Itératif d'optimisation des duplex d'ADN pour la cristallisation des complexes ADN-SEQA

Cette expérience décrit comment obtenir des cristaux de qualité diffractante d'une protéine liée à un ADN contenant une répétition en tandem d'une séquence GATC hémi-méthylée, afin de favoriser l'empilement cristallin du complexe protéine-ADN. Commencez par la conception rationnelle de la longueur de l'ADN, de l'espacement des séquences GATC et des extrémités de l'ADN, puis utilisez des oligonucléotides simples brins complémentaires pour purifier l'ADN, puis annealez-les pour former un duplex d'ADN hémi-méthylé. Ensuite, mélangez avec la protéine SeqA purifiée pour former le complexe.

Ensuite, déterminer les conditions optimales pour faire croître des cristaux de qualité diffractante du complexe protéine-ADN, en réalisant des essais de cristallisation à l'aide de tamis commerciaux à matrice éparse. Résultats démontrés. Partager l'effet de la variation de la longueur de l'ADN, de l'espacement GATC et des extrémités sur la qualité diffractante des cristaux de l'ADN CQ A.

L'objectif de ce travail est d'obtenir des cristaux de qualité diffractante du complexe CK lié à l'ADN, mais il peut également aider à comprendre les variables générales à prendre en compte lors de la conception de duplex d'ADN destinés à la cristallisation d'autres complexes protéine-ADN. Cette procédure sera utilisée par Chang, A, boursier doctoral de mon laboratoire. Cette étude utilise une variante des protéines régulatrices de la réplication de l'ADN. Seek a, qui forme des dimères stables et possède une région de liaison raccourcie entre ses domaines de dimérisation et de liaison à l'ADN.

Cette variante restreint la liaison à l'ADN aux répétitions tandem de GATC séparées exclusivement par un tour complet de l'ADN. Transformez d'abord les cellules BBL 20 1D trois avec le plasmide codant pour DEMETRIC seq A sous le contrôle du promoteur T7. Effectuez la réaction de transformation sur des boîtes de gélose LB contenant 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline et placez-les dans l'incubateur bactérien toute la nuit. Prélève des colonies mixtes et démarre une culture de petite échelle en surculture nocturne.

Le lendemain matin, inoculer un litre de milieu avec 10 millilitres de l'inoculum préparé la veille. Lorsque la culture atteint la phase exponentielle, ajouter deux millilitres de IPTG 0,5 molaire pour induire la production de la protéine. Poursuivre l'incubation pendant trois heures dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius.

Ensuite, récoltez les cellules par centrifugation à 3 300 ×g pendant 10 minutes. Resuspendez le culot cellulaire dans le tampon de purification, lysez par sonication et clarifiez le lysat par centrifugation à 39 000 ×g pendant 40 minutes. Chargez ensuite le surnageant S sur une colonne d’héparine équilibrée avec le tampon de purification.

Pour éluer la protéine CK, utilisez un gradient linéaire jusqu'à 1 M de chlorure de sodium ; la protéine CK est élutée vers 0,7 M de chlorure de sodium. Récupérez les fractions contenant la CK et diluez-les pour réduire la force ionique de l'échantillon.

Ensuite, chargez l'échantillon sur une colonne de chromatographie d'échange cationique E équilibrée avec le tampon de purification. Appliquez un gradient linéaire de sel pour éluer la protéine CK pure à environ 0,4 molaire de chlorure de sodium. Rassemblez les fractions contenant la CK.

Concentrer à trois milligrammes par millilitre et conserver au réfrigérateur. Préparer un tampon contenant des oligonucléotides complémentaires non méthylés et méthylés. Préparer des échantillons d'un micromole de chaque brin simple d'ADN lyophilisé dans 800 microlitres d'eau doublement distillée stérilisée par autoclavage, vortexer et laisser reposer 15 minutes, puis ajouter 800 microlitres.

Ajouter deux fois le tampon de charge préchauffé à chaque échantillon pour préparer un grand gel dénaturant à 10 % destiné aux oligonucléotides de 20 à 30 nucléotides de longueur. Une fois polymérisé, retirer le peigne et rincer soigneusement les puits. Assembler le gel en remplissant les réservoirs supérieur et inférieur avec du tampon de migration TBE à une fois.

Faites pré-électrophoréser le gel à 750 volts afin de réchauffer le gel à 55 degrés Celsius. Arrêtez ensuite l'électrophorèse et rincez soigneusement les puits avec du tampon de migration. Chauffez maintenant les oligonucléotides à 90 degrés Celsius pendant deux minutes.

Vortexer et centrifuger. Placer immédiatement les échantillons sur le gel. Faire migrer le gel à environ 700 volts jusqu'à ce que l'oligonucléotide ait migré.

À mi-chemin sur un gel de polyacrylamide à 10 %, le bleu de phénol alph migre conjointement avec des oligonucléotides d'environ 20 bases de longueur, et le xylène syl ff avec des fragments d'environ 60 bases de longueur. Démontez le gel de l'appareil et retirez les entretoises sur une surface plane. Retirez une plaque de verre et recouvrez le gel d'un film plastique.

Ensuite, retournez le gel, retirez l'autre plaque de verre et recouvrez le gel d'un film plastique. Marquez ensuite les bandes à l'aide d'une lumière UV et d'une plaque fluorescente placée derrière le gel. Pour visualiser l'ombre de l'ADN avec une lame de rasoir, excisez la bande et découpez-la en petits morceaux.

Transférez chaque échantillon dans un tube stérile de 15 millilitres. Ajoutez neuf millilitres de tampon éluant et diluez toute la nuit à 37 degrés Celsius sous agitation. Transférez soigneusement la solution dans un tube de centrifugeuse autoclave à l’aide d’une pointe de pipette de chargement de gel.

Pour éviter de transférer des morceaux d'acrylamide, ajouter un millilitre d'acétate de sodium à 3 mM, pH 7, plus 25 millilitres d'éthanol à 100 % refroidi, puis incuber à moins 20 degrés Celsius pendant au moins trois heures. Centrifuger l'ADN précipité. Ensuite, sécher les culots au speed vac à température moyenne, resuspendre chaque culot dans 400 microlitres d'eau doublement distillée stérilisée à l'autoclave et transférer dans un tube neuf.

Ajouter 40 microlitres d'acétate de sodium à trois molar à pH sept et un millilitre d'éthanol à 100 %, vortexer et incuber pendant 30 minutes à moins 20 degrés Celsius après une centrifugation de 15 minutes à 18 000 fois. G, rincer les culots d'ADN avec 100 microlitres d'éthanol froid à 70 % pour éliminer tout sel résiduel, centrifuger six minutes à 18 000 fois. G, puis éliminer l'éthanol et sécher le culot au vide accéléré.

Réresuspendez maintenant chaque culot dans 100 microlitres d'eau doublement distillée stérilisée par autoclavage. Déterminez la concentration des oligonucléotides par spectrométrie. Pour préparer les duplex d'ADN hémi-méthylés, mélangez d'abord des concentrations molaires équivalentes des brins simples complémentaires.

Ensuite, chauffer les mélanges à 95 degrés Celsius dans un bain-marie pendant cinq minutes pour dénaturer les brins. Laisser refroidir lentement les échantillons jusqu'à la température ambiante à l'intérieur du bain-marie. Combiner des volumes égaux de 81 micromolaire de protéine CQ purifiée et d'ADN hémiméthylé de 81 micromolaire.

Puis incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Conserver à quatre degrés Celsius jusqu'à l'utilisation pour l'écran des conditions de cristallisation en utilisant des écrans matriciels dispersés commerciaux. Une fois que les premières conditions menant à la cristallisation ont été identifiées, optimiser ces conditions afin d'obtenir des cristaux de qualité diffractométrique. Cryoprotéger les cristaux d'ADN CK obtenus.

Augmenter soit la quantité de PEG 400 présente dans la solution de cristallisation jusqu'à une concentration finale de 25 %, soit ajouter 20 % de glycérol à la solution de cristallisation. Prélever les cristaux individuels à l’aide d’un loop en nylon. Congeler les échantillons dans l’azote liquide.

Testez maintenant la limite de diffraction de chaque cristal à 100 K. Pour obtenir la structure cristalline de la variante tronquée de CK liée à l'ADN hémiméthylé, nous optimisons successivement trois paramètres sur l'ADN : l'espacement entre les séquences GATC hémiméthylées, la longueur du duplex et l'absence ou la présence de mésappariements en 5'. Cette étude utilise une variante DME de seek a comportant une mutation ponctuelle dans le domaine terminal qui empêche toute ligamérisation ultérieure, ainsi qu'un linker raccourci qui restreint la liaison à l'ADN en tandem.

Les répétitions GATC séparées exclusivement par un tour complet sur les tests de migration en gel indiquent que la protéine CK modifiée se lie préférentiellement aux répétitions GATC espacées de neuf à dix paires de bases. Par conséquent, les criblages initiaux utilisent des duplexes de 23 à 24 paires de bases contenant deux répétitions GATC hémi-méthylées, séparées soit par neuf, soit par dix paires de bases.

Trois duplexes ont produit des cristaux bien formés. Aucun des cristaux n'a toutefois diffracté à haute résolution. Les données ont tout de même indiqué que la séparation A-G-A-T-C de neuf paires de bases était préférée pour la cristallisation, augmentant de manière inattendue les interactions entre la rainure et le squelette ; l'ajout d'un dinucléotide CG entre les deux sites GATC n'a pas modifié la limite de diffraction des cristaux.

En revanche, l'optimisation de la longueur des extrémités en surplomb a considérablement modifié les contacts moléculaires et la morphologie cristalline. La structure cristalline de cette protéine CK liée à un duplex ADN hémiméthylé a confirmé que la face libre du duplex ADN n'entre pas en contact cristallin, malgré la taille relative de la protéine et de l'ADN ; la plupart des interactions entre molécules apparentées par symétrie sont médiées par des contacts protéine-protéine et protéine-ADN. Fait intéressant, dans ce cas particulier, l'effet bénéfique d'un surplomb dinucléotidique en 5' n'est pas dû à la formation d'un ADN pseudo-continu.

Au lieu de cela, l'extrémité 5' du brin méthylé s'étend vers l'extérieur par rapport à l'axe de l'ADN et interagit avec la molécule de CK voisine du complexe, ce qui explique pourquoi deux nucléotides étaient strictement nécessaires pour modifier l'empaquetage cristallin. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la purification des protéines et de la conception de duplex d'ADN pour la cristallisation de complexes protéine-ADN. Il est important de garder à l'esprit que, bien que ce protocole ait été conçu pour cristalliser le complexe CK-ADN, l'optimisation rationnelle de la longueur, de la séquence et des extrémités de l'ADN fournit un cadre général pour la conception de duplex d'ADN destinés à la cristallisation d'autres complexes protéine-ADN.