Name: Les tissus dingénierie muscle squelettique de myoblastes murins cellules progénitrices et application dune stimulation électrique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Découvrez l'ingénierie de tissus musculaires squelettiques à partir de myoblastes murins et l'application d'une stimulation électrique pour induire des contractions et analyser l'organisation sarcomérique.

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Les auteurs tiennent à remercier Yabin Wu pour la culture des tissus présentés dans la figure 2, l&#39;image a été prise par Bart van Overbeeke. Ce travail a été soutenu financièrement par SenterNovem, ISO 42022 subvention.

1. Culture de myoblastes murins cellules progénitrices ou des cellules C2C12 <ol><li> Isoler les cellules selon le protocole initialement publié par Shefer et ses collègues 10 et plus tard adapté par Collins et al. 11 et Boonen et al. 12 et les conserver dans l&#39;azote liquide. Cela nécessite la souris, par exemple C57BL / 6. D&#39;autres méthodes sont utilisées dans d&#39;autres laboratoires, par exemple, une méthode publiée dans le Journal of expériences visualisées par Li Y et al. 13. Pour les réactifs et les équipements sont renvoyés au tableau de la page 7 et 8. Depuis le muscle d&#39;une souris, vous aurez généralement obtenir suffisamment de cellules pour la cryoconservation environ 20 flacons dans l&#39;azote liquide. Ensuite, nous commençons le protocole de décongeler les cellules du stockage d&#39;azote liquide. </li><li> Placer les cellules du flacon 1 dans un 25 cm 2 Matrigel (1 mg / ml) revêtu flacon de culture tissulaire et ajouter le milieu de croissance (GM) constitué de (335 ml de DMEM advanced, 100 ml bovin foetale sérum (FBS), 50 ml SH, 5 ml de pénicilline / streptomycine, 5 ml de L-glutamine, 5 ml d&#39;extrait d&#39;embryon de poulet (CEE)). </li></ol> Remarque: manteau pendant 2 heures à température ambiante et retirez le Matrigel par aspiration. <ol start="3"><li> Sous-culture des cellules d&#39;environ 1:3 tous les 3 jours. Cela signifie: jour 3: cellules passage d&#39;un 25 cm 2 à un flacon de 75 cm2, le jour 6: cellules de passage d&#39;un flacon de 75 cm2 à deux flacons de 150 cm2 (avec 30 min de prédépôt dans des flacons non couchés). Le jour 9 transfert unique 150 cm 2 flacon de 1 triple ballon de 150 cm 2, ou à défaut à trois flacons de 150 cm 2 (si nécessaire preplate nouveau en fonction du phénotype des cellules). Le jour 12, les cellules sont prêtes pour l&#39;ensemencement dans une construction musculaire. </li></ol> Notes: - Par trois fois 150 cm 2 le nombre de cellules sera d&#39;environ 4,5 x 10 6 cellules. - Utilisez vials de isolements différents pour les mélanger pour obtenir une population mixte de cellules au moment de l&#39;ensemencement. Remarque: Si vous choisissez de ne pas travailler avec des cellules primaires, myoblastes C2C12 sont une bonne alternative. 2. Ingénierie des tissus musculaires squelettiques <ol><li> Préparer la colle silicone en mélangeant le &quot;élastomère&quot; avec le &quot;durcisseur&quot; (10:1). Couper + / - 5 mm segments carrés de Velcro avec un côté triangulaire (maison-comme la forme, la figure 1). Coller le velcro dans les puits d&#39;une plaque de culture à 6 puits dans un espace d&#39;environ 12 mm entre les carrés. </li></ol> Remarques: - Utilisez uniquement le côté doux du velcro et faire face à ce côté vers le haut. - Assurez-vous que les toits en face de l&#39;autre. - Ne couvrez le velcro avec colle silicone, colle ne se propagent pas à travers le puits. - Pour la stimulation électrique ultérieure, il est pertinent d&#39;aligner les constructions dans le sens vertical du puits jmangé (le long de l&#39;axe long). <ol start="2"><li> Laisser sécher une nuit dans un four sous vide, pas chauffé, principalement pour éliminer les bulles d&#39;air. Stériliser en ajoutant EtOH à 70% dans les puits et incuber pendant 15 min. Rincer 3x avec PBS et mis sous UV pendant 15 min. Retirez tous PBS dans les puits et le Velcro et le lieu dans l&#39;incubateur jusqu&#39;à leur utilisation. </li><li> Décongeler la solution au réfrigérateur Matrigel et préparer la solution de collagène à la concentration désirée avant d&#39;effectuer rapidement les constructions 3D. Diluer le collagène stérile stock avec l&#39;acide acétique 0,02% (concentration finale de 3,2 mg / ml). </li></ol> Remarque: tout laisser sur la glace. <ol start="4"><li> Trypsiniser les cellules, remettre en suspension dans GM et le nombre. Laisser les cellules dans un tube de centrifugation dans l&#39;incubateur. </li><li> Ajouter la quantité voulue de solution de collagène pour le nombre de constructions que vous voulez faire un tube (selon le tableau 1), ajouter 0,5 M NaOH à cette solution de collagène jusqu&#39;à ce qu&#39;une lumière colo roseR indique un pH de 7,5. Mélanger doucement par pipetage de haut en bas et d&#39;éviter la formation de bulles. Puis ajouter le Matrigel et mélanger très délicatement mais soigneusement. Enfin, ajoutez le au mélange GM collagène / Matrigel (pour les quantités appropriées voir tableau 1). </li></ol> Notes: - Effectuez chaque étape sur la glace! Matrigel et du collagène sera facile de gel à température augmente. - Occupe-toi que la couleur est bien rose! L&#39;augmentation du pH va également induire une gélification rapide. - La concentration finale de collagène: 1,6 mg / ml. <ol start="6"><li> Centrifuger la quantité désirée de cellules à 1000 rpm pendant 5 min et éliminer le surnageant. </li></ol> Remarque: - En fonction de l&#39;activité des cellules du nombre de cellules par la construction doit être ajusté. En règle générale, le nombre de cellules se situe entre 750.000 et 1.250.000 cellules par construction. <ol start="7"><li> Utiliser une partie du mélange de gel pour remettre en suspension le culot cellulaireet transférer les cellules dans le mélange restant et mélanger soigneusement, mais sans introduire de bulles d&#39;air. </li><li> Prenez les assiettes préchauffées et hors de l&#39;incubateur et pipette de 0,35 ml -0.4 du mélange de cellules-gel dans le premier Velcro. Puis, commencez à introduire à la pipette le mélange du centre entre les sites de fixation et d&#39;étendre à la bande Velcro. Enfin, utiliser le reste de gel pour combler le fossé entre les ancrages velcro deux et pipettes autour des morceaux de Velcro. </li><li> Vérifiez soigneusement après 5-10 min si les gels sont suffisamment solides pour être transférés, c&#39;est-à tapoter doucement les plats et inspecter visuellement si le gel est rigide. Si c&#39;est le cas, placez soigneusement la vaisselle dans un incubateur. Habituellement, ils peuvent être ramassés au bout de dix minutes. Puis, après hr 1-2, doucement recouvrir chaque gel avec 4 ml d&#39;eau tiède GM. </li></ol> Remarque:-Ne faites pas de mouvements vigoureux lors de la manipulation des plaques. <ol start="10"><li> Remplacer par GM milieu de différenciation (milieu de croissancesans extrait d&#39;embryon de poulet) au bout de 24 h, et le remplacer par du milieu frais tous les 2-3 jours. Le jour 7, vous devez avoir obtenu fibres musculaires matures orientées, comme on peut être évaluée avec la coloration pour le développement striation transversale dans les fibres musculaires fusionnées. </li></ol> 3. Stimulation électrique <ol><li> Stériliser les électrodes de la plaque ionoptix (voir tableau des réactifs et du matériel) avant de l&#39;utiliser avec de l&#39;éthanol 70% puis séché sous UV dans une enceinte de sécurité. Placer la plaque d&#39;électrodes sur la plaque de culture avec les constructions et couvrir avec le couvercle de la plaque de culture et transfert dans un incubateur. Branchez le Ionoptix C-stimulateur avec les câbles appropriés. </li></ol> Remarque: Les électrodes sont placées parallèlement aux côtés de la construction musculaire (figure 2). <ol start="2"><li> Appliquer le protocole de stimulation comme prévu. </li></ol> Remarque: Nous utilisons généralement 4 V / cm,6 ms impulsions à une fréquence de 2Hz. Changer milieu de culture tous h 24 pendant la stimulation.

<ol><li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+the+new+meat%3A+tissue+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle.</a> Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).</li>
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<li>Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).</li>
<li>Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vascular+organization+enhances+functional+integration+of+engineered+skeletal+muscle+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

L&#39;ingénierie des tissus musculaires a un grand potentiel pour l&#39;utilisation comme un modèle de la maladie, pour le criblage de médicaments, la médecine régénérative et pour la production de viande. Toutefois, les exigences de ces applications varient. Nous avons choisi de travailler avec une combinaison de collagène et d&#39;matrigel, parce que le collagène permet l&#39;alignement des cellules et parce que les cellules progénitrices de myoblastes nécessitent la présence de protéines de membrane basale dérivés te...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Matrigel-facteur de croissance réduit </td><td> Beckton Dickinson et </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM (glycémie élevée) * </td><td> Gibco </td><td> 42430 </td><td></td></tr><tr><td> Avancée DMEM </td><td> Gibco </td><td> 12491 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de cheval </td><td> Gibco </td><td> 65050-122 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Greiner </td><td> 758075 </td><td></td></tr><tr><td> 0,45 et 0,22 um seringue filtre * </td><td> Whatmann (Schleicher et Scheull) </td><td> 10462100 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030024 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 10378016 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotéricine </td><td> Gibco </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Culture en plastique </td><td> Greiner </td><td></td><td> Comprend des flacons de culture et de pipettes </td></tr><tr><td> Extrait d&#39;embryon de poulet </td><td> Etats-Unis biologique </td><td> C3999 </td><td></td></tr><tr><td> Pipette Pasteur * </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td> Pipettes Pasteur, avec constriction, avec du coton, L pointe ouverte: 230 mm avec diamètre de pointe de 0,9 - 1,1 mm </td></tr><tr><td> Pipette Pasteur * </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td> Pipettes Pasteur, avec constriction, avec du coton, L pointe ouverte: 230 mm avec diamètre de pointe de 1,4 - 1,6 mm </td></tr><tr><td> Pipette Pasteur </td><td> VWR </td><td> 612-1702 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase de type I* </td><td> Sigma </td><td> C0130-16 </td><td></td></tr><tr><td> 40 um tamis cellulaire * </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguille 19G </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Élastomère </td><td> Dow Corning Corporation </td><td> 3097358-1004 </td><td> Silastic MDX 4-4210 # </td></tr><tr><td> Durcisseur </td><td> Dow Corning Corporation </td><td></td><td> Silastic MDX 4-4210 # </td></tr><tr><td> Velcro </td><td> Magasin ordinaire </td><td></td><td> Vous pouvez acheter ce dans un magasin régulier, utilisez uniquement le côté doux </td></tr><tr><td> Le collagène de type I, queue de rat </td><td> BD Biosciences </td><td> 3544236 </td><td></td></tr><tr><td> C-Pace Pacer Culture EP </td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Des boîtes de culture à 6 puits pour la stimulation électrique </td><td> Beckton Dickinson-Falcon </td><td> BD Falcon # 353846 </td><td></td></tr><tr><td> C-vaisselle électrodes boîte de culture </td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * Nécessaire pour l&#39;isolement de cellules (point 1.1) # Ensemble dans un kit </td></tr></tbody></table>

les tissus d&#39;ingénierie muscle squelettique de myoblastes murins cellules progénitrices et application d&#39;une stimulation électrique

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Les tissus musculaires modifiées peuvent être utilisées à des fins différentes, qui comprend la production de tissus pour une utilisation en tant que modèle in vitro la maladie, par exemple pour étudier les escarres, pour la médecine régénérative et en tant que solution de rechange 1 viande. Les premières constructions rapportées musculaires 3D ont été faites il ya plusieurs années et pionniers dans le domaine sont Vandenburgh et ses collègues 2,3. Les progrès réalisés dans l&#39;ingénierie des tissus musculaires ne sont pas seulement le résultat du gain vaste connaissance des facteurs biochimiques, les cellules souches et les cellules progénitrices, mais sont en base notamment sur les connaissances acquises par les chercheurs que les facteurs physiques jouent un rôle essentiel dans le contrôle du comportement cellulaire et développement du tissu. State-of-the-art musculaire ingénierie construit actuellement composé de constructions d&#39;hydrogel cellules peuplées. Dans notre laboratoire, ceux-ci sont généralement constitués de cellules murines souches isolées à partir de myoblastes murins, les muscles des membres postérieurs ou une ligne de myoblastes murins C2C12, mixe avec un mélange de collagène / Matrigel et étalées entre deux points d&#39;ancrage, mimant les ligaments musculaires. D&#39;autres cellules peuvent être pris en compte, par exemple, des lignées cellulaires alternatives telles que les myoblastes de rat L6 4, néonatale cellules musculaires précurseurs dérivés 5, les cellules dérivées de tissus musculaires adultes d&#39;autres espèces telles que 6 humaine ou même cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS) 7 . La contractilité cellulaire provoque l&#39;alignement des cellules le long de l&#39;axe long de la construction et de 8,9 différenciation des cellules progénitrices musculaires après environ une semaine de culture. En outre, l&#39;application d&#39;une stimulation électrique peut améliorer le processus de différenciation dans une certaine mesure 8. En raison de sa taille limitée (8 x 2 x 0,5 mm), le tissu complet peut être analysée en utilisant la microscopie confocale à surveiller la viabilité, par exemple, la différenciation et l&#39;alignement des cellules. Selon l&#39;application spécifique, les exigences relatives à l&#39;ingéle tissu musculaire rouge varie; par exemple l&#39;utilisation pour la médecine régénérative nécessite la mise à l&#39;échelle de la taille et de la vascularisation des tissus, tandis que pour servir de translation alternatif de la viande à d&#39;autres espèces est nécessaire.

Le produit final sera constructions musculaires, comme indiqué à la figure 3. La taille du tissu sera d&#39;environ 8 mm de long, 2 mm de large et 0,5 mm d&#39;épaisseur. La stimulation électrique au cours de la différenciation va changer l&#39;expression des isoformes de myosine à chaîne lourde, mais n&#39;a pas grandement améliorer le processus de différenciation induite par le support 8 différenciation, mais la stimulation électrique peut également être appliqué à la fin du processus pour vérifier la...

Tissu musculaire d&#39;ingénierie a un grand potentiel pour la médecine régénératrice, comme modèle de la maladie et aussi comme une source alternative pour la viande. Nous décrivons ici la technique d&#39;une construction musculaire, dans ce cas, à partir de cellules souches de souris myoblastes, ainsi que la stimulation par des impulsions électriques.

Les tissus d&#39;ingénierie muscle squelettique de myoblastes murins cellules progénitrices et application d&#39;une stimulation électrique

Les tissus musculaires d'ingénierie peuvent être utilisés à plusieurs fins différentes, notamment la production de tissus destinés à servir de modèle de maladie in vitro, par exemple pour...

L'objectif général de cette procédure est de produire des tissus musculaires ingénierisés. Cela est réalisé en premier lieu en cultivant des cellules satellites ou une lignée cellulaire de myoblastes afin d'obtenir le nombre requis de cellules. La deuxième étape consiste à fabriquer les points d'ancrage.Ensuite, les cellules sont mélangées à un gel et le mélange obtenu est coulé entre les points d'ancrage. La dernière étape consiste à différencier les cellules en tissu musculaire. Enfin, une stimulation électrique peut être utilisée pour induire la contraction des cellules, et une coloration fluorescente ainsi que la microscopie fluorescente ou confocale peuvent être utilisées pour détecter l'organisation sarcomérique du cytosquelette dans les cellules musculaires différenciées.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que les cellules musculaires s'alignent dans une seule direction au sein de ces tissus. Cette technique présente également des implications pour les patients souffrant de perte musculaire. Si nous utilisons, par exemple, à l'avenir les cellules du patient lui-même pour fabriquer ces tissus, ceux-ci pourront être utilisés à des fins de transplantation.Cette méthode permet de mieux comprendre le développement musculaire et les lésions musculaires, mais elle offre également des perspectives pour des applications innovantes telles que la médecine régénérative et la culture in vitro de viande. La procédure sera démontrée par arian Methods pour l'isolement et la congélation de mirin. Les cellules progénitrices myoblastes ont été décrites ailleurs.Veuillez consulter le protocole écrit pour obtenir les références complètes. Après avoir retiré le flacon contenant les cellules progénitrices myoblastes de souris de l'azote liquide, placez le flacon dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius pour le décongeler.Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu de croissance réchauffé dans un flacon de culture tissulaire de 25 centimètres carrés recouvert de gel matriciel. Dès que les cellules sont décongelées, ajoutez le contenu du flacon dans le milieu. Incubez les cellules dans le flacon de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Le troisième jour d'incubation, récolter les cellules à l'aide de trypsine, puis les centrifuger à 1000 tr/min. Ensuite, repiquer les cellules dans un flacon de culture tissulaire de 75 cm² revêtu de gel major. Diviser les cellules tous les trois jours, puis, au sixième jour, repiquer les cellules dans un flacon de culture tissulaire de 150 cm² revêtu de gel matri. Au neuvième jour, transférer les cellules du flacon de culture tissulaire de 150 cm² revêtu de gel matri vers un triple flacon de 150 cm² revêtu de gel matri ou vers trois flacons de 150 cm².Le jour 12 d'incubation, les cellules sont prêtes à être ensemencées dans un construct musculaire. Commencez par découper des segments de Velcro d'environ cinq millimètres carrés avec un bord en forme de triangle comme illustré par ce schéma ; seule la face souple du Velcro est utilisée. Préparez ensuite de la colle au silicone en mélangeant l'élastomère avec l'agent de réticulation dans un rapport de 10 à 1.Ensuite, collez deux morceaux de Velcro dans chaque puits d'une plaque de culture à six puits, en laissant environ 12 millimètres entre les morceaux, et laissez sécher toute la nuit. Le jour suivant, stérilisez les puits et le Velcro en ajoutant de l'éthanol à 70 % dans les puits et en incubant pendant 15 minutes. Rincez ensuite les puits trois fois avec du PBS.Laisser le troisième lavage dans les puits et exposer la plaque à la lumière UV pendant 15 minutes. Ensuite, aspirer le PBS et transférer les plaques dans l'incubateur de culture tissulaire jusqu'à utilisation. Préparer une solution de 3,2 milligrammes par millilitre de collagène dans de l'acide acétique stérile à 0,02 %.Placer la solution de collagène sur de la glace, ainsi que la solution de matrigel préalablement décongelée au réfrigérateur. Ensuite, récolter les cellules par trypsination et centrifugation. Puis, resuspendre le culot cellulaire dans le milieu de croissance et effectuer un dénombrement cellulaire selon les procédures standard.Une fois les cellules comptées, placer le tube contenant les cellules dans l'incubateur de culture tissulaire. La solution matricielle est préparée en mélangeant sur de la glace les solutions selon les pourcentages suivants : 51,3 % de solution de collagène 0,2 %, 0,5 molaire d'hydroxyde de sodium, 8,6 % de gel matriciel et 39,9 % de milieu de croissance. Veiller à ce que la solution finale soit de couleur rose, car une augmentation du pH peut entraîner une polymérisation rapide.Le volume final dépend du nombre de puits à ensemencer. Ce tableau indique les volumes pour 10 muscles. Veillez à ce que les cellules soient complètement resuspendues, puis transférez entre 750 000 et 1 250 000 cellules par construct dans un tube centrifuge neuf ; centrifugez à 1000 tr/min pendant cinq minutes, aspirez le surnageant et resuspendez le culot cellulaire dans un petit volume, mais suffisant, du mélange matriciel.Ensuite, une fois que le culot est complètement resuspendu, ajoutez les cellules au volume restant du mélange matriciel. Après avoir récupéré les plaques préchauffées depuis l'incubateur, pipetez entre 0,35 et 0,4 millilitre du mélange cellules-matrice dans chaque morceau de Velcro. Commencez alors à pipeter le mélange depuis le centre, entre les sites d'attachement, et étendez-le vers le Velcro.Enfin, utilisez le reste du gel pour combler l'espace entre les deux attaches Velcro et pipetez autour des morceaux de Velcro. Recouvrez la plaque et laissez-la à température ambiante pendant cinq à dix minutes. Ensuite, tapez doucement sur la boîte et inspectez visuellement pour vérifier si le gel est rigide.Si tel est le cas, les boîtes peuvent être transférées délicatement dans l'incubateur de culture tissulaire. Après une à deux heures dans l'incubateur, recouvrir délicatement chaque gel avec quatre millilitres de milieu de croissance préchauffé. Puis remettre la plaque dans l'incubateur de culture tissulaire.Après 24 heures, remplacez le milieu de croissance par le milieu de différenciation. Renouvelez le milieu tous les deux à trois jours. Des fibres musculaires matures orientées doivent être visibles au septième jour de culture.À ce stade, les fibres peuvent être stimulées électriquement. Commencez par stériliser les électrodes de la plaque d'optique ionique avec de l'éthanol à 70 % pendant 15 minutes, puis séchez-les sous lumière UV pendant 30 minutes. Ensuite, placez les électrodes stérilisées sur la plaque de culture, en veillant à ce qu'elles soient disposées parallèlement au construct musculaire, comme indiqué sur cette image montrant le fond d'une plaque ; les flèches blanches indiquent les électrodes recouvrant la plaque, puis mettez le couvercle en place et transférez le tout dans l'incubateur de culture tissulaire.Connectez le stimulateur des optiques ioniques C avec les câbles appropriés et appliquez ici le protocole de stimulation. Utilisez quatre volts par centimètre, des impulsions de six millisecondes à une fréquence de deux hertz.La stimulation électrique est généralement effectuée pendant une période de 48 heures. Changez le milieu de culture toutes les 24 heures pendant la stimulation. Cette image montre un exemple typique d'un construct musculaire mature.La taille du tissu est d'environ huit millimètres de long, deux millimètres de large et 0,5 millimètre d'épaisseur. Cette image montre un exemple typique d'une cellule progénitrice musculaire dans des tissus musculaires squelettiques ingénierisés. Coupes congelées de muscles bio-artificiels non stimulés ou M bms miroirs.À J8 de la différenciation, les cellules ont été marquées pour l'alpha-actinine sarcomérique, en rouge, la myosine sarcomérique, en verte, et les noyaux, en bleu. Les panneaux à droite sont des agrandissements des zones encadrées. Le protocole peut également être utilisé sur des cellules C2C12.Cette image montre des cellules C2C12 différenciées colorées de la même manière que dans la dernière image. L'alpha-actinine sarcomérique apparaît en rouge. La myosine sarcomérique est en vert, et les noyaux sont en bleu.À nouveau, les panneaux situés à droite sont des agrandissements des zones encadrées. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir l'ensemble sur de la glace. Après cette procédure, d'autres méthodes peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la PCR quantitative pour démontrer des modifications des niveaux d'expression génique après son développement.La technique a ouvert la voie aux chercheurs pour étudier le rôle de la mécanique dans la morphogenèse des tissus. Elle a également contribué à la conception de modèles de muscle cardiaque ingénierisés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer des tissus musculaires ingénierisés en utilisant un support basé sur un hydrogel.

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