance entre la canule si nécessaire, de sorte que le segment artériel sous pression soit approximativement droit et forme un motif en forme d'épaule au niveau des ligatures. Vérifiez la viabilité du vaisseau monté par une superfusion transitoire avec du chlorure de potassium à 60 millimolaire pendant 30 secondes. Un vaisseau viable se contracte rapidement après l'ajout de chlorure de potassium et se dilate immédiatement lors de son lavage.

Ensuite, ajoutez la substance test concentrée directement dans la solution du bain en la pipetant doucement plusieurs fois près de l'extrémité de la chambre afin de mélanger la substance test dans la solution du bain, obtenant ainsi la concentration finale appropriée dans la chambre de 10 millilitres. Les variations de volume liées au diamètre du vaisseau après l'ajout de la substance test peuvent être surveillées en temps réel sur l'image vidéo et également tracées dans la fenêtre d'analyse d'image pendant que l'expérience est en cours. Cette figure montre une série de courants enregistrés successivement en réponse à des paliers de tension avant traitement, représentés en noir, et après stabilisation en présence de 100 nanomolaires de zinc perion dans un myocyte isolé d'artère mésentérique, représentés en rouge ; voici les courants représentatifs pour le témoin et pour 100 nanomolaires de zinc perion.

Les barres grises indiquent l'intervalle de temps pendant lequel les amplitudes de courant moyennes ont été mesurées. Pour les tracés courant-tension, les tensions par paliers sont indiquées à droite par des pointes de flèche. Il s'agit du cours temporel du renforcement du courant KV sept par l'ion zinc à 100 nanomolaire, mesuré en utilisant un clampage de tension continu à −20 millivolts, tel que montré. Voici les courbes moyennes courant-tension dérivées des densités de courant KV sept enregistrées avant et pendant le traitement avec l'ion zinc à 100 nanomolaire, ainsi que pendant le traitement avec 10 micromolaire du bloqueur des canaux KV sept XC 9 9 1. L'ion zinc induit une relaxation de l'artère mésentérique pré-constricte par la vasopressine arginine à 100 picomolaire.

Cette figure montre l'évolution temporelle des changements du diamètre externe du vaisseau en réponse à l'application de 100 picomolaires d'arginine vasopressine, suivie de l'application de 100 nanomolaires d'ions zinc. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des artères pour l'isolement de cellules individuelles ou pour la mesure myographique sous pression de la constriction artérielle et des réponses de dilatation. De plus, vous devriez savoir enregistrer les courants KV sept dans l'isolement par rapport aux autres courants chez les myocytes artériels fraîchement isolés.