Itératif d'optimisation des duplex d'ADN pour la cristallisation des complexes ADN-SEQA

Cette expérience détaille comment obtenir des cristaux de qualité diffraction d’une protéine liée à l’ADN contenant un hem en tandem méthylé. GATC. Répétez l’opération pour favoriser l’empilement cristallin du complexe protéique ADN. Commencez par la conception rationnelle de la longueur de l’ADN, de l’espacement GATC et des extrémités de l’ADN, procédez avec les oligonucléotides simples brins complémentaires pour purifier l’ADN, puis ajustez l’ADN méthylé duplex hémi, puis mélangez le séquençage A purifié pour former le complexe.

Ensuite, trouvez les conditions optimales pour faire croître des cristaux de qualité diffraction du complexe protéique ADN avec des essais de cristallisation à l’aide de cribles commerciaux à matrice creuse. Résultats démontrés. Partager l’effet de la variation de la longueur de l’ADN, de l’espacement et des extrémités GATC sur la qualité de diffraction des cristaux d’ADN CQ A.

L’objectif de ce travail est d’obtenir des cristaux de qualité diffraction de CK liés à l’ADN, mais il peut également aider à comprendre les variables générales qui doivent être prises en compte lors de la conception de duplex d’ADN pour la cristallisation d’autres complexes d’ADN protéique, démontrant que cette procédure sera utilisée à Chang, A pour le boursier de doctorat de mon laboratoire. Cette étude utilise une variante des protéines régulatrices de réplication de l’ADN. Recherchez un qui forme des dimères stables et a une région de liaison raccourcie entre ses domaines de liaison et de liaison à l’ADN.

Cette variante limite la liaison de l’ADN à des répétitions GATC en tandem séparées exclusivement par un tour sur la première transformée de l’ADN BBL 20 1D trois cellules avec le plasmide codant pour DEMETRIC seq A sous le contrôle de la plaque promotrice T sept. La réaction de transformation sur des plaques de gélose LB contenant 100 microgrammes par millilitre, de l’ampicilline et de la place dans l’incubateur bactérien pendant la nuit. Choisissez des colonies mixtes et commencez une culture nocturne à petite échelle.

Le lendemain matin, inoculateur d’un litre de culture avec 10 millilitres de l’inoculum de nuit. Lorsque la culture est en phase logarithmique, ajoutez deux millilitres d’IPTG à 0,5 molaire pour induire la production de protéines. Poursuivre l’incubation pendant trois heures dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius.

Récoltez ensuite les cellules par centrifugation à 3,300 G pendant 10 minutes. Reese, suspendre la palette cellulaire en purification, tamponner a lies par sonication et éclaircir le lysat par centrifugation à 39 000 fois G pendant 40 minutes. Chargez maintenant le surnageant S sur une colonne d’héparine équilibrée avec un tampon de purification.

Pour éluer la protéine CK. Utilisez un gradient linéaire jusqu’à une molaire de chlorure de sodium, la protéine CK élue à environ 0,7 molaire de chlorure de sodium. Tirez sur les fractions contenant la CK et diluez-la pour réduire la force ionique de l’échantillon.

Chargez ensuite l’échantillon dans une colonne de chromatographie échangeuse de cations E équivalente à un tampon de purification. Appliquez un gradient de sel linéaire pour boucler la protéine CK pure à environ 0,4 molaire de chlorure de sodium. Combinez les fractions contenant la CK.

Concentrez-vous à trois milligrammes par millilitre et conservez-le. Conception du tampon : oligonucléotides non méthylés et méthylés complémentaires. Préparez des échantillons d’une micromole de chaque ADN simple brin lyophilisé dans 800 microlitres d’autoclave, de vortex d’eau distillée double et laissez reposer pendant 15 minutes maintenant et 800 microlitres.

Avoir préchauffé deux fois le tampon de chargement à chaque échantillon pour 20 à 30 nucléotides longs oligonucléotides préparer un grand gel dénaturant à 10 %. Une fois polymérisé, retirez le peigne et rincez abondamment le puits. Assemblez le gel en remplissant les réservoirs supérieur et inférieur avec un tampon de fonctionnement TBE.

Pré-exécutez le gel à 750 volts pour réchauffer le gel à 55 degrés Celsius. Ensuite, arrêtez la course et rincez abondamment les puits avec un tampon de coulée. Maintenant, chauffez les oligonucléotides à 90 degrés Celsius pendant deux minutes.

Vortex et rotation. Les échantillons procèdent immédiatement au chargement du gel. Faites fonctionner le gel à environ 700 volts jusqu’à ce que l’oligonucléotide ait migré.

À mi-chemin Sur un gel de poly acrylamide à 10 %, le bleu d’alphénus phénol migre avec des oligonucléotides d’environ 20 bases de long et du xylène syl ff d’environ 60 bases de long. Démontez le gel de l’appareil et retirez les entretoises sur une surface plane. Retirez une plaque de verre et couvrez le gel d’une pellicule plastique.

Retournez ensuite le gel, retirez l’autre plaque de verre et couvrez le gel d’une pellicule plastique. Ensuite, marquez les bandes à l’aide d’une lumière UV et d’une plaque fluorescente derrière le gel. Pour voir l’ombre de l’ADN avec une lame de rasoir, excisez la bande et coupez-la en petits morceaux.

Transférez chaque échantillon dans un tube stérile de 15 millilitres. Ajouter neuf millilitres de tampon elucian et diluer toute la nuit à 37 degrés Celsius en agitant. Transférez soigneusement la solution dans un tube de centrifugation d’autoclave à l’aide d’une pointe de pipette de chargement de gel.

Pour éviter de transférer des morceaux d’acrylamide, ajoutez un millilitre d’acétate de sodium à un pH sept plus 25 millilitres d’éthanol 100 % réfrigéré à incuber à moins 20 degrés Celsius pendant au moins trois heures. Centrifugez l’ADN précipité. Ensuite, séchez les granulés sur l’aspirateur rapide à feu moyen, remettez en suspension chaque granulé dans 400 microlitres d’autoclave, d’eau distillée deux fois et transférez-les dans un tube frais.

Ajoutez 40 microlitres d’acétate de sodium à trois molaires à pH sept et un millilitre de vortex d’éthanol à 100 % et incubez pendant 30 minutes à moins 20 degrés Celsius après centrifugation pendant 15 minutes à 18 000 fois. G, rincez les granulés d’ADN avec 100 microlitres d’éthanol froid à 70 % pour éliminer tout résidu de sel pendant six minutes à 18 000 fois. G puis jetez l’éthanol et faites sécher le granulé sur un aspirateur rapide.

Maintenant, renvoyez chaque granulé dans 100 microlitres d’eau double distillée en autoclave. Déterminer la concentration des oligonucléotides par spectrométrie. Pour préparer les duplex d’ADN méthylé hémi, mélangez d’abord des concentrations molo égales de brins simples complémentaires.

Ensuite, chauffez les mélanges à 95 degrés Celsius dans un bain-marie pendant cinq minutes pour anil les brins. Laissez les échantillons refroidir lentement à température ambiante à l’intérieur du bain-marie. Combinez des volumes égaux de 81 micromolaires purifiés de protéine CQ a et de 81 micromolaires d’ADN méthylé.

Ensuite, incubé à température ambiante pendant 15 minutes. Conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à l’utilisation d’un tamis pour les conditions de cristallisation à l’aide de tamis à matrice clairsemée du commerce. Une fois que les premières pistes de cristallisation ont été identifiées, optimisez les conditions pour faire pousser des cristaux de qualité diffraction pour pleurer et protéger les cristaux d’ADN CK résultants.

Augmentez la quantité de PEG 400 présente dans la solution de cristallisation jusqu’à une concentration finale de 25 % ou ajoutez 20 % de glycérol à la solution de cristallisation. Retirez les cristaux individuels avec une boucle en nylon flash. Congelez les échantillons dans de l’azote liquide.

Testez maintenant la limite de diffraction de chaque cristal à 100 k. Pour obtenir la structure cristalline du mutant raccourci de CK lié à l’ADN méthylé Hemi, nous optimisons consécutivement trois paramètres sur l’ADN, l’espacement entre les séquences GATC méthylées Hemi, la longueur du duplex et l’absence ou la présence de cinq surplombs premiers. Cette étude utilise une variante DME de seek a avec une mutation ponctuelle dans le domaine terminal final qui empêche une ligamentisation ultérieure et un linker raccourci qui limite la liaison de l’ADN au tandem.

Les répétitions GATC séparées exclusivement d’un tour lors des tests de décalage d’électromobilité de l’ADN indiquent que la protéine CK modifiée se lie préférentiellement aux répétitions GATC séparées par neuf à 10 paires de bases. Par conséquent, les écrans initiaux utilisent des duplex de 23 à 24 paires de bases de long contenant deux ourlets méthylés. Répétitions GATC séparées par neuf ou 10 paires de bases.

Trois duplex ont donné des cristaux de belle forme. Bien qu’aucun des cristaux ne se soit défracté à haute résolution. Les données ont indiqué que la séparation A-G-A-T-C de neuf paires de bases était préférée pour la cristallisation, améliorant de manière inattendue les interactions squelette du sillon en incluant un dinucléotide CG entre les deux sites GATC n’a pas modifié la limite de diffraction des cristaux.

En revanche, l’optimisation de la longueur des porte-à-faux a radicalement modifié les contacts moléculaires et la morphologie des cristaux. La structure cristalline de cette protéine CK liée à un duplex d’ADN méthylé a confirmé que la face libre du duplex d’ADN ne s’engage pas dans des contacts cristallins malgré la taille relative de la protéine et de l’ADN, la plupart des interactions entre les partenaires de symétrie sont médiées par les interactions protéine, protéine et ADN protéique. Il est intéressant de noter que, dans ce cas particulier, l’effet bénéfique d’un surplomb de dinucléotides à cinq premiers n’est pas dû à la formation d’un ADN pseudo-continu.

Au lieu de cela, les cinq extrémités premières du brin méthylé se projettent loin des axes de l’ADN et interagissent avec la molécule CK proximale du complexe, ce qui explique pourquoi deux nucléotides étaient strictement nécessaires pour modifier l’empilement des cristaux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier les protéines et de concevoir des duplex d’ADN pour la cristallisation du complexe d’ADN protéique. Il est important de se rappeler que bien que ce protocole ait été un dispositif pour cristalliser le complexe d’ADN CK, l’optimisation rationnelle de la longueur de la séquence et des extrémités de l’ADN fournit un cadre général pour la conception de duplex d’ADN pour la cristallisation d’autres complexes d’ADN protéique.